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espectroscopias que detectam os níveis atômicos mais internos, como fluorescência de
raios‐X, não forneceriam a informação relevante para o nosso problema.
A absorção no infravermelho tem a alta especificidade molecular desejada, pois é
sensível aos modos vibracionais e constantes de forças entre átomos. Entretanto, como
as energias vibracionais estão em regiões de comprimento de onda muito longo, sua
resolução espacial é pobre. Sem mencionar as dificuldades com janelas, lentes, fontes de
luz intensas e detectores para região acima de 3 µm. A espectroscopia Raman, no
entanto, é capaz de trazer a informação dos modos vibracionais do infravermelho para
a região do visível, com resolução espacial de até 200 nm e para a qual existem
fotomultiplicadoras, CCDs e fotodiodos de avalanche (APDs) supersensíveis. Outra
possibilidade de extrair informações com especificidade química é através da
luminescência, tanto endógena, dos próprios componentes químicos presentes no
microorganismo, quanto exógena, através de marcadores fluorescentes que se ligam a
proteínas ou moléculas específicas.
Além da capacidade de acompanhar a bioquímica no nível microscópico também
desejamos ter a capacidade de microscopia com seletividade química, isto é, obter uma
imagem em 2 e/ou 3 dimensões das regiões em que determinada substância está
presente. Também desejaríamos obter essas imagens em tempo real, ou seja, ser capazes
de acompanhar processos bioquímicos no tempo e no espaço.
Nesse aspecto houve uma grande avanço nas duas últimas décadas com o
desenvolvimento das microscopias confocais de varredura a laser, nas quais se
reconstrói uma imagem através da fluorescência de um fluoróforo em função da
posição do foco do laser. O advento de lasers de pulsos ultracurtos comerciais de fácil
manuseio na década de 90, principalmente Ti:Safira, abriu a oportunidade para técnicas
de óptica não linear, ou processos de mais de um fóton, como a microscopia multifóton
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