Yonne Francis Chehuan Melo - uea - pós graduação
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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS - UEA<br />
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS - FMTAM<br />
MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS<br />
AVALIAÇÃO in vitro DA SENSIBILIDADE DO<br />
Plasmodium falciparum AOS ANTIMALÁRICOS, PELO ELISA COM<br />
CAPTAÇÃO DA PROTEINA 2 RICA EM HISTIDINA<br />
YONNE FRANCIS CHEHUAN MELO<br />
MANAUS<br />
2005
ii<br />
YONNE FRANCIS CHEHUAN MELO<br />
AVALIAÇÃO in vitro DA SENSIBILIDADE DO<br />
Plasmodium falciparum AOS ANTIMALÁRICOS, PELO ELISA COM<br />
CAPTAÇÃO DA PROTEINA 2 RICA EM HISTIDINA<br />
Dissertação apresentada ao Programa<br />
de Pós Graduação em Medicina<br />
Tropical da Universidade do Estado do<br />
Amazonas em convênio com a Fundação<br />
de Medicina Tropical do Amazonas,<br />
como requisito para obtenção do título<br />
de Mestre em Doenças Tropicais e<br />
Infecciosas.<br />
Orientadora: Profª Dra. Maria das Graças Costa Alecrim<br />
Co-orientadores: Profª Dra. Maria das Graças Barbosa<br />
Prof º MSc. Wilson Duarte Alecrim<br />
MANAUS<br />
2005
CHEHUAN, <strong>Yonne</strong> <strong>Francis</strong><br />
Avaliação in vitro da sensibilidade do Plasmodium falciparum aos antimaláricos pelo<br />
ELISA pela captação da Proteína 2 Rica em Histidina / <strong>Yonne</strong> <strong>Francis</strong> <strong>Chehuan</strong> - Manaus -<br />
AM; Universidade do Estado do Amazonas, 2005. 88 p.<br />
Dissertação de Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas.<br />
1. Malária 2. P. falciparum 3. ELISA 4. Proteína Rica em Histidina 5. In vitro 6. Quinino 7.<br />
Mefloquina I. Titulo
iii<br />
FOLHA DE JULGAMENTO<br />
AVALIAÇÃO in vitro DA SENSIBILIDADE DO<br />
Plasmodium falciparum AOS ANTIMALÁRICOS, PELO ELISA<br />
COM CAPTAÇÃO DA PROTEINA 2 RICA EM HISTIDINA<br />
YONNE FRANCIS CHEHUAN MELO<br />
“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em<br />
Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa<br />
de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do<br />
Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas.”<br />
Banca Julgadora:<br />
______________________________________<br />
Profª. Maria das Graças Costa Alecrim, Dra.<br />
Presidente<br />
______________________________________<br />
Profª. Ivete de Araújo Roland, Dra.<br />
______________________________________<br />
Profª. Marinete Marins Póvoa, Dra.
iv<br />
DEDICATÓRIA<br />
Aos meus pais (in memorium)<br />
Mansour <strong>Francis</strong> <strong>Chehuan</strong><br />
e<br />
Julia Abrahim <strong>Chehuan</strong><br />
Seus exemplos, dedicação e amor, são os meus alicerces e<br />
guia para não me desviar dos caminhos que me ensinaram<br />
como percorrer com simplicidade, ética e respeito ao<br />
próximo.<br />
Aos meus amados filhos Dessana e Tigran pela compreensão dos<br />
inúmeros momentos de ausência e sacrifício em nosso convívio<br />
diário.<br />
Ao meu esposo Henrique pelo seu carinho e estimulo sempre<br />
presente nos momentos mais árduos.<br />
Não existem palavras que expressem a gratidão e o amor que<br />
sinto por vocês. Espero ser sempre motivo de orgulho e alegria.<br />
Dedico-lhes esta conquista com gratidão.
v<br />
Mais do que julgar, o importante é ensinar com amor,<br />
mostrando que sempre é possível seguir adiante.<br />
(Autor desconhecido)<br />
O mundo amazônico não poderá ficar isolado ou alheio ao<br />
desenvolvimento brasileiro e internacional, porém ele terá que se<br />
auto-sustentar em quatro parâmetros e paradigmas fundamentais:<br />
deve ser economicamente viável, ecologicamente adequado,<br />
politicamente equilibrado e socialmente justo.<br />
Prof. Samuel Benchimol
vi<br />
AGRADECIMENTOS<br />
A conquista para ser plenamente vitoriosa deve ser compartilhada.<br />
Assim, com o cuidado que merece de não cometermos o descuido da omissão,<br />
reverenciamos com profunda gratidão a todas as pessoas e Instituições,<br />
indistintamente, que de maneira direta ou indireta foram agentes incentivadores<br />
para a realização desta Dissertação de Mestrado, sem os quais teria sido difícil<br />
desenvolve-la. De modo particular a:<br />
Deus não escolhe os capacitados, capacita os escolhidos.<br />
Agradeço, por Sua infinita benção em minha vida.<br />
A Profª Dra Maria das Graças Costa Alecrim pela orientação e ao Professor<br />
Wilson Duarte Alecrim pela co-orientação com os quais iniciei o aprendizado da<br />
pesquisa, pelo incentivo e apoio para a concretização deste estudo.<br />
Aos meus queridos irmãos Naylê, Neydelê, Yvone, <strong>Francis</strong> e Iman<br />
sempre presentes apoiando e incentivando a conquista da vitória<br />
independente dos obstáculos; amo todos vocês.<br />
A minha co-orientadora Profª Dra Maria das Graças Barbosa, pela orientação, apoio,<br />
confiança, estimulo e paciência para a conclusão desta jornada, tantas vezes difícil.<br />
Ao Marcus Vinícius Lacerda o meu reconhecimento e sincera gratidão pelo<br />
apoio e orientação para a conclusão deste estudo.<br />
À Gerente de Malária da FMTAM MSc Mônica Regina Farias Costa Manso,<br />
pela compreensão para a conclusão deste trabalho.<br />
À Ana Ruth Lima Arcanjo, Márcia Almeida de Araújo e Flor Ernestina Martinez<br />
amigas certas das horas incertas nesta conquista.<br />
Ao mestrando Franklin Simões Santana Filho, companheiro de lutas e ideais,<br />
muito obrigado pela amizade, apoio, solidariedade, incentivo e<br />
paciência ao longo desta trajetória.<br />
A Eva Batista Carvalho pelo incentivo amigo.<br />
À técnica Maria José Siqueira e as bolsistas Glenda Janaína de Souza Oliveira,<br />
Dácia Sarina de Azevedo Parente e Danielly de Alencar Arruda Almeida pela<br />
contribuição valiosa na execução deste estudo.<br />
Aos funcionários, Raimunda Ericilda de Araújo, Marly Marques, Rosemary Santos,<br />
Eckner Falcão e Laurendina Pereira Batalha, pelo apoio e colaboração<br />
constante.
vii<br />
Aos funcionários da Gerência de Malária da FMTAM pelo convívio diário amistoso<br />
e apoio administrativo. Aos microscopistas pela contribuição no diagnóstico<br />
dos portadores de malária falciparum incluídos neste estudo.<br />
Ao Dr. Pedro Paulo Vieira,, MSc Michele de Souza Bastos e a Bioquímica Eliete<br />
Pereira de Azevedo pelo apoio durante a execução deste trabalho e<br />
colaboração na execução dos testes.<br />
Ao Gerente de Informática da FMTAM, Marco Antonio Sabóia pela<br />
competência e prestimosa colaboração prestada.<br />
A Profª Dra Marinete Marins Póvoa agradeço a amizade, o apoio, o incentivo, os<br />
ensinamentos e a oportunidade de compartilhar e aprimorar os meus<br />
conhecimentos e experiência profissional.<br />
Ao Prof Dr Álvaro Augusto Ribeiro D’Almeida Couto que concedeu gentilmente<br />
um exemplar da sua Tese de Doutorado, o meu especial agradecimento.<br />
Ao Dr. Leonardo Carvalho do Laboratório de Pesquisa em Malária da FIOCRUZ<br />
que à distância reservou espaço nos seus compromissos para compartilhar<br />
seus conhecimentos técnicos com importantes sugestões nos momentos<br />
críticos, meu agradecimento pela atenção e o apoio.<br />
À Universidade do Estado do Amazonas pela criação do Curso de<br />
Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas.<br />
Aos professores, colegas de curso e as funcionárias Maria da Conceição dos Santos<br />
Tufic e Luzanira Araújo da Silva do Curso de Mestrado em Doenças Tropicais e<br />
Infecciosas, pelo apoio e solidariedade.<br />
À Fundação de Medicina Tropical do Amazonas pela oportunidade<br />
concedida para o aprimoramento do conhecimento.<br />
A Superintendência da Zona Franca de Manaus e Ministério da Saúde do<br />
Brasil como fontes financiadoras deste estudo.<br />
A Fundação de Apoio Institucional MURAKI, pelo suporte na<br />
compra dos insumos para a realização deste estudo.<br />
Aos amigos que à distância me acompanharam, auxiliaram e orientaram para<br />
a conclusão desta jornada, o meu reconhecimento e gratidão.<br />
A cada um dos pacientes de malária que foram imprescindíveis para o<br />
desenvolvimento deste estudo, mais que agradecimento, meu respeito.<br />
Ao Ministério da Saúde (Secretaria de Vigilância em Saúde/GerênciaTécnica de<br />
Malária) e a Organização Pan-Americana da Saúde que através RAVREDA<br />
deram suporte técnico-financeiro e confiança para o desenvolvimento deste<br />
estudo proporcionando o aprimoramento da minha formação como<br />
pesquisadora.
viii<br />
RESUMO<br />
Os rápidos e progressivos mecanismos que os plasmódios desenvolvem<br />
para subterfugir aos efeitos dos quimioterápicos têm se tornado o principal<br />
agravante no controle da malária no Brasil e no mundo. A expansão da<br />
resistência do plasmódio aos antimaláricos dimensiona a magnitude e<br />
gravidade do problema, frente à limitação da ausência de uma vacina<br />
antimalárica, tornando cada vez mais importante, iminente e indispensável<br />
como fonte de dados para a vigilância de droga-resistência, o desenvolvimento<br />
e aplicação in vitro de métodos simples e confiáveis, particularmente sob<br />
condições de campo. Como parte do protocolo multicêntrico da Rede<br />
Amazônica de Vigilância da Resistência às Drogas Antimaláricas (RAVREDA),<br />
executou-se um estudo para avaliação do desempenho do método ELISA<br />
baseado na quantificação da Proteína 2 Rica em Histidina (HRP2) na<br />
estimativa da sensibilidade com isolados frescos do Plasmodium falciparum às<br />
drogas antimaláricas em análise de correlação dos resultados com os obtidos<br />
pelo método da maturação de esquizontes (microteste/OMS), em um<br />
laboratório de referência, na cidade de Manaus. Os 35 isolados frescos de P.<br />
falciparum testados com sucesso pelo ELISA HRP2 e analisados em função da<br />
concentração da inibição 50% (IC 50 ) com o intervalo de confiança 95% foram<br />
de 225,19 nM (IC95%: 182,24 – 268,14 nM) e 40,03 nM (IC95% 32,54 – 47,52<br />
nM) ao quinino e à mefloquina, respectivamente Os resultados mostraram uma<br />
associação fortemente significante com aqueles obtidos com o teste padrão de<br />
maturação de esquizontes da Organização Mundial da Saúde (OMS) (R=0,977;<br />
p
ix<br />
ABSTRACT<br />
The Plasmodium resistance to the antimalarials is becoming the major<br />
problem for the malaria control in Brazil and worldwide. With the increase of the<br />
resistance to antimalarials, of single and reliable methods for in vitro continuous<br />
studies of the Plasmodium sensitivity to antimalarial drugs, as data source for<br />
the surveillance of drug resistance is a need. As part of the multicenter activities<br />
of the Amazon Network of Surveillance of Resistance to Antimalarial Drugs<br />
(RAVREDA), an experimental study was performed in order to evaluate the<br />
sensitivity to antimalarials using the ELISA test based on the quantification of<br />
the Histidine-rich Protein 2 (HRP2) with fresh isolates of Plasmodium<br />
falciparum, in a laboratory of reference, in the Manaus city. The 35 fresh<br />
isolates of P. falciparum tested with success disclosed inhibitory concentration<br />
at 50% (IC50) of 225.19 nM and 40.03 nM, to quinine and mefloquine,<br />
respectively. The results showed a highly significant association with those<br />
obtained with the standard test of maturation of schizonts from the World Health<br />
Organization (WHO) for quinine (R=0.977; p
x<br />
LISTA DE FIGURAS E TABELAS<br />
FIGURA 1 Quimioterapia da malária 22<br />
FIGURA 2 Representação estrutural das quinolinas-metanóis 4<br />
FIGURA 3 Ciclo biológico do P. falciparum 26<br />
FIGURA 4<br />
Princípio do método imunoenzimático da quantificação da<br />
PfHRP2 41<br />
FIGURA 5 Setores da Gerência de Malária FMTAM 45<br />
FIGURA 6 Concentração das drogas quinino e mefloquina nas microplacas 48<br />
FIGURA 7 Preparação do sangue e teste de sensibilidade in vitro do P.<br />
falciparum 50<br />
FIGURA 8 Técnica ELISA PfHRP2 54<br />
FIGURA 9 Distribuição dos pacientes segundo sexo a faixa etária 56<br />
FIGURA 10 Distribuição dos 59 participantes do estudo por local provável de<br />
infecção<br />
57<br />
FIGURA 11 Distribuição dos 32 participantes do estudo por local provável de<br />
infecção no município de Manaus 58<br />
FIGURA 12 Microteste (OMS): a) Trofozoítos pela gota espessa; b)<br />
Trofozoítos e pré-esquizontes cultura; c e d) esquizontes com três<br />
ou mais cromatinas 59<br />
FIGURA 13 Distribuição dos resultados das culturas de P. falciparum a<strong>pós</strong> o<br />
período de incubação 60<br />
FIGURA 14 Resultados dos 39 Microteste (OMS) relação de maturação de<br />
esquizontes e inibição do crescimento sob as diversas<br />
concentrações do quinino 62<br />
FIGURA 15 Resultados dos 39 Microteste (OMS) relação de maturação de<br />
esquizontes e inibição do crescimento sob as diversas<br />
concentrações da mefloquina 63<br />
FIGURA 16 Resultados dos 35 Microteste (OMS) relação de maturação de
xi<br />
esquizontes e inibição do crescimento sob as diversas<br />
concentrações do quinino 65<br />
FIGURA 17 Resultados dos 35 Microteste (OMS) relação de maturação de<br />
esquizontes e inibição do crescimento sob as diversas<br />
concentrações da mefloquina<br />
65<br />
FIGURA 18 Média do IC50 nos 35 testes concordantes da sensibilidade do<br />
P. falciparum às drogas quinino e mefloquina pelo ELISA HRP2 66<br />
FIGURA 19 Média do IC50 nos 35 testes concordantes da sensibilidade do<br />
P. falciparum às drogas quinino e mefloquina pelo Microteste<br />
(OMS)<br />
67<br />
FIGURA 20 Análise de correlação do IC50 do quinino determinado pelos<br />
métodos de ELISA HRP2 e Microteste (OMS) 68<br />
FIGURA 21 Análise de correlação do IC50 da mefloquina determinado pelos<br />
métodos de ELISA HRP2 e Microteste (OMS) 68<br />
TABELA 1 Classificação da resistência in vivo do P. falciparum às drogas 34<br />
TABELA 2 Concentrações das drogas in vitro para aos níveis de<br />
TABELA 3<br />
sensibilidade/ resistência<br />
Concordância dos resultados entre os métodos Microteste (OMS)<br />
e ELISA HRP2<br />
TABELA 4 Avaliação dos 39 isolados pela (CMI%) e IC50 do P.<br />
falciparum ao quinino (QN) e mefloquina (MF) pelo microteste<br />
(OMS)<br />
52<br />
61<br />
64
xii<br />
LISTA DE ABREVIAÇÕES<br />
Ag-Ac<br />
Antígeno/anticorpo<br />
AP<br />
Amapá<br />
APAD<br />
Acetil Piridina Adenina Dinucleotídeo<br />
cm<br />
Centímetro<br />
CMI<br />
Concentração Mínima Inibitória<br />
CO 2<br />
Gás Carbônico<br />
Cut-off<br />
Ponto de corte<br />
D0<br />
Dia zero<br />
D28 Dia 28<br />
DDT<br />
Dicloro-difenil-tricloroetano<br />
DHFR<br />
Dihidrofolato-redutase<br />
DNA<br />
Ácido desoxirribonucléico<br />
DO<br />
Densidade ótica<br />
EDTA<br />
Ácido etileno-diamino-tetracético<br />
EGCM<br />
Estratégia Global para o Controle da Malária<br />
ELISA<br />
Enzyme-linked immunosorbent<br />
FMTAM<br />
Fundação de Medicina Tropical do Amazonas<br />
FNS/ FUNASA<br />
Fundação Nacional de Saúde<br />
HRP2/ PfHRP2 Proteína 2 Rica em Histidina<br />
IC50<br />
Concentração inibitória 50% do crescimento<br />
IC90<br />
Concentração inibitória 90% do crescimento<br />
IC95 Intervalo de confiança 95%<br />
L<br />
Litro<br />
LDH<br />
Lactado desidrogedonase humano<br />
MF<br />
Mefloquina<br />
mg<br />
Miligrama<br />
mL<br />
mililitro<br />
MS<br />
Ministério da Saúde do Brasil<br />
N 2<br />
NAD<br />
NaHCO3<br />
nM<br />
Nitrogênio<br />
Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo<br />
Bicarbonato de sódio<br />
Nanomolar
xiii<br />
O 2<br />
OMS/WHO<br />
OPS/PAHO<br />
Oxigênio<br />
Organização Mundial de Saúde<br />
Organização Pan-Americana da Saúde<br />
P. falciparum Plasmodium falciparum<br />
P. malariae Plasmodium malariae<br />
P. ovale Plasmodium ovale<br />
P. vivax Plasmodium vivax<br />
PA<br />
Pará<br />
Pfcrt Plasmodium falciparum chloroquine resistance-related<br />
transporter<br />
Pfdhfr<br />
Plasmodium falciparum<br />
Pfdhps Plasmodium falciparum<br />
Pfmdr I<br />
Plasmodium falciparum multi-drug resistance gene I<br />
PIACM<br />
Plano de Intensificação das Ações de Controle da Malária<br />
pLDH<br />
Lactado desidrogedonase Parasito<br />
PM<br />
Peso molecular<br />
pmol<br />
Picomol<br />
PNCM<br />
Programa Nacional de Controle da Malária<br />
QN<br />
Quinino<br />
RAVREDA Rede Amazônica de Vigilância da Resistência às Drogas<br />
Antimaláricas<br />
RI, II e III Resistência in vivo tipo I, II e III<br />
RNA<br />
Ácido ribonucléico<br />
RPMI<br />
Roswell Park Memorial Institute<br />
S<br />
Sensível<br />
SP<br />
Sulfadoxina+pirimetramina<br />
SUCAM<br />
Superintendência de Campanhas de Saúde Pública<br />
SUFRAMA Superintendência da Zona Franca de Manaus<br />
SVS<br />
Secretaria de Vigilância em Saúde<br />
TA<br />
Temperatura ambiente<br />
USAID<br />
United States Agency for International Development<br />
μg/mL<br />
Micrograma<br />
°C Graus Celsius<br />
µL Microlitro
xiv<br />
SUMÁRIO<br />
1. INTRODUÇÃO 1<br />
1.1 ASPECTOS GERAIS 1<br />
1.2 ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS 4<br />
1.3 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS E EPIDEMIOLÓGICAS 6<br />
1.3.1 Vetor 6<br />
1.3.2 Agente etiológico 6<br />
1.3.3 Ciclo biológico do plasmódio 7<br />
1.4 CARACTERÍSTICAS DAS DROGAS ANTIMALÁRICAS 8<br />
1.5 RESISTÊNCIA DO P. FALCIPARUM AOS ANTIMALÁRICOS 12<br />
1.6 HISTÓRIA DA RESISTÊNCIA DO P. FALCIPARUM 15<br />
1.7 MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DE RESISTÊNCIA AOS ANTIMALÁRICOS 18<br />
1.8 TESTES IN VITRO 21<br />
2. OBJETIVOS 29<br />
3. MATERIAL E MÉTODOS 30<br />
3.1 MODELO DO ESTUDO 30<br />
3.2 LOCAL DO ESTUDO 30<br />
3.3 POPULAÇÃO ESTUDADA 30<br />
3.4 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO 32<br />
3.5 ASPECTOS ÉTICOS 32<br />
3.6 RECURSOS FINANCEIROS 33<br />
3.7 PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS 33<br />
3.7.1 PLACAS PRÉ-DOSADAS DE DROGAS QUININO E MEFLOQUINA 33<br />
3.7.2 COLETA E PREPARAÇÃO DO SANGUE 34<br />
3.7.3 CULTURA E TESTE DE SENSIBILIDADE DO P. FALCIPARUM ÀS<br />
DROGAS ANTIMALÁRICAS (MICROTESTE/OMS)<br />
3.7.4 TESTE IN VITRO DE SENSIBILIDADE DO P. FALCIPARUM PELA<br />
QUANTIFICAÇÃO DA PROTEINA 2 RICA EM HISTIDINA (PFHRP2) PELO<br />
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO – ELISA<br />
35<br />
38
xv<br />
3.8 ANÁLISES ESTATISTICAS 41<br />
4. RESULTADOS 42<br />
4.1 DADOS EPIDEMIOLÓGICOS 42<br />
4.2 CONSIDERAÇÕES SOBRE AS TÉCNICAS 44<br />
4.3 COMPARAÇÃO ENTRE AS TÉCNICAS 46<br />
5. DISCUSSÃO 56<br />
5.1 DADOS EPIDEMIOLÓGICOS 56<br />
5.2 CONSIDERAÇÕES SOBRE AS TÉCNICAS 58<br />
5.3 COMPARAÇÃO ENTRE AS TÉCNICAS 59<br />
5.4 LIMIAR DE SENSIBILIDADE/RESISTÊNCIA DO P FALCIPARUM ÀS DROGAS<br />
ANTIMALÁRICAS<br />
5.5 AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DO P. FALCIPARUM ÀS DROGAS<br />
QUINOLINAS-METANOIS<br />
62<br />
64<br />
6. CONCLUSÃO 73<br />
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 74<br />
8. ANEXOS 88
1<br />
1 INTRODUÇÃO<br />
1.1 Aspectos gerais<br />
A malária apesar de ser uma doença que tem sua história intrinsecamente<br />
relacionada com a própria história da humanidade, continua sendo ainda hoje um<br />
grande obstáculo ao desenvolvimento socioeconômico e político nos países tropicais<br />
e subtropicais, não obstante os resultados alcançados pelos programas de controle<br />
que reduziram sua extensão geográfica ou sua incidência em muitas áreas<br />
(PAHO/WHO, 1997).<br />
Segundo Bruce-Chwatt (1985), o número expressivo de baixas provocadas<br />
pela malária durante a Primeira Guerra Mundial motivou principalmente na Europa o<br />
desenvolvimento de pesquisas que objetivavam encontrar medidas eficazes para o<br />
combate e controle da doença, que teve na cloroquina e no DDT (dicloro-difeniltricloroetano)<br />
importantes resultados. Em 1955, a Organização Mundial de Saúde<br />
(OMS), diante dos resultados promissores, elaborou um conjunto de medidas<br />
visando à erradicação da malária no mundo (NAJERA, 1989). Todavia, ao longo das<br />
últimas décadas, a malária vem reaparecendo ou se intensificando em regiões no<br />
mundo, conseqüência do surgimento e dispersão de parasitos resistentes às drogas<br />
antimaláricas e de mosquitos resistentes aos inseticidas, associados à<br />
desestruturação dos programas de controle da malária resultado das dificuldades<br />
sociais, políticas e econômicas (TRIGG e KONDRACHINE, 1998; GREENWOOD e<br />
MUTABINGWA, 2002).<br />
A doença foi erradicada da Europa e América do Norte, contudo permanece<br />
como grave problema de Saúde Pública nos países em desenvolvimento pelos
2<br />
fatores condicionantes e determinantes relacionados à população suscetível, ao<br />
agente etiológico e ao vetor, associados às condições ecológicas, geográficas,<br />
econômicas, sociais e culturais.<br />
A mais recente intervenção para o controle da malária no Brasil foi em 2000,<br />
com a implantação do Plano de Intensificação das Ações de Controle da Malária<br />
(PIACM) na Região Amazônica, pelo Ministério da Saúde (MS), em parceria com<br />
estados e municípios com os objetivos de reduzir a incidência, evitar o surgimento<br />
de epidemias localizadas, reduzir a gravidade da doença e, conseqüentemente, o<br />
número de internações e óbitos. Dentre outras, as estratégias estavam centradas<br />
nos seguintes pontos: a) estruturação dos sistemas locais de saúde; b) diagnóstico e<br />
tratamento precoce; c) intervenções seletivas para o controle vetorial; d)<br />
aprimoramento e agilização do sistema de informação; e) detecção imediata de<br />
epidemias; f) capacitação de recursos humanos; g) monitoramento da resistência às<br />
drogas e inseticidas (BRASIL/MS/SVS, 2005).<br />
Empenhado em estabelecer uma política permanente para a prevenção e o<br />
controle dessa endemia, e consolidar o processo de descentralização, inclusive na<br />
região extra-amazônica, o Ministério da Saúde editou, em 2003, o Programa<br />
Nacional de Controle da Malária (PNCM) pactuado com os governos estaduais e<br />
municipais, em parceria com a sociedade organizada, a fim de executar as<br />
atividades necessárias ao controle da doença, dando continuidade aos avanços já<br />
proporcionados pelo PIACM (BRASIL/MS/SVS, 2003).<br />
Em 2001, foi criado a Rede Amazônica de Vigilância da Resistência às<br />
Drogas Antimaláricas (RAVREDA), para subsidiar a política de medicamentos, com
3<br />
a execução de um sistema de vigilância de fármaco-resistência aos antimaláricos em<br />
toda Região Amazônica, com pro<strong>pós</strong>ito de efetivar as ações de controle. Fazem<br />
parte da rede amazônica os oito países que compõem a Bacia Amazônica Sul<br />
Americana. O Projeto é coordenado pela Organização Pan-americana da Saúde<br />
(OPS) e OMS, apoiado com recurso da United States Agency for International<br />
Development (USAID).<br />
No Brasil, a gestão e gerenciamento da RAVREDA pela Secretaria de<br />
Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde, com a participação dos Centros<br />
Colaboradores instalados em sete dos nove, estados da Amazônia Legal (divisão<br />
política do território nacional que engloba os Estados: Amazonas, Pará, Acre,<br />
Roraima, Rondônia, Amapá, Tocantins e Maranhão), estão realizando estudos de<br />
resposta terapêutica dos esquemas de primeira linha preconizados pelo PNCM/MS<br />
de adesão do paciente ao tratamento para malária, controle de qualidade dos<br />
medicamentos, sensibilidade e estabilidade de testes de diagnostico rápido e<br />
estudos in vitro de avaliação da suscetibilidade aos antimaláricos (MANGABEIRA e<br />
MONTOYA, 2004; BRASIL/MS/SVS, 2005).<br />
A resistência do plasmódio às drogas antimaláricas tem se tornado o principal<br />
agravante no controle da malária no Brasil e no mundo. Os rápidos e progressivos<br />
mecanismos que os plasmódios desenvolvem para subterfugir aos efeitos dos<br />
quimioterápicos dimensionam a magnitude e gravidade do problema. Frente à<br />
limitação da ausência de uma vacina antimalárica, o controle da malária depende<br />
quase exclusivamente da quimioterapia que é ofertada gratuitamente à população e<br />
do controle de vetores.
4<br />
1.2 Aspectos Epidemiológicos<br />
A malária configura-se como a antropozoonose de maior prevalência<br />
no mundo. A doença é endêmica em 107 países, com aproximadamente 3,2 bilhões<br />
de pessoas expostas ao risco de infecção. Nas Américas, cerca de 36% da<br />
população vivem em áreas favoráveis à transmissão da doença.<br />
Estima-se que anualmente entre 350 a 500 milhões pessoas adquirem<br />
malária com mais de um milhão de mortes no mundo, principalmente crianças, ao<br />
lado das infecções respiratórias e diarréicas, figura como uma das principais causas<br />
de mortalidade no mundo. Na África sub-Saárica são registrados 60% de todos os<br />
casos de malária do mundo, o restante está distribuído por regiões da Ásia, América<br />
do Sul e Oceania (PAHO/WHO, 2001; TAYLOR-ROBINSON, 2002; WHO, 2002a;<br />
OMS e UNICEF, 2005a).<br />
Em 2002, o Brasil contribuiu com aproximadamente 40% do número total dos<br />
casos de malária nas Américas. Mais de 99% dos casos diagnosticados pelo exame<br />
parasitoscópico ocorreram na Amazônia Legal, onde residem cerca de 12% da<br />
população de país. Destacaram-se pela intensidade de transmissão os Estados do<br />
Pará, Amazonas e Rondônia, responsáveis por 88% dos casos relatados (OMS e<br />
UNICEF, 2005a).<br />
No Brasil, no início da década de 70, a malária apresentava sinais de<br />
controle, com 66.689 casos registrados em 1974. A partir de 1975, houve um<br />
aumento progressivo, registrando-se em 1989 577.520 casos (BRASIL/MS/SUCAM,<br />
1989). Comparando os 459.013 casos notificados na Amazônia Legal no ano de
5<br />
2004, em relação aos 635.646 em 1999; observa-se resultado positivo com uma<br />
redução da doença, atribuída à política de intensificação das ações do controle da<br />
malária do Ministério da Saúde em parceria com estados e municípios<br />
(BRASIL/MS/SVS, 2005).<br />
A elevação da ocorrência da doença nas décadas de 70 e 80 no Brasil estava<br />
relacionada a diversos fatores, com uma forte influência do movimento migratório<br />
movido por projetos desenvolvimentistas na ocupação de grandes espaços da<br />
Amazônia. Destacam-se as grandes invasões nas áreas periurbanas das cidades de<br />
Manaus e Porto Velho, ocasionando uma ocupação espacial desordenada, e ainda<br />
associada às alterações ambientais com a construção de estradas e hidrelétricas,<br />
extração de madeira e minérios, assim como as precárias condições de infraestrutura<br />
e socioeconômicas da população migrante não imune (MARQUES e<br />
PINHEIRO, 1982; SAWYER, 1986; TAUIL, 1986; BRASIL/FUNASA, 2000).<br />
O ecossistema característico da Amazônia, com alto índice pluviométrico,<br />
uma ampla malha hídrica e a densa vegetação, aliados aos fatores sociais e<br />
ambientais citados, favorecem a proliferação do vetor e a exposição de grande<br />
quantidade de pessoas à doença.<br />
No Estado do Amazonas, a malária tem se comportado com períodos<br />
variáveis e nos últimos anos, ascendente, com 70.223 casos diagnosticados em<br />
2002 e 140.642 casos em 2003, representando um acréscimo de 100% em relação<br />
ao ano anterior e continuando a aumentar em 2004, com 146.296 casos e 100.567
6<br />
até junho de 2005, com um aumento de 35,7% comparado ao mesmo período do<br />
ano anterior (BRASIL/MS/SVS, 2005; FMTAM, 2005).<br />
É importante considerar no agravamento progressivo da malária como<br />
problema de Saúde Pública os seguintes fatores: a) resistência do vetor aos<br />
inseticidas; b) hospedeiro; c) parasitos; d) meio ambiente; e) quimioterapia<br />
antimalárica. Os notáveis avanços científicos nas áreas do diagnóstico, tratamento,<br />
fisiopatologia, imunologia, biologia molecular e inúmera constatações<br />
epidemiológicas não refletiram um melhor paralelo com o controle da endemia ao<br />
longo desses anos (WONGSRICHANALAI et al., 2002; RIGBY et al., 2002).<br />
1.3 Características Clínicas e Epidemiológicas<br />
1.3.1 Vetor - Os transmissores da malária aos mamíferos são insetos da<br />
ordem dos dípteros, da família Culicidae do gênero Anopheles. No Brasil, as<br />
espécies de vetores em potencial são: A. darlingi, A. aquasalis, espécies do<br />
complexo A. albitarsis, A. cruzii e A. bellator. O A. darlingi destaca-se pela sua<br />
importância epidemiológica, particularmente na região da Amazônia Brasileira, pelo<br />
seu hábito antropofílico e endofílico, e a elevada suscetibilidade à infecção<br />
plasmodial (TADEI e DURATY THATCHER, 2000; BRASIL/MS/FUNASA, 2002).<br />
1.3.2 Agente etiológico - Os parasitos causadores da malária fazem parte do<br />
Filo Apicomplexa, Ordem Eucoccidiidae, Subordem Haemosporinae, Família<br />
Plasmodiidae, Gênero Plasmodium.
7<br />
A malária humana é causada por uma ou mais das quatro espécies de<br />
protozoários esporozoários intracelulares do gênero Plasmodium. Segundo<br />
Garnham e Duggan (1986) essas espécies são: Plasmodium malariae (Laveran,<br />
1881), Plasmodium vivax (Grassi e Feletti, 1890), Plasmodium falciparum, (Welch,<br />
1897) e Plasmodium ovale (Stephens, 1922).<br />
No Brasil, destaca-se com maior importância epidemiológica o P. vivax e o P.<br />
falciparum. Embora com baixa letalidade, o P. vivax constitui importante causa de<br />
morbidade e é responsável por grande número de recaídas nas regiões endêmicas.<br />
O P. falciparum é a espécie responsável pela maioria dos casos graves e óbitos,<br />
além de desenvolver com maior freqüência resistência às drogas usadas no<br />
tratamento da malária (WHO, 2001b; BANNISTER e MITCHELL, 2003).<br />
1.3.3 Ciclo biológico do plasmódio - O ciclo evolutivo dos plasmódios da<br />
malária se caracteriza por apresentar duas fases distintas de reprodução:<br />
a) Sexuada do tipo esporogonia, que se passa no hospedeiro invertebrado –<br />
ocorre na fêmea do mosquito anofelino a<strong>pós</strong> o repasto sangüíneo; os eventuais<br />
gametas existentes no estômago do mosquito se unem formando o ovo ou o zigoto<br />
e, por esporogonia, formam-se os esporozoítos, que são inoculados por hematofagia<br />
no homem.<br />
b) Assexuada do tipo esquizogonia, que ocorre no hospedeiro vertebrado – o<br />
homem - inicia quando esporozoítos infectantes são inoculados no homem pelo<br />
vetor; a<strong>pós</strong> um curto período na circulação sangüínea (30-60 minutos), alojam-se<br />
nos hepatócitos onde, por esquizogonia tissular, formam merozoítos, que são<br />
lançados na circulação e vão invadir os eritrócitos; reproduz-se por esquizogonia,<br />
formando novos merozoítos e, por ruptura das células sangüíneas, ao final do ciclo,
8<br />
se libertam para em seguida invadir novos eritrócitos, reiniciando o ciclo. Depois de<br />
algumas gerações de merozoítos sangüíneos, algumas formas se diferenciam em<br />
estágios sexuados (os gametócitos) que não mais se dividem e continuarão os seus<br />
desenvolvimentos nos mosquitos vetores. A esquizogonia sangüínea se repete em<br />
intervalos regulares para cada espécie: a cada 48 horas, nas infecções pelo P.<br />
falciparum e P. vivax, e a cada 72 horas nas infecções por P. malariae (NEVES,<br />
1979; SOUZA et al., 1997).<br />
1.4 Características das Drogas Antimaláricas<br />
A eficácia de um agente terapêutico no tratamento da malária depende da<br />
interação de três fatores: humano (imunidade), do parasito (resistência à droga) e da<br />
farmacocinética (variação individual). A quimioterapia adequada e oportuna da<br />
malária é hoje fundamental no controle da doença. Tão importante quanto é o<br />
conhecimento das características químicas e farmacológicas dos antimaláricos é o<br />
entendimento das propriedades farmacocinéticas, eficácia, grau de tolerância e a<br />
capacidade de induzir os efeitos tóxicos do parasito (PAGE et al., 1999) (Figura 1).<br />
Imunidade<br />
Humano<br />
(DNA)<br />
Farmacocinética<br />
Farmacogenética<br />
(Efeitos adversos)<br />
Parasito<br />
(DNA)<br />
Droga<br />
Farmacodinâmica<br />
(Resistência à droga)<br />
Figura 1: Quimioterapia da malária
9<br />
Os antimaláricos podem ser classificados de acordo com as<br />
características químicas, farmacológicas, locais de ação no ciclo biológico do<br />
parasito, entre outras. Dois grandes grupos de drogas têm sido muito utilizados no<br />
tratamento da malária: os alcalóides, que são substâncias encontradas em alguns<br />
grupos vegetais, em geral nitrogenados, heterocíclicos, com pronunciada ação sobre<br />
os animais, e os antifolatos que agem sobre a síntese do DNA, representados pelos<br />
inibidores da dihidrofolato-redutase (DHFR) e as sulfas.<br />
As drogas antimaláricas podem ser classificadas pelo grupo químico e de<br />
acordo com o local de ação no ciclo do parasito (RANG e DALE, 1993; PAGE et al.,<br />
1999; BRASIL/MS/FNS, 2001) e os principais em uso são:<br />
• 4-aminoquinolinas (cloroquina e amodiaquina) – o complexo<br />
mecanismo de ação envolve a fragmentação do RNA do parasito e é<br />
capaz de se intercalar no DNA. Atua por concentrar-se nos lisossomos<br />
dos parasitos, inibindo a digestão da hemoglobina, reduzindo o<br />
suprimento de aminoácidos necessários para a viabilidade do parasito.<br />
• 8-aminoquinolinas (primaquina) – agem inibindo a respiração<br />
mitocondrial do parasito; são particularmente ativas contra as fases<br />
estacionárias (sem crescimento) do parasito.<br />
• Peróxido de lactona sesquiterpênica (derivados de artemisinina) –<br />
são os princípios ativos de um tradicional medicamento chinês para o<br />
tratamento da malária – a erva quinghao. O composto ativo foi isolado<br />
e caracterizado em 1971. A artemisinina e seus derivados possuem<br />
uma configuração peróxido (trioxano), responsável pela ação no<br />
metabolismo das proteínas.
10<br />
• Antibióticos (tetraciclina, doxiciclina e clindamicina) – possuem uma<br />
ação marcante, porém lenta, sobre os estágios eritrocitários da malária.<br />
São agentes inibidores da síntese de proteínas ribossômicas.<br />
• Arilaminoálcoois (quinino, mefloquina, e halofantrina) - os metanóis<br />
da quinolina e o fenantreno metanol são esquizonticidas sangüíneos<br />
eficazes nos estágios sangüíneos do parasito da malária envolvidos na<br />
digestão da hemoglobina. As duas quinolina-metanóis mais usadas<br />
são: o quinino e a mefloquina (Figura 2).<br />
CH=CH 2<br />
N<br />
NH<br />
CHOH<br />
CHOH<br />
CH 3 O<br />
Quinino<br />
N<br />
CF 3<br />
N<br />
Mefloquin<br />
CF 3<br />
Figura 2: Representação estrutural das Quinolinas-metanóis<br />
A porção quinolina é representada em cor laranja<br />
O quinino é o principal alcalóide derivado da casca da cinchona, também<br />
conhecida como casca peruana; as propriedades dessa planta foram reconhecidas<br />
em 1630 na América do Sul (TRACY e WEBSTER Jr., 1996). O mecanismo de ação
11<br />
como antimalárico não é bem conhecido, mas, como a cloroquina, sabe-se que inibe<br />
a polimerização da hemina tóxica em hemozoína (pigmento malárico), esse grupo<br />
heme quando livre é tóxico para o parasito, e acredita-se que seja inserida no DNA.<br />
A droga é eficaz esquizonticida de ação contra cepas de P. falciparum.<br />
A mefloquina é um composto quinolina-metanol, quimicamente relacionada ao<br />
quinino e como tal, também se liga ao pigmento malárico (hemozoína), mas ao<br />
contrário deste (quinino), não se insere no DNA. É um esquizonticida sangüíneo de<br />
ação prolongada (até 30 dias), eficaz contra todas as espécies de malária, incluindo<br />
parasitos P. falciparum multi-resistentes.<br />
As pressões seletivas das drogas antimaláricas são geralmente classificadas<br />
em termos de ação contra os diferentes estágios do ciclo do parasito (Figura 3):<br />
• Esquizonticidas teciduais ou hipnozoiticidas - atuam nas formas<br />
exoeritróciticas no fígado, destruindo os hipnozoítas latentes de P.<br />
vivax e P. ovale.<br />
• Esquizonticidas sangüíneos - atacam os parasitos nas células<br />
sangüíneas, prevenindo ou terminando a crise clínica.<br />
• Gametocitocidas - destroem as formas sexuadas do parasito<br />
(gametócitos) no sangue, impedindo a transmissão.<br />
• Esporontocidas - interrompem o desenvolvimento da fase<br />
esporogônica nos mosquitos que se alimentaram de portadores de<br />
gametócitos, de modo que os mosquitos não conseguem transmitir a<br />
infecção. Até o momento não existe nenhuma droga desse grupo<br />
disponível para uso em humanos.
12<br />
DROGAS ESQUIZONTICIDAS<br />
TECIDUAIS:<br />
8-aminoquinolinas<br />
Inibidores de folato<br />
Inoculação dos<br />
esporozoítas<br />
pelo Anopheles<br />
MOSQUITO<br />
TROFOZOÍTOS<br />
DROGAS<br />
ESQUIZONTICIDAS<br />
SANGÜÍNEAS:<br />
Artemisinina<br />
Quinolinas<br />
Inibidores de folato<br />
GAMETÓCITOS<br />
DROGAS GAMETOCITOCIDAS<br />
8-aminoquinolinas<br />
Figura 3: Ação dos antimaláricos no ciclo biológico do P. falciparum<br />
1.5 Resistência do P. falciparum aos antimaláricos<br />
O início da resistência do plasmódio falciparum à cloroquina marcou um<br />
capítulo novo na história da malária.<br />
A cloroquina foi sintetizada 1934 e representou nas últimas quatro décadas a<br />
droga mais importante no tratamento da malária (RIDLEY, 1998). É o antimalárico<br />
mais amplamente prescrito nos trópicos, entretanto, o seu uso atualmente não é
13<br />
recomendado para o tratamento das infecções pelo P. falciparum, em razão do<br />
elevado nível de resistência em vários países (FOOTE et al., 1990; TRIGG e<br />
KONDRACHINE, 1998; BRAY et al., 1998), conduzindo ao aumento significativo da<br />
taxa de mortalidade (THIMASARN, 1999). Apesar da alta prevalência da resistência<br />
do parasito à cloroquina, essa droga ainda permanece como uma das mais<br />
importantes para o tratamento da malária pelo P. falciparum em muitas regiões da<br />
África (KYLE et al., 2002), embora exista a necessidade de antimaláricos<br />
alternativos.<br />
A rápida propagação mundial da malária falciparum resistente à cloroquina<br />
levou em 1973, finalmente, à substituição dessa droga pela combinação de<br />
sulfadoxina+pirimetramina (SP) como esquema de tratamento de primeira escolha.<br />
O problema da resistência tornou-se ainda mais grave pela crescente<br />
prevalência de resistência do parasito às associações de drogas. Nos anos 80 a<br />
mefloquina se tornou à droga de escolha em áreas onde as 4-aminoquinolinas e os<br />
antifolatos não eram mais suficientemente efetivos (WERNSDORFER, 1998).<br />
O desenvolvimento rápido da resistência à mefloquina (WONGSRICHANALAI<br />
et al. 1992a) conduziu, na metade da década de 90, à introdução da artemisinina e<br />
seus derivados, tendo o combate à malária assumido novas perspectivas. De fato,<br />
esta droga propicia um rápido clareamento parasitário, com boa evolução clínica do<br />
paciente. Suas propriedades têm levado ao uso indiscriminado da droga, o que<br />
gerou opiniões consensuais sobre o possível desenvolvimento de resistência,<br />
especialmente quando ingeridos por via oral (WHO, 1998).
14<br />
Desde a adaptação da Estratégia Global para o Controle da Malária (EGCM)<br />
no ano de 1992, em Amsterdã, o Brasil e outros países seguiram a recomendação<br />
da OMS, transformando o antigo programa de erradicação em programa de controle<br />
da malária, re-direcionando objetivos, metodologia e estratégias. Vários problemas<br />
de ordem administrativos, financeiros e técnicos (esses representados<br />
principalmente pela resistência dos plasmódios aos antimaláricos) contribuíram para<br />
que os programas de erradicação ou controle no Brasil não atingissem seus<br />
objetivos finais (ANDRADE et al., 1992; HAWLEY et al., 1998; HEPPNER e<br />
BALLOU, 1998; BRASIL/FUNASA, 2000).<br />
A resistência do P. falciparum às drogas antimaláricas emergiu como um dos<br />
maiores desafios a ser enfrentado para o controle de malária, com implicações no<br />
aumento da mortalidade nas áreas hiper e holoendêmicas (HOWELLS, 1992;<br />
TRAPE et al., 2002) e contribuiu para o aparecimento e ampliação de novos focos<br />
de malária falciparum, mas acima de tudo foi identificado como um fator no<br />
contingenciamento econômico do controle da malária (BLOLAND, 2001).<br />
Diferentes mecanismos podem modificar o padrão de sensibilidade de vários<br />
organismos às drogas (BEALE, 1980). No caso particular do P. falciparum, o<br />
aparecimento da resistência, atribuído em primeiro lugar à ocorrência de mutações<br />
gênicas espontâneas (embora não exista ainda comprovação científica<br />
demonstrando que os antimaláricos utilizados rotineiramente exerçam efeitos<br />
mutagênicos sobre os plasmódios) e, em segundo lugar, à pressão seletiva<br />
desenvolvida pelos medicamentos sobre as populações de parasitos sensíveis e<br />
parasitos resistentes, independentes da dose utilizada. Assim, a resistência que
15<br />
aparece em casos tratados com pequenas doses torna os plasmódios refratários<br />
também a altas doses da droga (WHO, 1973; ROSÁRIO, 1976,<br />
WONGSRICHANALAI et al., 2002).<br />
1.6 História da resistência do P. falciparum<br />
Historicamente, a resistência do P. falciparum aos antimaláricos é conhecida<br />
desde o início do século passado quando Neiva (1910) e Nocht e Werner (1910)<br />
assinalaram no Brasil os primeiros insucessos no tratamento da malária com<br />
quinino. Em 1947, começaram a surgir referências ao aparecimento de plasmódios<br />
resistentes de regiões tratadas com antimaláricos sintéticos.<br />
Peters (1970) descrevem, a primeira evidência da diminuição da sensibilidade<br />
do P. falciparum à cloroquina em 1957 na Tailândia. Em 1958, Bustamante referiu<br />
que o aparecimento da resistência do P. falciparum ao quinino se tornou um sério<br />
problema à terapêutica da malária.<br />
Moore e Lanier (1961) notificaram o primeiro caso de P. falciparum<br />
cloroquina-resistente em dois pacientes procedentes de Bogotá. No mesmo ano,<br />
Young e Moore, em estudo posterior, comprovaram a resistência da cepa à<br />
cloroquina.<br />
No Brasil, no início da década de 60, foram descritos os primeiros casos de<br />
resistência à cloroquina, em pacientes com malária falciparum procedentes da<br />
região Amazônica e do Nordeste (RODRIGUES, 1961; SILVA, 1961a; 1961b; SILVA
16<br />
et al., 1961). Ferraroni e Hayes (1979) descreveram resistência à cloroquina em<br />
índios do Estado do Amazonas.<br />
Na década de 80, Alecrim (1981, 1986), em estudos in vivo e in vitro sobre a<br />
resistência às drogas antimaláricas na Amazônia, demonstra 100% de resistência in<br />
vitro à cloroquina.<br />
Santos et al., (1987), em estudo in vitro, no período de 1983 a 1986, com<br />
cepas da Amazônia Brasileira, mostraram 83% de resistência à cloroquina, 56% e<br />
51% ao quinino e à amodiaquina, respectivamente, e 2,3% à mefloquina.<br />
Kremsner et al., (1989a; 1989b), no Estado do Acre, em área de colonização,<br />
verificaram através de testes in vitro cepas resistentes à cloroquina (84%),<br />
amodiaquina (73%) e quinino (2,3%) e 100% de sensibilidade à mefloquina.<br />
Couto et al., (1993a), avaliando a resposta de cepas de P. falciparum em<br />
testes in vitro em sete municípios do sul do Estado do Pará em diferentes períodos,<br />
observaram resistência elevada para cloroquina (71%), relativamente baixa para<br />
amodiaquina (25,8%) e para o quinino apenas 8,2%. Para a mefloquina, apesar de<br />
não ter sido evidenciada resistência em nenhum dos isolados, os resultados<br />
demonstraram perda da sensibilidade, quando comparada a resistência em dois<br />
períodos distintos. Evidenciaram também cepas multi-resistentes em dois dos<br />
municípios estudados.
17<br />
Wongsrichanalai et al., (1992a, 1992b), na Tailândia, no período de 1980 a<br />
1990, identificaram a modificação do padrão de resistência do P. falciparum às<br />
drogas antimaláricas, em um estudo epidemiológico onde os dados demonstravam<br />
claramente a expansão e o aparecimento da resistência a mefloquina.<br />
Couto et al., (1995), ao realizarem os resultados análise temporal do perfil de<br />
resistência no período de 1983 a 1991, com cepas isoladas de Paragominas (PA) e<br />
Lourenço (AP), revelaram nas duas áreas uma aparente semelhança no padrão de<br />
resposta do P. falciparum, com alta prevalência de resistência à cloroquina (68,4% e<br />
79,8%, respectivamente) flutuação, dependendo do período, para amodiaquina e<br />
quinino, e sensibilidade para mefloquina, embora descreva discreta perda de<br />
sensibilidade nas amostras coletadas no Amapá quando comparadas com as do<br />
Pará.<br />
Alin e Bjorkman (1997), na Tanzânia, em estudos in vitro com isolados de P.<br />
falciparum, mostraram alta sensibilidade à mefloquina e artemisinina.<br />
Cerutti et al., (1999b), testando a suscetibilidade do P. falciparum às drogas<br />
antimaláricas in vivo e in vitro, no Estado do Mato Grosso, constataram in vivo uma<br />
elevada sensibilidade ao quinino e à mefloquina e reportaram in vitro a resistência<br />
de 96,6% à cloroquina, 3,3% ao quinino, enquanto 100% dos isolados foram<br />
sensíveis à mefloquina.<br />
Segundo FUNASA (2000), a migração na Amazônia é um importante fator<br />
para o aumento da transmissão e disseminação de cepas multi-resistentes entre
18<br />
localidades e Couto (2001), observou esta forte influência no estudo de<br />
caracterização das cepas de P. falciparum e monitoramento longitudinal da<br />
resistência às drogas em duas áreas da Amazônia Brasileira.<br />
Calvosa et al., (2001) relataram pela primeira vez resistência à mefloquina in<br />
vitro em cepas isoladas na parte oriental da Amazônia Brasileira, no município de<br />
Marabá, no Estado do Pará.<br />
Noeld et al., (2003c), em um estudo in vitro com cepas de P. falciparum de<br />
Bangladesh e da Tailândia, observaram altos níveis de resistência à cloroquina e<br />
acentuada para mefloquina. Os resultados demonstraram também, na maioria dos<br />
isolados, alta sensibilidade para quinino e 100% para artemisinina. Os autores<br />
concluíram que a alta prevalência da resistência do parasito à mefloquina em<br />
Bangladesh sugere a necessidade de uma ação de vigilância para verificar<br />
problemas de difusão de cepas multi-resistentes na área.<br />
1.7 Métodos de avaliação de resistência aos antimaláricos<br />
Um importante fator limitante do sucesso no tratamento da malária é a<br />
resposta variada dos parasitos às drogas usadas. Considerando esse fato,<br />
recomenda-se que o estudo da resistência seja sistemático, como instrumento para<br />
o controle da endemia (KROGSTAD et al., 1987; SUROLIA e PADMANABAN, 1991;<br />
SANCHEZ e LANZER, 1997; VASCONCELOS et al., 2000).
19<br />
Os estudos de eficácia terapêutica, testes in vitro e marcadores moleculares<br />
tornaram-se ferramentas que se complementam para o entendimento de uma visão<br />
global da suscetibilidade do P. falciparum às drogas antimaláricas (WHO, 2002a).<br />
O primeiro protocolo padronizado para avaliação da resposta in vivo do<br />
P. falciparum à droga foi elaborado pouco tempo depois do conhecimento sobre a<br />
resistência dessa espécie à cloroquina (WHO, 1965). Esse sistema de avaliação foi<br />
posteriormente revisado em 1967, modificado em 1972 (WHO, 1973) sendo a versão<br />
mais atual de 2001 (WHO, 2003). Esses protocolos foram editados originalmente<br />
para cloroquina, entretanto, com as modificações pertinentes, são aplicáveis<br />
também para avaliar a resposta a outros medicamentos esquizonticidas sangüíneos.<br />
Em 1973, a OMS, baseada em observações clínicas e parasitológicas, definiu<br />
como resistência à capacidade do plasmódio de sobreviver e multiplicar-se, apesar<br />
da administração e absorção de um medicamento em doses iguais ou superiores às<br />
prescritas habitualmente, observando-se os limites de tolerância dos pacientes<br />
(WHO, 1973; WERNSDORFER e PAYNE, 1988).<br />
Os estudos de seguimento da eficácia terapêutica e a resposta qualitativa ao<br />
tratamento permitem a interpretação do nível de suscetibilidade do plasmódio sem<br />
excluir o papel da imunidade inata do organismo nos pacientes com malária. O perfil<br />
de resposta dos parasitos assexuados às drogas esquizonticidas sangüíneas segue<br />
o modelo direcionado geralmente para o clareamento parasitário e a ocorrência da<br />
recrudescência dentro de um período de observação, que varia entre o início do<br />
tratamento, ou seja, dia zero (D0) num período de observação de 28 dias (D28) de
20<br />
acordo com a classificação em sensível (S) e três níveis de resistência (RI, RII e RIII)<br />
(Tabela 1).<br />
Tabela1: Classificação da resistência in vivo do P. falciparum às drogas<br />
antimaláricas (MS/FNS, 2001)<br />
Resposta Símbolo Sinais Observados<br />
Sensibilidade S Negativação da parasitemia assexuada<br />
RI<br />
dentro de sete dias a<strong>pós</strong> o 1º dia de<br />
tratamento, sem recrudescência.<br />
Negativação da parasitemia assexuada<br />
como na sensibilidade, porém seguida da<br />
recrudescência.<br />
Resistência RII Redução acentuada da parasitemia<br />
RIII<br />
assexuada, porém sem negativação.<br />
Não apresenta redução acentuada da<br />
parasitemia assexuada.<br />
Nas áreas de alta transmissão da doença, os métodos de avaliação in vivo<br />
tanto de sete dias (RII) quanto o de 14 dias (RIII) só são capazes de detectar<br />
resistência em nível avançado, o que dificulta e retarda as medidas de avaliação e<br />
ações de intervenção. Além disso, casos verdadeiros de resistência da droga podem<br />
não ser identificados devido a variações da farmacocinética, re-infecção, múltiplas<br />
infecções e interferência da resposta imune adquirida (BASCO e RINGWALD, 2000).<br />
Em 2000, Basco e Ringwald propuseram estabelecer novos critérios para<br />
resistência a drogas, baseados no fracasso terapêutico, no valor alto da
21<br />
concentração inibitória 50% (IC50), nas populações de parasitos idênticos no início e<br />
durante o tratamento, na presença de mutações associadas com a resistência da<br />
droga in vitro e em concentrações plasmáticas adequadas da droga.<br />
A vigilância da sensibilidade dos plasmódios às drogas antimaláricas se<br />
tornou mundialmente uma ação de importância extrema para a conduta terapêutica,<br />
bem como para o planejamento de políticas de controle da malária.<br />
1.8 Testes in vitro<br />
As dificuldades associadas à avaliação da resistência às drogas antimaláricas<br />
in vivo levaram, no final dos anos 70, à introdução de uma variedade de testes in<br />
vitro capazes de medir a suscetibilidade do P. falciparum aos medicamentos.<br />
Embora as provas in vitro de sensibilidade do P. falciparum aos<br />
medicamentos antimaláricos não substituam as observações verificadas in vivo, elas<br />
constituem ferramenta útil na investigação básica que serve de suporte para a<br />
elaboração e avaliação das políticas de saúde em malária (WHO, 1990). É um<br />
importante instrumento de avaliação na estimativa da resposta temporal e geográfica<br />
aos medicamentos, na vigilância da introdução de novos isolados em uma dada<br />
região e fundamentalmente no estudo pré-clínico de uma nova droga antimalárica<br />
(WHO, 1994).<br />
O teste in vitro permite com a remoção do parasito da circulação sangüínea<br />
do paciente e sua transferência para um ambiente de laboratório altamente
22<br />
controlável, uma avaliação mais específica da sensibilidade do parasito à droga,<br />
independentemente do sistema imune do hospedeiro, e revela com maior precisão a<br />
resistência à droga antimalárica. Esses métodos não só expressam resultados<br />
quantitativos como também determinam o fenótipo do parasito, independente da<br />
imunidade e das condições fisiopatológicas do hospedeiro (TALISUNA et al., 2004),<br />
além de oferecer a oportunidade de executar ensaios com múltiplos isolados, avaliar<br />
várias drogas simultaneamente e testar drogas experimentais (BLOLAND, 2001).<br />
Tradicionalmente os testes in vitro de sensibilidade do plasmódio às drogas<br />
são todos baseados na medida do efeito da droga no crescimento e<br />
desenvolvimento dos parasitos da malária. Tal efeito permite observar o grau de<br />
inibição do crescimento e/ou morte parasitário, refletindo o grau de suscetibilidade<br />
do parasito a um determinado fármaco e a uma determinada concentração.<br />
Inicialmente, as investigações in vitro com plasmódios de malária humana<br />
eram limitadas, principalmente pela indisponibilidade de método apropriado para a<br />
produção de biomassa parasitária suficiente para a realização das técnicas.<br />
A possibilidade de manter in vitro cepas de P. falciparum em cultura contínua<br />
(TRAGER e JENSEN, 1976) revolucionou as investigações sobre a malária humana,<br />
dando início a uma nova fase de grande importância no estudo da malária. A<br />
capacidade de cultivar o P. falciparum in vitro representou um avanço importante<br />
para a evolução de muitos estudos na bioquímica, parasitologia, imunologia e<br />
quimioterapia, além de propiciar a criopreservação de parasitos vivos,<br />
principalmente para entender a biologia dos parasitos que causam a malária
23<br />
falciparum (DIGGS et al., 1975; TRAGER e JENSEN, 1997) e a identificação de<br />
populações de diferentes áreas geográficas (CARTER e VOLLER, 1985; ROSÁRIO<br />
et al., 1986a, 1986b).<br />
O primeiro ensaio laboratorial descrito capaz de medir a capacidade do<br />
parasito se desenvolver da fase de anel jovem para esquizonte, usando as<br />
mudanças morfológicas para o monitoramento dos antimaláricos, foi o macroteste,<br />
desenvolvido por Rieckmann et al. (1968). O método foi aplicado pela primeira vez<br />
no mundo em 1969, num estudo realizado em Cuiabá, no Brasil, com cepas<br />
cloroquina-resistentes (RIECKMANN e LOPEZ-ANTUÑANO, 1971).<br />
Dez anos depois Rieckmann et al. (1978), vislumbrando determinar as áreas<br />
"cloroquina-resistentes", pelas evidências da resistência do P. falciparum às drogas,<br />
simplificaram o procedimento em microcultura para medir a inibição de maturação de<br />
esquizonte em 24 horas, que passou a ser conhecida como microtécnica. O<br />
aprimoramento da técnica teve por objetivo tornar sua execução mais prática e de<br />
baixo custo para utilização no monitoramento da sensibilidade do P. falciparum às<br />
drogas antimaláricas em condições de campo (PAYNE, 1984), e permanece até o<br />
presente como uma das técnicas mais simples para a avaliação de sensibilidade de<br />
drogas in vitro.<br />
Os estudos com cepas cloroquina-resistentes foram bem sucedidos e os<br />
autores começaram a usar a técnica para testar outras drogas. Desjardins et al.<br />
(1979b), avaliaram cepas já resistentes e sensíveis in vivo à cloroquina, quinino,<br />
primaquina, amodiaquina e mefloquina, mostrando predomínio da sensibilidade para
24<br />
a mefloquina. Richards e Maples (1979) testaram o efeito da cloroquina e<br />
pirimetamina para inibir o crescimento do parasito em cultura contínua. Nguyen-Dinh<br />
e Trager (1980) e Nguyen-Dinh e Payne (1980), estudaram a resistência do P.<br />
falciparum in vitro, com modificação da microtécnica de Rieckmann, que teve como<br />
justificativa o período de incubação de 48 horas para completar o ciclo biológico do<br />
parasito.<br />
Em 1981, foi produzida uma grande quantidade de kits para a execução da<br />
microtécnica, a pedido da OMS, que investia numa técnica simples a ser aplicada<br />
em condição de campo, altamente efetiva para o monitoramento emergencial de<br />
áreas de resistência do P.falciparum às drogas antimaláricas (PAYNE e<br />
WERNSDORFER, 1989).<br />
O método de maturação de esquizontes fundamenta-se na avaliação dos<br />
processos metabólicos do P. falciparum em cultura, e a susceptibilidade às drogas<br />
antimaláricas e combinações fundamenta-se no crescimento e desenvolvimento do<br />
plasmódio, baseado na observação morfológica e quantitativa do parasito. Embora<br />
extremamente útil em situações de campo, a microtécnica tem como desvantagens<br />
ser bastante laboriosa e exaustiva devido ao resultado do teste requerer leitura por<br />
microscopia ótica. As limitações naturais do processo, aliadas ao resultado subjetivo<br />
propenso à variabilidade de interpretação, não recomendam o método como o mais<br />
apropriado para avaliação de grandes amostragens (KYLE et al., 2002). Diante da<br />
necessidade de métodos mais adequados, surgiram, então, outras técnicas que<br />
permitem leitura automatizada.
25<br />
Desjardins et al. (1979a), desenvolveram um ensaio para o estudo da<br />
suscetibilidade do P. falciparum com o emprego de material radioativo baseado na<br />
inibição da incorporação da hipoxantina tritiada pelo parasito para demonstrar o<br />
efeito da droga. Esse método tem alto grau de reprodutibilidade, consideravelmente<br />
mais rápido na sua execução do que o teste baseado na avaliação morfológica de<br />
crescimento do parasito, além de ser mais sensível e objetivo, reduzindo os fatores<br />
relacionados à falha humana. Porém, essa técnica apresenta limitação para ser<br />
executada em campo, por necessitar de equipamentos específicos, envolve a<br />
manipulação de material radioativo (regulamentos relativos à manipulação de<br />
material radioativo desde os anos 70 ficaram consideravelmente mais restritivos), e a<br />
necessidade que o método requer de densidade elevada de parasitos (KYLE et al.,<br />
2002; NOEDL et al., 2003b).<br />
Com base no conhecimento de que a atividade da enzima lactado<br />
desidrogedonase do Plasmodium (pLDH) é distinguível da atividade de LDH humano<br />
na base do epítopo da proteína usado o 3-Acetil Piridina Adenina Dinucleotídeo<br />
(APAD) análogo da Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo (NAD), na conversão do<br />
lactado a piruvato, Makler et al. (1993a), Makler e Hinrichs (1993b) desenvolveram<br />
um ensaio que determina o perfil da inibição da sensibilidade do parasito à droga,<br />
medindo a atividade enzimática de pLDH através de espectrofotometria. Esse<br />
método tem a vantagem sob o método com radioisótopos, por ser simples e não<br />
usar material radioativo, porém, requer densidade parasitária inicial de 1-2% e, em<br />
testes com isolado a fresco, o resultado não foi suficientemente sensível para<br />
recomendar sua aplicação em campo (BASCO et al., 1995).
26<br />
As limitações associadas ao teste conduziram ao desenvolvimento de um<br />
novo ensaio, também baseado na LDH. Entretanto, nesse caso, ao invés de<br />
determinar a atividade enzimática, o método quantifica a enzima produzida pelo<br />
plasmódio através do método de ELISA (enzyme-linked immunosorbent) sanduíche<br />
de alta sensibilidade, utilizando dois anticorpos monoclonais (captura e revelador)<br />
direcionados contra epítopos distintos da LDH. É conhecido como chamado DELItest,<br />
e é consideravelmente mais sensível que a versão anterior (DRUILHE et al.,<br />
2001).<br />
Estudos realizados na África, comparando o teste radiométrico com o DELItest,<br />
na avaliação da resistência dos plasmódios aos antimaláricos, demonstraram<br />
resultados comparáveis entre os dois métodos (MORENO et al., 2001a; 2001b). Na<br />
Tailândia, um estudo de campo com DELI-Test usando anticorpo e kit comercial,<br />
comparando com a técnica de radioisótopo em isolados de sangue a fresco, permitiu<br />
concluir ser o método de ELISA sensível mesmo com baixa densidade parasitária,<br />
factível de prover uma avaliação in vitro relativamente rápida e precisa dos padrões<br />
de suscetibilidade da droga nas populações de parasitos e não usar material<br />
radiativo (BROCKMAN et al., 2004).<br />
A mais recente adição à lista de testes in vitro de sensibilidade aos<br />
antimaláricos para o P. falciparum fundamenta-se na medida quantitativa da<br />
Proteína 2 Rica em Histidina (HRP2) produzida pelo plasmódio, que tem meia vida<br />
longa principalmente na fase de trofozoíto. É detectável aproximadamente por duas<br />
semanas, é muito estável, e tem maior concentração nos eritrócitos do que no<br />
plasma (NOEDL et al., 2002).
27<br />
A HRP2 tem sido usada no diagnóstico rápido para malária (BEADLE et al.,<br />
1994). A meia-vida longa dessa enzima presente em pacientes com malária<br />
falciparum, tratados com sucesso limita a utilização do teste imunocromatográfico<br />
para o monitoramento da eficácia terapêutica (MAYXAY et.al., 2001), por outro lado<br />
para análise in vitro de suscetibilidade às drogas, a estabilidade desta proteína pode<br />
ser a principal vantagem.<br />
A quantidade de HRP2 produzida pelo P. falciparum está associada ao<br />
desenvolvimento e multiplicação do parasito, e serve como indicador para refletir<br />
inibição do crescimento na medida de suscetibilidade à droga (DESAKORN et al.,<br />
1997). A técnica que quantifica a produção de HRP2 é baseada na medida do<br />
aumento da proteína produzida pelo P. falciparum (PfHRP2) no curso de<br />
crescimento, desenvolvimento e multiplicação, em 72 horas de cultivo. A<br />
concentração de HRP2 produzida pelo parasito é medida pelo método de ELISA. A<br />
inibição do crescimento do parasito pela droga antimalárica é quantificada pelo nível<br />
de produção da HRP2 (Figura 4).<br />
CULTURA<br />
INICIAL<br />
CULTURA<br />
APOS 72 H<br />
HRP2<br />
Anti-HRP2<br />
COMPLEXO Ag-AC<br />
Figura 4: Princípio do método imunoenzimático da quantificação da PfHRP2<br />
(Adaptado de www.malaria.farch.net)
28<br />
Na luta contra a malária, torna-se cada vez mais importante, iminente e<br />
indispensável para a avaliação in vitro, o desenvolvimento e aplicação de novos<br />
métodos simples e confiáveis para a avaliação de droga-resistência, particularmente<br />
sob condições de campo. Os métodos tradicionalmente usados há mais de 20 anos<br />
(maturação de esquizontes/OMS e radioisótopos) apresentam limitações<br />
econômicas e operacionais para a utilização em campo (NOELD et al., 2004).<br />
Considerando as questões pertinentes de operacionalização, executou-se um<br />
estudo experimental de avaliação quantitativa in vitro da sensibilidade de P.<br />
falciparum às drogas antimaláricas utilizando um método imunoenzimático baseado<br />
na captura do antígeno HRP2 em amostras de sangue a fresco do paciente,<br />
cultivada, por 72 horas (NOELD, 2003) usando como padrão ouro o microteste -<br />
MARK III (WHO, 2001a).<br />
O estudo propõe validar o teste ELISA-sanduiche para detecção de HRP2<br />
para estudos de sensibilidade do P. falciparum às drogas antimaláricas, no<br />
Laboratório da Gerência de Malária da Fundação de Medicina Tropical do<br />
Amazonas, estimando seu desempenho, vantagens e limitações a fim de<br />
recomendar sua aplicação já que é tão sensível quanto e menos laboriosa que o<br />
microteste/OMS, podendo assim facilitar estudos dessa natureza no futuro.
29<br />
2 OBJETIVOS<br />
2.1 Geral<br />
Verificar o desempenho do ensaio imunoenzimático para a medida da Proteína 2<br />
Rica em Histidina (HRP2) na avaliação in vitro da sensibilidade do P. falciparum às<br />
drogas antimaláricas, na cidade de Manaus.<br />
2.2 ESPECÍFICOS<br />
• Estimar a sensibilidade do P. falciparum ao quinino e à mefloquina, pelo<br />
método da maturação de esquizontes (microteste/OMS) em amostras de<br />
sangue frescas de pacientes infectados.<br />
• Estimar a sensibilidade do P. falciparum ao quinino e à mefloquina, pela<br />
quantificação da HRP2 pelo método imunoenzimático ELISA em amostras de<br />
sangue frescas de pacientes infectados.<br />
• Comparar o desempenho da técnica imunoenzimática com detecção da<br />
HRP2, com o microteste (OMS).<br />
• Descrever as vantagens e as limitações do método de estudo in vitro de<br />
resistência do P. falciparum aos antimaláricos.
30<br />
3 MATERIAL E MÉTODOS<br />
3.1 Modelo do estudo<br />
Executou-se um estudo, comparativo de dois métodos de avaliação in vitro da<br />
sensibilidade do P. falciparum às quinolinas-metanóis (quinino e mefloquina).<br />
3.2 Local do estudo<br />
A Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMTAM) está situada na<br />
cidade de Manaus, desenvolvendo atividades nas áreas de assistência à saúde,<br />
pesquisa científica e formação de recursos humanos em doenças tropicais.<br />
Atualmente está sendo considerada como Centro de Referência nacional e<br />
internacional para o tratamento de enfermidades tropicais. A FMTAM tem importante<br />
participação no diagnóstico e tratamento da malária sendo responsável por 25% das<br />
notificações de casos de malária de todo o município de Manaus (FMTAM, 2005)<br />
(Figura 5).<br />
3.3 População estudada<br />
Os parasitos da malária estudados foram isolados de 59 amostras de<br />
sangue doadas por pacientes de livre demanda que procuraram a Gerência de<br />
Malária da FMTAM para o diagnóstico de malária. A determinação do número de<br />
amostras foi considerada com base na recomendação da OMS (2001a) de série<br />
de no mínimo 10 testes e 30 ou mais como ideal para o modelo do estudo.<br />
Tratou-se de uma amostra de conveniência, sem qualquer técnica de<br />
aleatorização empregada.
31<br />
Figura 5a: FMTAM<br />
Figura 5b: Recepção<br />
Figura 5c: Atendimento diagnóstico<br />
Figura 5d: Coleta gota espessa<br />
Figura 5e: Sala de microscopia<br />
Figura 5f: Entrevista<br />
Figura 5: Setores da Gerência de Malária da FMTAM
32<br />
3.4 Critérios de inclusão e exclusão<br />
Para o estudo foram selecionados aqueles portadores de malária causada<br />
exclusivamente por P. falciparum pelo diagnóstico parasitológico utilizando a<br />
distensão sangüínea espessa (gota espessa) corada pelo método descrito por<br />
Walker (OPS/OMS, 1975), com parasitemia mínima de 1000 parasitos<br />
assexuados/µL de sangue, idade igual ou maior que 12 anos, de ambos os sexos,<br />
sem quadro clínico de malária grave, e sem uso de antimaláricos nos últimos 30<br />
dias, em função de provável efeito residual durante a realização dos testes.<br />
3.5 Aspectos éticos<br />
O estudo foi conduzido com pacientes voluntários que, a<strong>pós</strong> entrevista<br />
individual, entenderam os objetivos do estudo e aceitaram participar através do<br />
termo de consentimento livre e esclarecido dentro dos preceitos da ética em<br />
pesquisa com humanos, sem prejuízo para o seu atendimento ou seu tratamento<br />
(Anexo A).<br />
Esse estudo fez parte de um protocolo científico multicêntrico com a participação<br />
de outros países latino-americanos integrantes da Rede Amazônica de Vigilância da<br />
Resistência às Drogas Antimaláricas (RAVREDA), sob a supervisão da Organização<br />
Pan-americana da Saúde (OPS) e, no Brasil, pelo Ministério da Saúde/Secretaria de<br />
Vigilância em Saúde (Anexo B). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em<br />
Pesquisa da FMTAM em 15.12.2003 (Anexo C).
33<br />
3.6 Recursos financeiros<br />
O estudo foi financiado com recursos do projeto RAVREDA oriundos do<br />
Convênio USAID (United States Agency for International Development)/<br />
OPAS/MINISTÉRIO DA SAÚDE/SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE - Carta<br />
Acordo FMTAM/OPAS/MINISTÉRIO DA SAÚDE/RAVREDA, nº BRA/03/00679-5 e<br />
pela Superintendência da Zona Franca de Manaus (SUFRAMA).<br />
3.7 Procedimentos laboratoriais<br />
O planejamento da metodologia foi padronizado para os dois métodos na<br />
execução de: coleta de sangue, preparação da suspensão de hemácias<br />
parasitadas, utilização do mesmo meio de cultura RPMI 1640 (Roswell Park<br />
Memorial Institute ® ), sob as mesmas condições de parasitemia e hematócrito, em<br />
duplicata, em volumes iguais distribuídos na mesma placa com a droga<br />
correspondente.<br />
3.7.1 Placas pré-dosadas de quinino e mefloquina<br />
Para a avaliação da suscetibilidade do P. falciparum às drogas antimaláricas<br />
foram utilizadas placas padronizadas de 96 poços, sendo 12 em cada uma das<br />
oito filas, estéril, de formato quadrangular, medindo 12,5 cm de comprimento por<br />
8,0 cm de largura, pré-dosadas: no poço “A” livre de droga, usado como controle,<br />
e nos poços B ao H com as quantidades ascendentes de dihidrosulfato de quinino<br />
(PM: 785.06) e hidrocloridrato de mefloquina (PM: 414.778) nas concentrações
34<br />
finais de 4–256pmol (0,08-5,12µmol/lBMM) e 2–128pmol (0,4–25,6µmol/lsangue)<br />
respectivamente; adquiridas comercialmente de fabricante recomendado pela<br />
OMS (Figura 6).<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11<br />
A<br />
B<br />
C<br />
D<br />
E<br />
F<br />
GH<br />
Quinino<br />
4<br />
256<br />
A<br />
B<br />
C<br />
D<br />
E<br />
F<br />
G<br />
H<br />
Mefloquina<br />
2<br />
128<br />
Poço A* = sem droga ¨Controle¨<br />
Poços B – H = concentrações ascendentes das drogas (pmol)<br />
Figura 6: Concentração das drogas nas microplacas<br />
3.7.2 Coleta e preparação do sangue<br />
Foram coletados 5 mL de sangue venoso periférico de cada paciente pelo<br />
método a vácuo (Vacuntainer ® ) em tubos com anticoagulante (EDTA) e em seguida<br />
confeccionada uma distensão sangüínea fina (esfregaço) corada pelo método<br />
hematológico de coloração rápida (panótico) para determinar a densidade<br />
parasitária.<br />
O sangue obtido diretamente do paciente foi centrifugado e lavado por três<br />
vezes consecutivas com meio RPMI 1640 tamponado com 35 mM de HEPES, 24<br />
mM de bicarbonato de sódio, 0,5% de Albumax ® , 1mg/L de hipoxantina e 5 μg/mL de
35<br />
gentamicina. Foram preparados 20 mL de suspensão de hemácias parasitadas em<br />
hematócrito de 1,5%, aproximadamente.<br />
As amostras de sangues com densidade parasitária inicial acima de 1%<br />
tiveram a parasitemia ajustada para 0,5% com hemácias do grupo sanguíneo O,<br />
obtidas da agência transfusional da FMTAM (Figura 7).<br />
3.7.3 Cultura e Teste de sensibilidade do P. falciparum às drogas antimaláricas<br />
(Microteste (OMS))<br />
Empregamos o protocolo MARK III (OMS, 2001a) com modificações, sendo<br />
elas: remoção dos leucócitos, meio de crescimento (RPMI1640) suplementado com<br />
Albumax ® e incubação das amostras de sangue na presença de mistura de gases.<br />
Imediatamente a<strong>pós</strong> a preparação da suspensão de hemácias parasitadas,<br />
conforme detalhado no item anterior, alíquotas de 100μL foram distribuídas em<br />
duplicatas diretamente nos poços das microplacas pré-dosadas com as drogas<br />
quinino e mefloquina. As placas foram incubadas sob tensão de mistura de gases<br />
(5% CO 2 , 5% O 2 balanceado com 90% N 2 ) a 37°C por 24 - 30 horas (considerando<br />
que as amostras de sangue não foram pré-selecionadas, as culturas foram<br />
monitoradas para finalizar sempre que o parasito tivesse amadurecido a esquizonte).<br />
Ao fim de cada período de incubação foram confeccionados, com alíquotas de<br />
sedimento de hemácias retiradas de cada poço, esfregaços corados, seguidos de<br />
leitura por microscopia ótica (Figura 7).<br />
Todas as leituras microscópicas foram feitas por duas únicas pessoas com<br />
reconhecido treinamento nesta técnica.
36<br />
Diagnóstico positivo<br />
P. falciparum<br />
Coletar 5 mL de sangue venoso<br />
com anticoagulante<br />
Lavar 3 vezes<br />
RPMI 1640<br />
HEPES/NaHCO3/Antibiótico/<br />
Albumax ®<br />
Suspensão hemácias<br />
parasitadas 1,5% Hematócrito<br />
Placas pré-dosadas<br />
100µL/poço duplicata<br />
Incubar a 37ºC<br />
Mistura de gases<br />
(5% CO 2 , 5%O 2 , 90%N 2 )<br />
24h – 30h ................. 72h<br />
Microteste/OMS<br />
Gota espessa<br />
Leitura microscópica<br />
ELISA HRP2<br />
Gota espessa (crescimento de parasito)<br />
Armazenamento das placas a –20ºC<br />
Figura 7: Preparação do sangue e teste in vitro de sensibilidade do P. falciparum
37<br />
Os resultados dos testes de maturação de esquizonte (Microteste (OMS))<br />
foram expressos pela contagem de pré-esquizontes e esquizontes com 3 ou mais<br />
núcleos visíveis em 200 parasitos, observados em microscópio ótico. O teste foi<br />
considerado válido quando a maturação dos esquizontes no poço controle (poço A<br />
sem droga) foi observado crescimento de 10% ou mais de esquizontes com 3 ou<br />
mais núcleos em 200 parasitos (OMS/2001a).<br />
O total de parasitos do poço controle (100%) foi à base do cálculo para<br />
comparação da maturação dos parasitos nos poços com droga. O cálculo segue a<br />
fórmula:<br />
Percentual<br />
Nº esquizontes por 200 parasitos do poço com droga<br />
de = X100<br />
inibição<br />
Nº de esquizontes por 200 parasitos do poço controle<br />
Para a avaliação da sensibilidade/resistência, foram empregados na<br />
interpretação dos resultados dois critérios:<br />
Concentração mínima inibitória (CMI) – concentração mínima da droga<br />
que inibe a completa maturação dos esquizontes no ponto de corte (PC)<br />
para cada uma das drogas (WHO, 2001a) (Tabela 2).<br />
<br />
Concentração inibitória 50% (IC50) – concentração da droga na qual<br />
são inibidos 50% do crescimento dos parasitos (IC50). O PC do IC50 usado para<br />
cada droga foi o determinado previamente por Brasseur et al (1988), pelo método<br />
isotópico sendo: > 300 nM para quinino e >30nM para mefloquina.
38<br />
Tabela 2<br />
Concentração das drogas in vitro para os níveis de sensibilidade/resistência<br />
DROGA SENSÍVEL (*) RESISTENTE (**)<br />
Quinino 128 pmol ou menos 256 pmol ou mais<br />
Mefloquina 16 pmol ou menos 32 pmol ou mais<br />
(*) Inibição da maturação de esquizontes<br />
(**) Ocorrência da maturação de esquizontes<br />
3.7.4 Teste in vitro de sensibilidade do P. falciparum pela quantificação da<br />
Proteína 2 Rica em Histidina (PfHRP2) pelo ensaio imunoenzimático-ELISA.<br />
A técnica de ELISA utilizada corresponde ao método descrito por Noedl,<br />
(2003a) com modificação, onde incluímos a lavagem das hemácias.<br />
1ª Fase - cultura<br />
Os procedimentos seguiram os mesmos descritos na técnica do Microteste<br />
(OMS), diferindo apenas no período de incubação que foi de 72 horas.<br />
No final das primeiras 24 horas de incubação o volume de um poço “controle”<br />
(sem droga) foi transferido para um tubo eppendorf e armazenado em freezer a<br />
-20ºC, esta amostra foi usada como background no ELISA. O desenvolvimento dos<br />
parasitos foi verificado por esfregaço sangüíneo com as hemácias de um poço<br />
controle livre de droga.<br />
No tempo final de incubação (72 horas) o acompanhamento do aumento da<br />
densidade parasitária foi verificado por um novo esfregaço de outro poço controle.
39<br />
As placas de culturas foram armazenadas a -20ºC e processados posteriormente o<br />
teste de ELISA.<br />
2ª Fase - Hemólise das hemácias - As hemácias parasitadas a<strong>pós</strong> cultura<br />
foram lisadas pelo processo de congelamento e descongelamento.<br />
3ª etapa – Técnica imunoenzimática – Teste de ELISA<br />
Os kits para o ELISA usado para quantificar a HRP2 produzido pelo parasito<br />
em cultura de sangue (Malaria Ag CELISA ® , Cellabs Pty. Ltd., Brookvale, NSW,<br />
Austrália) foram adquiridos comercialmente.<br />
As amostras de cultura das placas pré-dosadas com quinino e mefloquina,<br />
a<strong>pós</strong> o processo de congelamento e descongelamento, foram diluídas com água<br />
destilada, de acordo com a densidade parasitária inicial para obter uma<br />
parasitemia com aproximadamente 0,05 % no equivalente de 100 µL de<br />
suspensão por poço, em duplicata, diretamente na microplaca de ELISA com os<br />
poços previamente recobertos com o anticorpo monoclonal PfHRP2. O mesmo<br />
procedimento se repetiu para as amostras de 24 horas (background).<br />
As microplacas foram incubadas por 1 hora em câmara úmida à<br />
temperatura ambiente (TA). Os poços foram lavados quatro vezes com PBS-<br />
Tween em lavadora automática de microplacas marca (Organon ® ). Em seguida,<br />
100 µL do conjugado anti-P. falciparum foi adicionado em todos os poços. As<br />
microplacas foram mais uma vez incubadas por 1 hora em câmara úmida à<br />
temperatura ambiente e posteriormente os poços foram lavados novamente<br />
quatro vezes com PBS-Tweem. Aplicaram-se 100 µL de substrato cromógeno em
40<br />
todos os poços. Incubadas por 15 minutos ao abrigo da luz à temperatura<br />
ambiente. Interrompe-se a reação pela adição de 50 µL de ácido sulfúrico.<br />
Para a leitura dos testes foi usado um espectrofotômetro para microplacas<br />
(Organon ® Teknika Reader 230S, Version 1.23) em comprimento de onda 450nm<br />
(Figura 8), sendo aferida a densidade óptica (DO).<br />
Foram considerados nos teste os valores das DOs para os controle positivo<br />
entre 1,2 a 2,0, e para o background 0,2 a 0,4.<br />
Placas com poços previamente<br />
recobertos com anticorpos<br />
monoclonal PfHRP2<br />
Suspensão de hemácias a<strong>pós</strong><br />
congelamento/descongelamento<br />
1 hora/TA/Câmara úmida<br />
Lavar PBS/Tween 4 vezes<br />
POD<br />
S<br />
POD<br />
S<br />
POD<br />
S<br />
B<br />
POD<br />
S<br />
CONJUGADO<br />
1 hora/TA/Câmara úmida<br />
Lavar PBS/Tween 4 vezes<br />
POD<br />
S<br />
B<br />
POD<br />
S<br />
B<br />
POD<br />
S<br />
B<br />
POD<br />
S<br />
B<br />
SUBSTRATO CROMÓGENO<br />
15 minutos - TA/Câmara úmida<br />
Abrigo da luz<br />
Reação interrompida com<br />
Ácido sulfúrico<br />
Leitura em 450nm<br />
Figura 8: Técnica ELISA PfHRP2
41<br />
3.8 ANÁLISES ESTATISTICAS<br />
Os dados foram armazenados e analisados no programa EPI Info, versão 6.0.<br />
As concentrações inibitórias individuais IC50 para os dois ensaios foram<br />
determinadas por análise de regressão não linear usando o software HN-NonLin<br />
V.1.05 Beta, com acesso disponível gratuitamente na internet<br />
http://malaria.farch.net. baseado no modelo de regressão de polinômio (Anexo D).<br />
O Teste do qui-quadrado ou o Teste de Fischer foram utilizados para<br />
determinar a existência de diferenças significativas entre proporções.<br />
O Coeficiente de correlação entre variáveis quantitativas foi determinado pelo<br />
teste paramétrico de Pearson ou pelo teste não-paramétrico de Spearman.<br />
Para a análise de concordância entre os dois métodos, foi utilizado o<br />
coeficiente kappa.
42<br />
4 RESULTADOS<br />
4.1 Dados epidemiológicos<br />
No total das amostras de sangue coletadas de pacientes sintomáticos com<br />
malária falciparum, 21 (35,6%) foram do gênero feminino e 38 (64,4%) do<br />
masculino. A idade variou de 12 a 75 anos, com média de 36,4 anos (Figura 9).<br />
>60<br />
Masculino<br />
Feminino<br />
3<br />
1<br />
41-60<br />
12<br />
8<br />
21-40<br />
19<br />
7<br />
12-20<br />
4<br />
5<br />
25 20 15 10 5 0 2 4 6 8 10<br />
Figura 9: Distribuição dos pacientes segundo sexo a faixa etária<br />
O local de infecção informado no momento da entrevista revela que 54,2%<br />
suspeitaram ter contraído a infecção em Manaus, enquanto 42,4% acreditaram ter<br />
adquirido em outros municípios do estado do Amazonas (sendo a maioria nos<br />
municípios adjacentes de Manaus), 1,7% de outro estado da federação (Porto<br />
Velho-RO) e um de outro país (Guiana) (Figura 10).
43<br />
Guyana<br />
(1)<br />
IRANDUB<br />
(5)<br />
PRESIDENTE FIGUEIREDO<br />
(1)<br />
SAO SEBASTIAO<br />
DO UATUMA<br />
(1)<br />
MANAUS<br />
(32)<br />
CAREIRO<br />
DA<br />
(1)<br />
AUTAZES<br />
(4)<br />
MANAQUIRI<br />
(2)<br />
CAREIRO<br />
(8)<br />
PROTO<br />
(1)<br />
MANACAPURU<br />
(1)<br />
Figura 10: Distribuição dos 59 pacientes por local provável de infecção malárica<br />
Entre os 32 pacientes que relataram o município de Manaus como local<br />
provável de infecção, constatou-se que 18 pacientes eram oriundos da Zona Oeste<br />
(56,2%), 10 da Zona Norte (31,6%) e 4 distribuídos pelas Zonas Leste e Sul (12,2%)<br />
(Figura 11).
44<br />
Zona Oeste<br />
(18)<br />
Zona Norte<br />
(10)<br />
Zona Leste<br />
(3)<br />
Zona Sul<br />
(1)<br />
Figura 11: Distribuição dos 32 pacientes quanto ao local provável de infecção no<br />
município de Manaus<br />
Evidenciaram-se nos relatos de antecedentes de malária dos 59 participantes<br />
que 25 (42,4%) eram primoinfectados, 34 (57,6%) não-primoinfectados, destes,<br />
10 (29,4%) referiam mais de três infecções maláricas.<br />
4.2 Considerações sobre as técnicas<br />
O tempo médio de incubação para as culturas dos microtestes (OMS) foi de<br />
28 horas (24–30 horas). Os testes de ELISA HRP2 mostraram-se de execução<br />
simples, sendo realizados em média de três horas para um grupo de seis amostras<br />
em duplicatas.
45<br />
A figura 12 mostra quatro momentos de um microteste: em 12a, a amostra<br />
original no momento de sua aplicação na placa pré-dosada, onde se evidenciam as<br />
formas de trofozoítos; em 12b, notam-se trofozoítos e pré-esquizontes e 12c e 12d<br />
esquizontes indicando a maturação das formas anteriores em concentrações de<br />
droga não suficiente para inibir o desenvolvimento do parasito.<br />
Figura 12a: Trofozoítos pela gota espessa Figura 12b: Trofozoitos e pré-esquizontes<br />
Figura 12c: Esquizontes<br />
Figura 12d: Esquizonte
46<br />
A albumina comercial (Albumax, Gibco ® ) em substituição ao soro humano<br />
apresentou praticidade, com bom desempenho.<br />
Do total dos 59 testes realizados, duas (3,4%) amostras contaminaram 18<br />
(30,5%) não mostraram crescimento adequado do parasito em nenhuma das duas<br />
análises (ELISA HRP2 e microteste-OMS) e 39 (66,1%) isolados completaram o<br />
ciclo biológico dos parasitos com maturação de esquizontes nos poços controles em<br />
ambos os ensaios para as drogas quinino e mefloquina (Figura 13).<br />
Testes válidos<br />
66,1 %<br />
Crescimento<br />
insatisfatório;<br />
30,5 %<br />
Contaminação;<br />
3,4 %<br />
Figura 13: Distribuição dos resultados das culturas de P. falciparum a<strong>pós</strong> o<br />
período de incubação.<br />
4.3 Comparação entre as técnicas<br />
Dos 18 isolados que tiveram crescimento insatisfatório dos parasitos nos<br />
poços livres de droga, 8 (44,4%) foram testados pelo método imunoenzimático pela<br />
captura HRP2, para as drogas quinino e mefloquina. A densidade ótica (DO) nessas
47<br />
amostras revelou, de fato, uma leitura muito baixa, com 100% de concordância com<br />
os resultados da leitura microscópica do microteste (OMS), assumindo-se como<br />
verdadeiramente negativos.<br />
Os 39 isolados testados nos dois métodos nesse estudo experimental<br />
comparativo, em quatro (10,2%) as DO’s foram muito baixas (menor que 0,8) não<br />
permitindo avaliar essas amostras pelo teste ELISA HRP2 para as duas drogas,<br />
tendo resultado apenas pela visualização microscópica da maturação de<br />
esquizontes.<br />
Quando analisada a concordância entre os testes, a co-positividade foi de<br />
89,7%, [Intervalo de confiança 95% (IC95) de 74,8 a 96,7%] e a co-negatividade de<br />
100% [IC95 78,1 a 100,0%] e o coeficiente kappa de 0,860, considerado ótimo<br />
(Tabela 3).<br />
Tabela 3<br />
Concordância dos resultados entre os métodos Microteste (OMS) e ELISA HRP2<br />
ELISA HRP2<br />
MICROTESTE (OMS)<br />
+ -<br />
TOTAL<br />
+ 35 0 35<br />
- 4 18 22<br />
TOTAL 39 18 57<br />
Co-positividade= 89,74% Co-negatividade= 100% Coeficiente kappa= 0,860
48<br />
A média geométrica da densidade de parasitas nas amostras de sangue<br />
colhidas foi de 0,3 % (0,07–1,8 %), com 15,453µL -1 de sangue, e o intervalo de<br />
confiança 95% (IC95): 9,374–21,531µL -1 . Sete amostras de sangue tiveram<br />
densidades parasitárias maior de 1% (1,2–1,8%).<br />
A correlação da densidade parasitária com o IC50 de ambos os métodos e as<br />
drogas estudadas não foi estatisticamente significante (teste de Pearson; p>0,005).<br />
Analisando-se os 39 resultados do Microteste (OMS) a relação de maturação<br />
de esquizontes e inibição do crescimento dos parasitos sob as diversas<br />
concentrações das drogas testadas, demonstrou que 82,63% da população de<br />
parasitos exibem inibição da maturação de trofozoítos para esquizontes na<br />
concentração limite entre sensibilidade e resistência (128pmol) para quinino (Figura<br />
14) e 73,63% para mefloquina na concentração limite (32pmol) de parasitos com<br />
maturação de esquizontes (Figura 15). Os níveis de cepas resistentes detectáveis<br />
foram de 9/39 (23,1%) ao quinino e 16/39 (41,0 %) para mefloquina.<br />
Figura 14: Resultados dos 39 Microteste (OMS) relação de maturação de<br />
esquizontes e inibição do crescimento sob as diversas concentrações do quinino
49<br />
Figura 15: Resultados dos 39 Microteste (OMS) relação de maturação de<br />
esquizontes e inibição do crescimento sob as diversas concentrações da mefloquina<br />
Estes 39 ensaios quando analisados também em função da concentração de<br />
inibição (IC50), ou seja, a concentração da droga capaz de inibir o desenvolvimento<br />
de 50% da população dos parasitos, individualmente 35,89% (14/39) e 51,28%<br />
(20/39) para as drogas quinino e mefloquina respectivamente, tiveram a<br />
concentração inibitória acima do limiar de sensibilidade (Tabela 4).<br />
As médias do IC50 neste grupo de 39 amostras foram de 236,61 nM (IC95%:<br />
192,92-280,30 nM) para o quinino e 38,15 nM (IC95%: 32,06-44,25 nM) para a<br />
mefloquina (Tabela 4).
50<br />
Tabela 4<br />
Avaliação dos 39 isolados pela (CMI %), IC50% do P. falciparum ao quinino (QN)<br />
e mefloquina (MF) pelo microteste (OMS)<br />
DROGA<br />
N<br />
CMI<br />
(%)<br />
I IC50<br />
(%)<br />
IC50%<br />
(IC95%)<br />
QUININO<br />
39<br />
9<br />
23,01%<br />
14<br />
35,89%<br />
236,61<br />
(192,92 -280,30)<br />
MEFLOQUINA 39<br />
16<br />
41,02%<br />
20<br />
51,28%<br />
38,15<br />
(32,06 – 44,25)<br />
Analisando-se os resultados dos 35 concordantes em ambos os métodos a<br />
relação de maturação de esquizontes e inibição do crescimento dos parasitos sob as<br />
diversas concentrações das drogas testadas, demonstrou que 80,52% da população<br />
de parasitos exibem inibição da maturação de trofozoítos para esquizontes na<br />
concentração limite entre sensibilidade e resistência (128pmol) para quinino (Figura<br />
16) e 71,22% para mefloquina na concentração limite (32pmol) de parasitos com<br />
maturação de esquizontes (Figura 17). Os níveis de cepas resistentes detectáveis<br />
foram de 8/35 (22,85%) ao quinino e 15/35 (42,85 %) para mefloquina.
51<br />
Figura 16: Resultados dos 35 Microteste(OMS) relação de maturação de<br />
esquizontes e inibição do crescimento sob as diversas concentrações do quinino<br />
Figura 17: Resultados dos 35 Microteste (OMS) relação de maturação de<br />
esquizontes e inibição do crescimento sob as diversas concentrações da mefloquin<br />
A avaliação dos 35 testes concordantes em ambos os métodos as respostas<br />
individuais dos IC50 foram 37,14% (13/35) e 54,28% (19/35) às drogas respectivas<br />
pelo microteste (OMS) e 31,42% (11/35) e 45,71% (16/35) para quinino e<br />
mefloquina, pelo método do ELISA HRP2.
52<br />
As médias das concentrações inibitórias 50% (IC50) com os intervalos de<br />
confiança dos 35 testes concordantes para o experimento ELISA HRP2 foram<br />
225,19 nM (IC95%: 182,24–268,14 nM) e 40,03 nM (IC95% 32,54–47,52 nM), para<br />
quinino e mefloquina, respectivamente (Figura 18).<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
Quinino (nM)<br />
Mef loquina (nM)<br />
Maxima 483,94 95,53<br />
Minima 70,79 11,8<br />
Média 225,19 40,03<br />
Figura 18: Média do IC50% nos 35 testes concordantes da sensibilidade do<br />
P. falciparum às drogas quinino e mefloquina pelo método de ELISA HRP2<br />
No método de maturação de esquizontes (OMS) o valor médio do IC50% e os<br />
intervalos de confiança (IC95%) foram 246,54 nM (IC95%: 200,81–292,81 nM) e<br />
38,88 nM (IC95%: 32,13–45,64 nM) para quinino e mefloquina, respectivamente,<br />
(Figura 19).
53<br />
600<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
Quinino (nM)<br />
Mef loquina (nM)<br />
Maxima 528,86 85,32<br />
Minima 77,12 12,41<br />
Média 246,54 38,88<br />
Figura 19: Média do IC50% nos 35 testes concordantes da sensibilidade do<br />
P. falciparum às drogas quinino e mefloquina pelo microteste (OMS)<br />
A análise de correlação dos resultados do ELISA HRP2 com às duas drogas<br />
antimaláricas, individualmente, mostrou uma associação fortemente significante com<br />
aqueles obtidos dos microteste (OMS) em análise de IC50 (n= 35; R= 0.977; P <<br />
0.001) para quinino (Figura 20) e (n=35; R = 0.946; P < 0.001) para mefloquina<br />
(Figura 21).
54<br />
600<br />
IC50 determinado por microteste/WHO<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
QUININO<br />
R^=0,977<br />
p
55<br />
Quanto aos resultados de IC50 obtidos da análise do ELISA HRP2 para<br />
avaliar indícios de resistência cruzada dos parasitos entre os dois compostos<br />
químicos, não houve associação estatisticamente significante (r=0,369; p=0,019),<br />
sugerindo, portanto que não há resistência cruzada evidente entre estas drogas. Os<br />
padrões de sensibilidade foram idênticos aos testados pelo método microteste<br />
(OMS).
56<br />
5 DISCUSSÃO<br />
A história da resistência aos antimaláricos, exaustivamente investigados,<br />
documenta que antes do fracasso do tratamento acontece uma redução progressiva<br />
da sensibilidade, facilmente detectável pela avaliação da mudança na concentração<br />
inibitória 50% (IC50) da droga in vitro. Os resultados dos estudos in vitro regulares<br />
emitem precocemente sinais de iminente resistência desses parasitos às drogas de<br />
uso habitual ou em fase experimental, podendo nortear a tomada de decisões na<br />
política dos antimaláricos nos paises onde há a endemia malárica (OMS, 2005b).<br />
5.1 Dados epidemiológicos<br />
A topografia de Manaus é caracterizada por inúmeros igarapés e coleções de<br />
água formadas pela estação das chuvas, os quais propiciam condições adequadas<br />
para o desenvolvimento da população anofélica. A periferia da cidade tem como<br />
particularidade tipos de moradias toscas, edificadas com madeira e em muitas<br />
situações encontram-se estruturas quando muito protegidas apenas por papelão,<br />
lona ou palha, localizadas freqüentemente próxima a coleções hídricas.<br />
Quanto as informações relativas a presente avaliação, observou-se a maior<br />
incidência da malária em pacientes adultos do sexo masculino, possivelmente este<br />
dado relaciona-se com à exposição mais freqüente pelo exercício de sua atividade<br />
tais como: agricultor, caseiro, no desmatamento de áreas para assentamentos<br />
desordenados (invasões) em horários de maior vulnerabilidade na cadeia de<br />
transmissão da doença.
57<br />
Neste estudo 54,2%, de pacientes com suspeita de terem contraído a doença<br />
malárica em Manaus observou-se que as maiores concentrações foram em três<br />
zonas geográficas (Oeste, Norte e Leste), possivelmente como resultado da<br />
explosão demográfica urbana desordenada pelo movimento migratório em<br />
conseqüência da expansão da fronteira econômica, com invasões dando origem a<br />
novos bairros formados por bolsões de carências sociais, originados por alterações<br />
ambientais. A movimentação constante da população exibe o perigo potencial de<br />
disseminação de cepas de parasitos sensíveis ou resistentes aos medicamentos. A<br />
OMS (1987) e Di Souza (1992) associaram a migração humana à disseminação de<br />
cepas de parasitos resistentes, principalmente em áreas de elevada transmissão.<br />
Estudos sobre fatores de risco relacionados com padrões socioeconômicos e<br />
ambientais têm apresentado fortes associações com a transmissão da malária em<br />
diversas regiões do mundo (BANGUERO, 1984; BUTRAPORN et al., 1986; KORAM<br />
et al., 1995). No Brasil, Terrazas et al. (2004), analisando a distribuição espacial da<br />
malária em Manaus, por meio de geoprocessamento, demonstraram que as zonas<br />
Leste e Norte e parte da Oeste são as que mais concentram as localidades de alto<br />
risco de transmissão da doença, superpondo-se às áreas de invasão guardando<br />
semelhança com o que foi observado no presente.<br />
Suárez Mutis (1997), estudando o processo de transmissão da malária em<br />
área de invasão recente na cidade de Manaus, constatou não poder afirmar a<br />
existência da urbanização da malária, embora a população se encontre em processo<br />
de periferização, em condições precárias do espaço ocupado, propiciando a<br />
ocorrência de surto da doença durante o período de consolidação de infra-estrutura
58<br />
socioeconômico e ambiental. Similarmente na avaliação, 57,6% dos pacientes<br />
mencionaram terem sido acometidos por vários episódios de malária ao longo dos<br />
anos, evidenciando, assim, habitual exposição com conseqüente risco de contrair a<br />
doença, particularmente em áreas próximas ao habitat do vetor.<br />
5.2 Considerações sobre as técnicas<br />
Tendo como único critério para a seleção das amostras de sangue a<br />
densidade parasitária inicial, as culturas de P. falciparum realizadas sob as mesmas<br />
condições em ambos os métodos testados, a<strong>pós</strong> os respectivos períodos de<br />
incubação (30h e 72h), tiveram aproveitamento final (66,1%) em ambas as técnicas,<br />
sugerindo que um ciclo eritrocítico assexuado completo (48h) produz um aumento<br />
significativo nas concentrações da HRP2 correspondente à elevação do nível de<br />
parasitemia. Estes achados divergiram dos encontrados por Noedl et al. (2004), que<br />
relataram uma taxa de sucesso, diferenciado de 87% a<strong>pós</strong> 72 horas de cultivo<br />
(HRP2) comparado com 61% do microteste/OMS com o tempo de incubação que<br />
não excedeu a 30 horas, sugerindo que a incubação longa (72 horas) permite testar<br />
drogas de ação lenta (antifolatos e antibióticos) sem necessidade de modificar o<br />
protocolo. Não podendo ser estas informações comparadas com outros estudos<br />
realizados na Bacia Amazônica, uma vez que os critérios metodológicos não<br />
guardam similaridades.<br />
A opção neste experimento de substituir o soro humano pela albumina<br />
comercial (Albumax ® , Gibco) como fonte de proteína para os parasitos foi de ordem<br />
metodológica do protocolo, justificado pelo padrão mais uniforme e o controle da
59<br />
qualidade das proteínas. Na execução dos testes, a utilização do Albumax ® também<br />
demonstrou praticidade conforme os estudos que mostraram ser o soro bovino fetal<br />
ou Albumax ® um substituto satisfatório para o soro humano no cultivo in vitro do P.<br />
falciparum (BASCO, 2003), além de eliminar a necessidade de armazenamento e<br />
controle do soro no campo (BASCO 2004). Embora os resultados com albumina<br />
comercial não sejam necessariamente idênticos aos obtidos com o soro humano, o<br />
resultado final facilita a comparação (RINGWALD et al., 1999).<br />
A maturação de parasitos das formas de anéis jovens em esquizontes, em<br />
ambos os métodos, não foi satisfatória em 30,5% das culturas, supõe-se que este<br />
fato tenha relação com automedicação recente. O critério adotado para a exclusão<br />
do uso de antimaláricos foi determinado apenas pela informação verbal no momento<br />
da entrevista, contrariando o recomendado para a confirmação da ausência do uso<br />
de antimaláricos pelo exame de urina. Provavelmente esta dificuldade técnica pode<br />
ter contribuído para o não sucesso com diversas amostras, inclusive aquelas com<br />
baixas parasitemias. Em acordo com o observado por Basco et al. (2002), nas<br />
amostras de sangue de paciente com medicação recente, o ciclo biológico do<br />
parasito foi incompleto ou teve pouco crescimento, com a diminuição do IC50 pela<br />
presença da droga no sangue. Cravo e Rosário (2004) citaram como um dos<br />
problemas de execução dos testes in vitro a dificuldade no controle dos níveis dos<br />
fármacos em cultura devido à ingestão prévia de antimaláricos pelo doente.<br />
5.3 Comparação entre as técnicas<br />
Apesar da concordância entre os resultados do método de ELISA HRP2 e o<br />
microteste (OMS) mostrarem especificidade de 100% e a co-positividade 89,74%,
60<br />
com índice kappa ótimo, quatro (10,2%) isolados testados pelo ELISA HRP2 para as<br />
droga tiveram valores muito baixos de densidades óticas (DOs), o que condicionou<br />
avaliar as mesmas apenas pela leitura microscópica. As observações sugerem certa<br />
dificuldade para o reconhecimento do teste, primeiramente atribuída a problemas<br />
logísticos, no armazenamento e transporte dos kits, no processo de importação da<br />
Austrália para Manaus em condição recomendável de temperatura. Outra hipótese<br />
recai sobre a sensibilidade do kit, quando se observa que a densidade parasitária<br />
mínima no estudo foi de 0,07%, bem acima da parasitemia inicial (0,01%) descrita<br />
pelo fabricante. Todavia, tornam-se imperiosa a condução de novos estudos para<br />
uma caracterização mais clara e mais precisa dos questionamentos acima.<br />
Noedl et al. (2004) fazem referência ao ensaio supra citado como sensível o<br />
bastante para detectar parasitemias de 0,01%, comparável ao microteste (OMS) e<br />
dez vezes mais sensível que o método isotópico. Entretanto, ressalvam os<br />
pesquisadores que a densidade parasitária de 0,03% seria valor mínimo ideal para o<br />
início dos testes nos quais se incluem a maioria dos casos de malária falciparum<br />
sintomáticos.<br />
O IC50 do ensaio ELISA HRP2 não indicou associação significativa com a<br />
densidade parasitária inicial (p>0,05), sugerindo que a densidade parasitária nesse<br />
teste não tem grande relevância. Duraisingh et al. (1999) e Noedl et al. (2002) fazem<br />
referência ao ajuste da parasitemia, diluindo a amostra original de sangue para<br />
eliminar completamente qualquer efeito inócuo ao parasito.<br />
A preferência neste estudo pelo kit de ELISA (Malaria Ag CELISA ® ) para a<br />
quantificação da PfHRP2 em relação outras apresentações de anticorpos
61<br />
monoclonais específicos comercializados por diversos laboratórios, se deu por ser<br />
dispensável a padronização do procedimento de análise e pela aparente facilidade<br />
de reprodução do teste em avaliação, este comercializado atualmente para o<br />
diagnóstico em Bancos de Sangue e ainda em fase de estudos no Brasil pela<br />
RAVREDA.<br />
O presente estudo, realizado em condições de laboratório, teve um bom<br />
desempenho e foi de fácil execução, mostrando-se ser factível sua implementação,<br />
quando adaptado, em condições de campo. Os resultados dessa avaliação com o<br />
método do ELISA foram comparáveis aos do microteste (OMS), concordando com o<br />
que referem Noeld et al. (2002) avaliando o ELISA HRP2 em laboratório com cepas<br />
adaptadas em cultura. O método provou ser tão seguro quanto o ensaio tradicional<br />
(microtécnica/OMS) e tão sensível quanto o ensaio isotópico, mais fácil de executar<br />
e de baixo custo em relação a este último.<br />
Em outro estudo com isolados frescos de P. falciparum cultivados por 72<br />
horas, em condições de campo, omitindo os procedimentos de centrifugação,<br />
lavagens das hemácias, uso de soro e diluição com células vermelhas de sangue,<br />
evidenciaram resultados muito próximos aos comparados com o ensaio modificado<br />
de maturação de esquizontes da OMS (NOEDL et al., 2004).<br />
O elevado custo do kit comercial para a realização das provas em nosso<br />
estudo apresentou-se como sendo uma desvantagem. Noeld et al. (2005) testando o<br />
desempenho de um novo teste de ELISA, com anticorpos monoclonais disponíveis<br />
comercialmente, descrevem resultados de sensibilidade comparáveis aos obtidos
62<br />
usando o kit ELISA HRP2, com uma redução considerável de 80% no custo final.<br />
Pode ser uma nova perspectiva de alternativa no futuro a aplicação nas avaliações<br />
de sensibilidade do plasmódio as drogas antimaláricas.<br />
<strong>Melo</strong> (2004), ao fazer uma revisão das vantagens e desvantagens dos<br />
métodos disponíveis usando anticorpos monoclonais específicos para os estudos in<br />
vitro, observa a nova geração dos ensaios de sensibilidade sinalizando na direção<br />
de recursos essenciais, tais como, alta sensibilidade, alta reprodutibilidade, semiautomatização,<br />
não utilização de material radioativo, viabilidade técnica de aplicação<br />
sob condições de campo, particularmente em regiões endêmicas. Com argumentos<br />
semelhantes, Moreno et al. (2001a) referem que métodos imunoenzimáticos<br />
apresentam facilidade de reprodução e podem despertar um interesse renovado<br />
neste campo de pesquisa essencial similar a Noedl et al. (2005), os autores atentam<br />
para importância do sucesso dos ensaios de resistência às drogas antimaláricas em<br />
campo, pela simplicidade de implementação e execução e alta sensibilidade do<br />
teste.<br />
5.4 Limiar de sensibilidade/resistência do P. falciparum às drogas<br />
antimaláricas<br />
Devido às peculiaridades de cada um dos ensaios (microteste/OMS e ELISA<br />
HRP2), tornou-se realmente impossível executá-los sob condições idênticas e,<br />
embora as leituras das duas técnicas sejam diferentes, ainda assim, o método do<br />
ELISA HRP2 demonstrou resultados muito próximos quando correlacionados com os<br />
produzidos pelo microteste/OMS, este padrão ouro. É necessário entender que as<br />
modificações dos protocolos podem alterar os resultados obtidos, ajuntando-se a
63<br />
isso os diversos fatores com influencia com a resposta in vitro do parasito. Alguns<br />
desses fatores são citados por Basco (2004), como a substituição do soro como<br />
fonte de proteína para os parasitos, o ajuste do hematócrito e da parasitemia inicial,<br />
o período de incubação e a mistura de gases. Entre as orientações da MIM/TDR<br />
(2002) destacam-se os métodos atuais disponíveis para a avaliação do perfil da<br />
sensibilidade do P. falciparum às drogas antimaláricas mais seguras, porém, faz<br />
ressalvas para as variações nas técnicas que nem sempre originam resultados<br />
uniformes, impossibilitando comparações entre diferentes estudos.<br />
As constatações mencionadas fazem ver com clareza a necessidade de se<br />
adotar um protocolo padronizado que permita a comparação de resultados entre os<br />
testes de sensibilidade executados em diversas regiões, em condições laboratoriais<br />
controladas, assim como para pesquisa em campo, com a possibilidade de validar,<br />
in vitro, os limites de resistência na Bacia Amazônica.<br />
As análises do limiar de sensibilidade/resistência interpretadas de formas<br />
distintas, CMI/OMS e IC50 nos dois métodos, ofereceram dificuldades na análise<br />
global dos dados. Basco e Ringwald (2000) referem que os resultados do microteste<br />
isotópico e o microteste (OMS) não são comparáveis, mencionando que um dos<br />
principais problemas com os testes in vitro é a determinação dos valores do limiar do<br />
IC50 que distingue parasitos sensíveis de resistentes. Contudo, comentam que o<br />
IC50 resultante do método enzimático que detecta a presença da desidrogenase<br />
láctica produzida pelo parasito (pLDH) está altamente correlacionada com IC50<br />
obtida pelo microteste isotópico.
64<br />
A associação fortemente significativa dos resultados encontrados com o<br />
ELISA HPR2 e os obtidos pelo microteste (OMS) estão em concordância com os<br />
resultados de outros estudos in vitro de sensibilidade realizados com o método<br />
imunoenzimático, em paralelo com o método isotópico e o de maturação de<br />
esquizontes/OMS (NOEDL et al., 2002; NOEDL et al., 2004).<br />
De acordo com a OMS (2005b), a padronização do método e dos resultados<br />
está ganhando importância crescente para o estudo in vitro. Refere que os<br />
resultados não deveriam ser expressos em percentual de resistência, especialmente<br />
quando não são validados os limites de resistência, e sim relatados como média<br />
geométrica do IC50 ou CMI, permitindo dessa forma uma comparação quantitativa<br />
mais precisa entre regiões de um determinado país na relação tempo-espaço.<br />
5.5 Avaliação da sensibilidade do P. falciparum às drogas quinolinas-metanóis<br />
Os resultados deste ensaio mostram característica distinta da sensibilidade do<br />
P. falciparum para cada uma das drogas estudadas. Diversos fatores sugerem<br />
associação à emergência e disseminação da quimiorresistência dos parasitos da<br />
malária, como o uso inadequado dos medicamentos, a automedicação, sendo<br />
provavelmente a pressão de seleção dos antimaláricos um dos mais importantes<br />
(YOUNG e MOORE, 1961; PETERS, 1970; 1998; DE SOUZA, 1992).<br />
A resistência do P. falciparum ao quinino (22,85% com IC50: 246,54 nM pelo<br />
microteste/OMS) observada corrobora resultados in vitro similares de outros<br />
investigadores, em diversas regiões do país, utilizando a mesma técnica (Reickmann
65<br />
et al.) por Rosário et al. (1986a) (Acre, Amazonas, Roraima, 11,8%), Santos et al.<br />
(1987) (Pará e Amapá, Rondônia, Maranhão - 56,5%), Di Santi et al. (1988) (Pará,<br />
Acre - 2%), Kremsner et al. (1989) (Acre - 2,3%), Couto et al. (1993a) (Pará - 8,2%),<br />
Cerutti et al. (1999b) (Mato Grosso - 3,3%) pelo método isotópico com cepas<br />
adaptadas em cultivo e Zalis et al. (1998) (Mato Grosso) pelo método modificado de<br />
Desjardins et al, e Lebras e Deloron, que citam a redução da sensibilidade (IC50=40-<br />
280nM). Esses achados previsíveis são indicativos da evolução natural da<br />
resistência do plasmódio ao quinino em áreas onde a pressão da droga sobre a<br />
população de parasitos é usada no tratamento padrão para malária não grave ou<br />
complicada e onde se observa uma elevada ocorrência de infecções não curadas<br />
(SUEBSAENG et al., 1986).<br />
Cerutti Jr (1999a), em estudo comparativo in vivo e in vitro da sensibilidade do<br />
P. falciparum em área endêmica de malária na Amazônia Brasileira, faz referência a<br />
10,6% dos isolados que apresentaram resistência ou baixa sensibilidade ao quinino,<br />
com o IC50 igual a 1,13µmol/l. Não houve correlação entre as concentrações<br />
inibitórias e o clareamento parasitário.<br />
A média do IC50 (225,19 nM) detectada no estudo pelo método ELISA HRP2<br />
apresenta um perfil da sensibilidade P. falciparum ao quinino. Noeld et al. (2002), no<br />
período de 1994 a 2001, avaliando a suscetibilidade parasitária aos antimaláricos na<br />
Ásia (Tailândia, Myanmar e Bangladesh), com cepas criopreservadas e adaptadas<br />
em cultura, registram a média geométrica do IC50 343,86 nM, e, em 2004, Noedl et<br />
al obtiveram com isolados frescos de P. falciparum, em estudo de campo, em região<br />
endêmica da Tailândia, IC50 igual a 326,75 nM ao quinino.
66<br />
Por recomendação do Ministério da Saúde do Brasil, o esquema de primeira<br />
linha no tratamento da malária falciparum não complicada, continua sendo o quinino<br />
em associação com antibióticos (BRASIL/MS/SVS, 2001). O perfil do P. falciparum<br />
ao antimalárico observado neste estudo, avaliando-se a média do IC50 por ambos<br />
os métodos, sugere boa suscetibilidade parasitária à droga, porém não sendo<br />
possível correlacionar com a eficácia da droga in vivo, uma vez que já se observou,<br />
na Amazônia Ocidental, falhas terapêuticas com esta droga (ALECRIN, et al., 1986;<br />
ALECRIN et al., 1988; SILVA et al., 1988; SAMPAIO et al., 1991; SAMPAIO et al.,<br />
1992).<br />
Em ensaio multicêntrico de avaliação da eficácia do quinino realizado pela<br />
RAVREDA, em 14 municípios da Amazônia Legal, os dados preliminares advertem<br />
para fracasso terapêutico em 14,3% dos pacientes, atribuindo os resultados<br />
encontrados à qualidade do medicamento utilizado ou à resistência dos parasitos ao<br />
esquema de tratamento (BRASIL/MS/SVS, 2005). No Amazonas avaliando-se a<br />
sensibilidade do P. falciparum in vivo no município de Coari, no ano em curso, os<br />
resultados provisórios, demonstram alto percentual de fracasso terapêutico<br />
observado nos pacientes tratados com quinino sinalizam um aumento da tolerância<br />
dos parasitos ao fármaco (Alecrim, MGC; comunicação pessoal).<br />
Naquelas áreas onde as cepas do P. falciparum ainda não desenvolveram<br />
resistência ao quinino, freqüentemente a resistência é superestimada, associada à<br />
baixa adesão ao esquema terapêutico de múltiplas doses durante sete dias,<br />
raramente respeitados, e o limiar para resistência in vitro não está claramente<br />
definido (SUEBSAENG et al., 1986; WHO, 2005b). No entanto, dados oriundos da
67<br />
sensibilidade dos plasmódios nos estudos in vitro podem predizer a ocorrência de<br />
pouca efetividade curativa dos antimaláricos, observando-se maior número de<br />
fracassos terapêuticos em áreas onde já se percebe a resistência parasitária.<br />
Os resultados dos testes in vitro para mefloquina mostraram que 42,85% dos<br />
isolados de P. falciparum resistentes ao antimalárico, sugerindo a emergência de<br />
resistência no Amazonas. A resistência teria sido muito mais alta (54,28%) se o valor<br />
de limiar padrão de 30nM para o IC50 como referência tivesse sido usada (Brasseur<br />
et al., 1988). Estes achados advertem para a diminuição da sensibilidade dos<br />
plasmódios, corroborando os dados de outros estudos realizados na região<br />
Amazônica Brasileira e em outros países, reportando o aumento da resistência do P.<br />
falciparum à droga.<br />
A diminuição da sensibilidade do P. falciparum in vitro à mefloquina é notória,<br />
com maior relevância na Ásia. Na Tailândia, a<strong>pós</strong> introdução do uso da droga em<br />
1985, a resistência ao fármaco vem sendo observada desde década de 90,<br />
tornando-se um problema de saúde pública em áreas onde a mefloquina foi<br />
intensamente empregada (WHITE, 1994; MOCKENHAUPT, 1995;<br />
WONGSRICHANALAI et al., 2002). Wongsrichanalai et al. (2001) estudando a<br />
suscetibilidade do P. falciparum na Ásia com cepas adaptadas em cultura isoladas<br />
de quatro regiões de Myanmar (Myitkyina, Lashio, Mawlamyine, Dawei),<br />
identificaram Mawlamyine como a área de transmissão de P. falciparum mefloquinaresistente<br />
na região de fronteira com a Tailândia.
68<br />
A alta prevalência da resistência in vitro à mefloquina em Bangladesh foi<br />
documentada por Noedl, et al. (2003c). No Gabão (Ramharter et al., 2004),<br />
avaliando-se atividade das quinolinas pelo método de maturação de esquizontes no<br />
intervalo de 24 horas, apontam para diminuição significativa da sensibilidade do<br />
P. falciparum à mefloquina. Um estudo na África Ocidental mostrou a existência de<br />
parasitos com sensibilidade diminuída para mefloquina antes mesmo de sua<br />
introdução na região para uso terapêutico (WHO, 2005b).<br />
Na América do Sul, em particular na Colômbia e na Venezuela, Espinal et al.<br />
(1985) e Maynadie et al. (1989) reportaram populações de parasitos resistentes ou<br />
com redução da sensibilidade observada na análise in vitro.<br />
No Brasil, Alecrim (1981) fez o primeiro relato de resistência a mefloquina e já<br />
alertava para a diminuição da sensibilidade à mefloquina quando a droga ainda<br />
encontrava-se em estudo clínico em fase de validação da dose terapêutica.<br />
Cronologicamente, estudos que correlacionaram a resposta de sensibilidade in vivo<br />
e in vitro, realizados no decorrer das últimas décadas no Brasil, também<br />
manifestaram a preocupação com a redução da sensibilidade ou resistência do<br />
plasmódio à mefloquina devido à provável ocorrência da pressão de seleção da<br />
droga pelo uso inadequado no que se refere a posologia diferentes áreas da<br />
Amazônia Brasileira ( ALECRIM, 1986; ALECRIM et al., 1986; COUTO et al, 1993b;<br />
CERUTTI. Jr et. al., 1999; Di Santi et al.,1986,1988; CALVOSA et al., 2001; COUTO,<br />
2001).
69<br />
Noronha et al. (2000) relatam a ocorrência de resistência ao nível de RIII, à<br />
mefloquina, em crianças com malária falciparum não complicada tratadas na<br />
Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, em Manaus.<br />
A redução da sensibilidade do P. falciparum in vitro à mefloquina observada<br />
no estudo pode estar relacionada ao provável reflexo do uso precoce da droga com<br />
entrada ilegal pela Guiana Francesa, antes mesmo de ser usada oficialmente em<br />
1987 pelo Governo do Brasil (BRASIL. MS/SUCAM/DR.PA, 1986). A ocorrência da<br />
pressão da mefloquina sob a população de parasitos circulantes pelo uso facilitado<br />
com o comércio livre clandestino, principalmente nos garimpos, pode ter provocado<br />
seleção de parasitos menos sensíveis. Ainda que a mefloquina faça parte do<br />
esquema terapêutico como droga de segunda escolha para o tratamento de malária<br />
falciparum no Brasil, o emprego rotineiro desse medicamento tem sido usual em<br />
alguns estados.<br />
Com base nas informações das avaliações recentes de resistência dos<br />
plasmódios divulgadas pela RAVREDA, as médias das IC50 de 40,03 nM e IC50 de<br />
38,88 nM à mefloquina obtidas pelos métodos ELISA HRP2 e Microteste/OMS,<br />
respectivamente não guardam relação com o nível da resistência in vivo do P.<br />
falciparum ao fármaco dos estudos de eficácia desenvolvidos na Bacia Amazônica.<br />
Estes mostraram à resposta terapêutica dos parasitos ao antimalárico foi satisfatória<br />
apresentando baixo percentual de fracassos terapêuticos (4,3%). O alto nível de<br />
resistência in vitro observado no presente estudo guardada semelhança com os<br />
observados em relatório do MS recentemente divulgado (42,8%) (BRASIL, 2005).
70<br />
Para Di Santi et al. (1988), o fato da meia-vida de eliminação da mefloquina<br />
ser longa (21 dias) tornar-se importante fator na seleção de cepas resistentes. O uso<br />
generalizado da mefloquina provavelmente poderá acelerar o desenvolvimento da<br />
resistência como ocorreu no sudeste da Ásia (FONTANET et al., 1993). A taxa de<br />
fracasso terapêutico da mefloquina como monoterapia em regiões de fronteira na<br />
Ásia (Tailândia/Camboja e Myanamar/Tailândia), excede a 50%, principalmente<br />
como resistência de nível I e II (WERNSDORFER, 1998).<br />
O uso isolado da mefloquina em algumas áreas da Amazônia Brasileira, como<br />
na cidade de Manaus, bem como o seu emprego indistintamente para qualquer caso<br />
de malária falciparum, sem respeitar a sua indicação como droga de segunda<br />
escolha, pode ter contribuindo para a maior tolerância dos parasitos ao fármaco.<br />
Sabe-se que pela comodidade posológica a mesma é usada mais freqüentemente<br />
do que é recomendado, e é mais aceitável pelos pacientes em virtude de não<br />
apresentar tantos efeitos indesejados.<br />
A utilização de ferramentas moleculares no mapeamento da<br />
quimiorresistência da malária está ainda numa fase inicial. Na última década, os<br />
progressos no conhecimento molecular da resistência do P. falciparum a diversos<br />
antimaláricos foram significativos, devido à decodificação do genoma do P.<br />
falciparum (GARDNER et al., 2002). Mutações nos genes Pfdhfr e Pfdhps foram<br />
assosciadas à resistência à SP (sulfadoxina-pirimetamina), enquanto que as<br />
mutações nos genes Pfcrt à resistência à cloroquina. Os polimorfismos no Pfmdr1<br />
parecem alterar a suscetibilidade dos parasitos à mefloquina, quinino e cloroquina.<br />
Embora os marcadores moleculares não tenham sido objetos deste estudo, a
71<br />
aplicação dessa ferramenta é de real importância para a compreensão dos<br />
mecanismos de resistência da droga, na definição concreta dos perfis do<br />
P. falciparum aos antimaláricos e no planejamento de estratégias no controle da<br />
malária e na padronização do uso de antimaláricos.<br />
Como observado, a aplicação do ensaio imunoenzimático ELISA HRP2 de<br />
sensibilidade do P. falciparum às drogas antimaláricas neste experimento, poderia<br />
ser recomendada em estudos epidemiológicos, na medida em que a técnica<br />
demonstrou ser sensível rápida e de simples execução, sendo adaptada às<br />
exigências de laboratórios individuais sem dificuldades, podendo ser empregada<br />
com diferentes densidades de parasitemias. O procedimento da cultura do<br />
plasmódio é semelhante ao microteste (OMS). O método ELISA apresenta a<br />
vantagem por ser automatizado, o cultivo dos parasitos, em diferentes<br />
concentrações de antimaláricos, pode ser realizado in loco e a placa de<br />
experimentação pode ser congelada e enviada posteriormente para um laboratório<br />
de referência. Como observações desvantajosas constatadas, o método enzimático<br />
apresenta um custo elevado de aquisição, a dificuldade no processo de importação,<br />
a manutenção dos kits dos anticorpos monoclonais inalterados frente às variações<br />
de temperatura e umidade no seu transporte e acondicionamento local e a<br />
necessidade de uma leitora de ELISA, nem sempre disponível em laboratórios de<br />
pequeno porte.<br />
A despeito da variedade de métodos empregados nos estudos publicados,<br />
tem se observado uma mudança do perfil de sensibilidade in vitro do P. falciparum<br />
aos antimaláricos utilizados na Amazônia Brasileira. Contudo, evidencia-se a
72<br />
necessidade de se rever o limiar in vitro da sensibilidade das cepas de plasmódio às<br />
drogas na região amazônica brasileira, em concordância com Di Santi et al. (1988),<br />
Couto et al. (1995) e Zalis, et al. (1998).<br />
Uma amostragem maior de isolados a serem avaliados pela RAVREDA, os<br />
estudos de monitoramento da resistência às drogas antimaláricas em toda a Região<br />
Amazônica, utilizando protocolos padronizados para avaliação in vitro da<br />
sensibilidade dos parasitos aos medicamentos, possibilitarão o esclarecimento de<br />
algumas situações particulares, como as observadas em nosso estudo e por outros<br />
pesquisadores. Será possível futuramente se estabelecer parâmetros de<br />
comparação entre os países signatários da Rede.
73<br />
6. CONCLUSÃO<br />
1. Com base na concentração mínima inibitória pelo microteste (OMS), a<br />
resistência do P. falciparum foi de 22,8% e 42,8% ao quinino e à<br />
mefloquina respectivamente.<br />
2. Com base na concentração de inibição 50% pelo microteste (OMS), a<br />
resistência do P. falciparum ao quinino foi de 37,2% e à mefloquina de<br />
54,3% , com a média da IC50 de 246,5 nM e 38,9 nM respectivamente<br />
3. Pelo ELISA HRP2, a resistência do P. falciparum ao quinino foi de<br />
31,4% e à mefloquina de 45,7%, com a média da IC50 de 225,19 nM e<br />
40,03 nM respectivamente.<br />
4. Os níveis de IC50 determinados pelo ELISA-HRP2 apresentaram alta<br />
correlação com os determinados pelo microteste (OMS).<br />
5. O teste de sensibilidade pelo método do ELISA HRP2 demonstrou<br />
vantagens operacionais, tais como:<br />
• Fácil execução técnica.<br />
• Possibilidade de análises de múltiplas amostras<br />
simultaneamente em curto período de tempo.<br />
• Conveniência de armazenamento da placa de cultura a –20ºC<br />
a<strong>pós</strong> a fase de incubação por longo período.<br />
• Não utilização de material radioativo.<br />
• Semi-automação, evitando os riscos de falha humana na<br />
interpretação dos resultados.<br />
• Fácil adaptação às exigências de laboratórios individuais.
74<br />
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Characterization of Plasmodium falciparum isolates from Amazon region of Brazil:<br />
evidence for quinine resistance. American Journal of Tropical Medicine and<br />
Hygiene. 58: 630-37, 1998.<br />
87
8. ANEXOS<br />
88
89<br />
ANEXO A<br />
Código:......................<br />
..<br />
TERMO DE CONSENTIMENTO INFORMADO LIVRE E ESCLARECIDO AO<br />
PACIENTE<br />
“AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE in vitro DO Plasmodium falciparum AOS<br />
ANTIMALÁRICOS PELA CAPTAÇÃO DA PROTEINA RICA HISTIDINA 2”<br />
Patrocinador: Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMTAM)<br />
Universidade do Estado do Amazonas (UEA)<br />
Equipe responsável:<br />
Orientadora: Profª Drª MARIA DAS GRAÇAS ALECRIM<br />
Co-orientadores: Profª Drª MARIA DAS GRAÇAS BARBOSA<br />
Prof MSc. WILSON DUARTE ALECRIM<br />
Mestranda: <strong>Yonne</strong> <strong>Francis</strong> <strong>Chehuan</strong> <strong>Melo</strong><br />
DESCRIÇÃO E OBJETIVO DO ESTUDO<br />
Este é um estudo que estamos fazendo na Fundação de Medicina Tropical<br />
(FMTAM), com o objetivo de estudar, in vitro, a sensibilidade do Plasmodium<br />
falciparum as drogas antimaláricas em pacientes atendidos na Fundação de<br />
Medicina Tropical do Amazonas (FMT/AM).<br />
Para isso, é preciso que sejam colhidos 5 mL de sangue da veia do antibraço<br />
para se realizar exames de sangue. Os possíveis desconfortos e riscos, se<br />
ocorrerem, são aqueles relacionados com a retirada de sangue, como dor local<br />
e/ou hematoma (“rouxidão”) no local da punção, com duração de 3 a 4 dias. A<strong>pós</strong><br />
a coleta o (a) paciente será atendido pelo médico.<br />
BENEFÍCIOS:<br />
Participando desse estudo o (a) paciente não receberá qualquer benefício<br />
adicional, nem ganhará dinheiro, mas estará contribuindo para o conhecimento<br />
científico da malária.<br />
Todos os cuidados apropriados serão tomados, como o uso de seringa,<br />
agulha e gaze descartável assim como álcool para assepsia local, entre outros.
90<br />
Em caso de prejuízo ou dano a saúde decorrente da pesquisa, a<br />
responsabilidade indenizatória caberá ao coordenador do estudo e a Fundação de<br />
Medicina Tropical do Amazonas.<br />
O (a) paciente receberá informações sobre os mecanismos de transmissão<br />
da doença e as formas de evitar uma nova infecção.<br />
QUEM VAI FICAR SABENDO DO RESULTADO DOS EXAMES?<br />
A participação nesse estudo será confidencial e os resultados dos exames<br />
serão mostrados as pessoas da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas que<br />
trabalham com malária ou pesquisadores de outras cidades ou países, mas o nome<br />
da pessoa que participa nunca será revelado.<br />
O QUE ACONTECE SE O PACIENTE QUISER DESISTIR DE PARTICIPAR DA<br />
PESQUISA?<br />
A pessoa que participa da pesquisa tem todo o direito de desistir a qualquer<br />
momento do estudo. E mesmo que isso aconteça, a pessoa será tratada e terá um<br />
médico para atendê-la sempre que for possível.<br />
NENHUM PESQUISADOR PODE DEIXAR DE TRATAR BEM O PACIENTE QUE<br />
NÃO QUEIRA PARTICIPAR DA PESQUISA !!!!<br />
O PACIENTE GUARDARÁ ALGUM PAPEL DIZENDO QUE PARTICIPOU DA<br />
PESQUISA?<br />
A pessoa que aceitar participar da pesquisa guarda uma cópia deste<br />
documento que será assinado duas vezes, uma cópia fica com o pesquisador e a<br />
outra com o paciente.<br />
E O QUE FAZER SE ACONTECER ALGUMA COISA COM O PACIENTE DEPOIS<br />
DA PESQUISA?<br />
A Dra. YONNE FRANCIS C. MELO, cujo número de telefone é 238-1711<br />
(ramal 219), terá disponibilidade para atender e esclarecer quaisquer dúvidas.
91<br />
CONSENTIMENTO PÓS-INFORMAÇÃO:<br />
Eu,.....................................................................................................................,<br />
recebi a explicação de que serei um (a) dos (as) participantes dessa pesquisa. Se<br />
eu não souber ler ou escrever, uma pessoa de minha confiança lerá este<br />
documento para mim e depois escreverá nesta página o meu nome.<br />
E por estar devidamente informado e esclarecido sobre o conteúdo deste<br />
termo, livremente, sem qualquer pressão por parte dos pesquisadores, expresso<br />
meu consentimento para minha inclusão nesta pesquisa.<br />
Data......../......./.........<br />
......................................................................<br />
Assinatura do (a) paciente ou representante legal<br />
Impressão do polegar direito do (a) paciente,<br />
caso esta não saiba escrever seu nome.<br />
................................................................................ ..........<br />
Nome do pesquisador que conversou com o (a) paciente<br />
............................................................................................<br />
Assinatura do pesquisador que conversou com o (a) paciente
ANEXO B<br />
92
ANEXO C<br />
93
ANEXO D – HN- NonLin V.1.05 Beta<br />
94