PCR Mycoplasma Detection Set

製 品 コード 6601
PCR Mycoplasma Detection Set
説 明 書
v201103Da

本 セットは、 培 養 細 胞 等 のバイオ 材 料 に 夾 雑 するマイコプラズマを PCR 法 を 用 いて 検 出 するための
Primer セットです。マイコプラズマを 検 出 する 際 、 従 来 の 培 養 法 では 1 週 間 を 要 していましたが、 本
セットを 用 いて PCR を 行 うことで、 数 時 間 で 判 定 結 果 を 得 ることができます。また 判 定 は、PCR の 増
幅 バンドを 電 気 泳 動 で 確 認 することにより 行 えますので、RI 等 で 標 識 したプローブを 用 意 する 必 要 もあ
りません。 本 セットは、 培 養 細 胞 によく 見 い 出 されるものをはじめとして、 少 なくとも Mycoplasma 属
中 の 11 種 (M. fermentans, M. hyorhinis, M. arginini, M. orale, M. salivarium, M. hominis, M. pulmonis,
M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae, M. capricolum)および Ureaplasma 属 中 の 1 種
(U. urealyticum)を 感 度 よく 検 出 することができるようデザインされています。
なお、 本 セット 中 には PCR に 必 要 な DNA Polymerase, dNTP は 含 まれておりません。 本 セットは
TaKaRa Taq(dNTP Mixture, 10×PCR Buffer 添 付 )、TaKaRa Ex Taq®(dNTP Mixture, 10×Ex Taq Buffer
添 付 )との 使 用 により 最 高 の 効 率 が 得 られるようにデザインされています。
I. 内 容 (100 反 応 分 ;50 μl 反 応 系 )
1.MCGp F1 Primer(20 pmol/μl)
2.MCGp R1 Primer(20 pmol/μl)
3.MCGp F2 Primer(20 pmol/μl)
4.MCGp R2 Primer(20 pmol/μl)
5.Control Template(1 ng/μl)
50 μl
50 μl
50 μl
50 μl
50 μl
【 関 連 製 品 】 TaKaRa Taq( 製 品 コード R001A/B/C)
TaKaRa Taq Hot Start Version( 製 品 コード R007A)
(dNTP Mixture, 10 × PCR Buffer 付 )
TaKaRa Ex Taq®( 製 品 コード RR001A/B/C)
TaKaRa Ex Taq® Hot Start Version( 製 品 コード RR006A)
(dNTP Mixture, 10 × Ex Taq Buffer 付 )
II. 保 存 − 20℃
III. 原 理
rRNA 塩 基 配 列 はマイコプラズマを 含 め、 原 核 生 物 の 間 で 非 常 によく 保 存 されている。こ
れに 対 して rRNA オペロン 上 の rRNA をコードする DNA 間 のスペーサー 領 域 、 例 えば 16S
と 23S 間 の 領 域 の 長 さおよび 配 列 は、 生 物 種 によって 大 きく 異 なっている。このスペー
サー 領 域 は、マイコプラズマのそれぞれの 種 間 でもかなり 異 なる 部 分 もあるがよく 保 存 さ
れている 配 列 も 存 在 する 1, 2) 。 本 セットを 用 いた PCR 法 による 検 出 システムでは、このス
ペーサー 領 域 を、16S と 23S の rRNA をコードする DNA 上 の 2 つのプライマー F1 と R1
を 用 いて 増 幅 した 後 、この 保 存 配 列 に 基 づいてデザインされたプライマー( 図 1 の F2)
と 23S DNA 上 のプライマー R2 を 用 いて Nested PCR を 行 う。この 系 を 用 いれば PCR 反
応 系 に 混 入 してくる 培 養 細 胞 等 の 他 の 生 物 種 由 来 の DNA に 影 響 されずにマイコプラズマ
の DNA のみを 特 異 的 に 増 幅 することができるので、マイコプラズマ 検 出 の 感 度 及 び 特 異
性 を 上 げることができる。 表 1 に 本 セットの 中 に 含 まれている 4 つのプライマー 配 列 と、
これに 対 応 する 12 種 のマイコプラズマの 16S-Spacer-23S 領 域 中 の 配 列 を 示 す。
図 1.PCR 法 によるマイコプラズマの 検 出 原 理
タカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 2
製 品 コード 6601

表 1.プライマー 配 列 と、それに 対 応 するマイコプラズマ DNA 上 の 配 列
F1 R1 F2 R2
5' ACACCATGGGAGC TGGTAAT 3' 5' C T T CAT CGAC T T T CAGA - CCCAAGGCAT 3' 5' GT T C T T TGAAAAC TGAAT 3' 5' GCAT CCACCAAAAAC T C T 3'
T C T T
M. fermentans • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • A • • • • • • • T • • • • - • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • C • A • • • • •
M. hyorhinis • • • • • • • • • • • • T • • • • • • • • • • • A • • • • • • • T • • • • - • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • A • T • • • • •
M. orale • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • T • • • • • • • T • • • • - • • • • • • • • • • A • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • A • A • • • • •
M. hominis • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • T • • • • • • • T • • • • - • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • A • A • • • • •
M. salivarium • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • T • • • • • • • T • • • • - • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • A • A • • • • •
M. arginini • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • A • • • • • • • C • • • • - • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • A • A • • • • •
M. capricolum • • • • • • • • A • • • T • • • • • • • • • • • T • • • G • • - C • • T T T T • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • T • • • • • T • TG • • • •
M. arthritidis • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • A • • • • • • • C • • • • - • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • A • A • • • • •
M. neurolyticum • • • • • • • • • • • • T • • • • • • • • • • • A • • • • • • • C • • • • - • • • • • • • • • • A • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • T • T • T • • • • •
M. pulmonis • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • T • • • • • • • C • • • • - • • • • • • • • • • • • • • • • • A • • • • • • • • • • • • • • • • • • T • C • A • • • • •
M. hyopneumoniae • • • • • • • • • • • • T • • • • • • • • C • • A • • • • • • • T • • • • - • • • • • • • • • • • C • • • • • C • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • A • T • • • • •
U. urealyticum • A • • T • • • • • • • • • • • • • • • • • • • A • • • C • • G T T T • T - • • • • • • • • • • • A • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • T • • • • • T • AG • • • •
E. coli • • • • • • • • • • • • TG • • • TGC • • • • A • • • C • • C TG • C T - G • • • G • • • • • - - - - - - - - - - - - - - - - - - • • • • • • • • • GTGT • • G • •
B. subtilis • • • • • • C • A • • • T • T • • • • C • • • • A • • • G • • C C T • • T - G • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • AG • • • • • • • • • • • GTGCG • C • •
ドット(・)はプライマー 配 列 と 同 じ 塩 基 であることを 示 す。
(-)はプライマー 配 列 の 塩 基 がないことを 示 す。
タカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 3
製 品 コード 6601

IV. 操 作
マイコプラズマ 検 出 用 のサンプルには、 継 代 後 、3 ~ 6 日 間 細 胞 培 養 を 行 った 培 養 上 清
を 用 いてください。Eagle 等 、 通 常 の 培 養 細 胞 用 培 地 を 用 いた 場 合 、 培 養 上 清 を 直 接 PCR
の 反 応 系 に 加 えマイコプラズマの DNA を 増 幅 させることが 出 来 ます。 添 加 する 培 養 上 清
の 量 は 反 応 系 の 1/10 までとしてください。 細 胞 懸 濁 液 をサンプルとする 場 合 は、いった
ん DNA を 抽 出 回 収 し、PCR 反 応 に 使 用 してください。サンプル 中 に PCR 反 応 の 阻 害 物 質
が 含 まれているおそれがある 場 合 は、マイコプラズマの 検 出 が 正 確 に 行 われない 可 能 性
があります。 阻 害 物 質 が 含 まれているかどうかを 確 認 するためには、サンプルに Control
Template を 加 えたものを 用 いて Control 実 験 を 行 ってください。もし、バンドの 増 幅
が 見 られない 場 合 には、サンプルから DNA を 抽 出 し PCR 反 応 に 使 用 してください。(D.
Control 実 験 参 照 )
A.1st PCR
1. 以 下 の 手 順 で 試 薬 を 加 えて 混 合 し、 反 応 液 を 準 備 する。
H2O
34.75 ~ 39.25 μl
10 × PCR Buffer(or 10 × Ex Taq Buffer) 5 μl
dNTP Mixture
4 μl
MCGp F1 Primer
0.5 μl
MCGp R1 Primer
0.5 μl
TaKaRa Taq(or TaKaRa Ex Taq®)
0.25 μl
2.1 の 反 応 液 を 混 合 する(ミネラルオイルが 必 要 な 場 合 は、 適 宜 重 層 する。)
3.クロスコンタミを 起 こさないように 注 意 しながら PCR 反 応 液 量 が 50 μl にな
るようにサンプル(5 μl 以 下 )を 反 応 系 に 加 える。
4.サーマルサイクラーを 以 下 の 条 件 に 設 定 し、PCR を 行 う。
94℃ 30 sec
↓
94℃ 30 sec
55℃ 2 min 30 ~ 35 cycles
72℃ 1 min
B.2nd PCR
1. 以 下 の 手 順 で 反 応 液 を 調 製 する。
H2O
39.25 μl
10 × PCR Buffer(or 10 × Ex Taq Buffer) 5 μl
dNTP Mixture
4 μl
MCGp F2 Primer
0.5 μl
MCGp R2 Primer
0.5 μl
TaKaRa Taq(or TaKaRa Ex Taq®)
0.25 μl
2.1 の 反 応 液 を 混 合 する(ミネラルオイルが 必 要 な 場 合 は、 適 宜 重 層 する。)
3.クロスコンタミを 起 こさないように 注 意 して、1st PCR の 反 応 産 物 を 0.5 μl 加
える。
4.サーマルサイクラーを 以 下 の 条 件 に 設 定 し、PCR を 行 う。
94℃ 30 sec
↓
94℃ 30 sec
55℃ 2 min 30 ~ 35 cycles
72℃ 1 min
タカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 4
製 品 コード 6601

C. 増 幅 産 物 の 電 気 泳 動 による 解 析
1. 反 応 終 了 後 1st、および 2nd PCR の 反 応 産 物 より 各 10 μl をとり、 電 気 泳 動 に
供 する。
2. アガロースゲル 電 気 泳 動 により 増 幅 断 片 の 有 無 、およびその 大 きさ * をチェッ
クする。1st PCR の 反 応 産 物 は、 例 えば 1% アガロースゲル [Agarose L03
「TAKARA」( 製 品 コード 5003)など ] を 用 いて 解 析 を 行 う。2nd PCR の 反 応 産
物 は、2 ~ 4%の NuSieve® 3:1 Agarose( 製 品 コード 50091)を 用 いて 解 析 を 行 う。
*: 表 2 に 12 種 のマイコプラズマの DNA をそれぞれ 鋳 型 とし、2 種 のプライ
マー 対 を 用 いて 増 幅 を 行 った 場 合 の 増 幅 断 片 の 大 きさを 示 す。
表 2.12 種 類 のマイコプラズマ 属 における 増 幅 断 片 の 大 きさ
F1 and R1(bp) F2 and R2(bp)
M. hyopneumoniae 681 237
M. neurolyticum 501 196
M. fermentans 491 195
M. pulmonis 477 189
M. hyorhinis 448 211
M. orale 423 179
M. capricolum 415 179
M. arthritidis 408 157
M. salivarium 403 151
M. hominis 370, 369 147, 148
M. arginini 369 145
U. urealyticum 482, 481 154
D.Control 実 験
Control Template(0.5 μl)をサンプル 中 に 加 えれば PCR がうまく 働 いている
こと、すなわち PCR の 反 応 阻 害 が 起 きていないことをチェックすることができる。
Control Template を 用 いた 場 合 には、F1 と R1 のプライマーで 810 bp、F2 と R2
のプライマーで 590 bp の DNA 断 片 が 増 幅 する。
注 意
1)Control Template 由 来 のバンドが 検 出 できない 場 合 は、サンプル 中 に
PCR の 阻 害 物 質 が 含 まれていると 考 えられるため、サンプルより DNA
を 抽 出 し、それを Template として 用 いてください。
2)Control Template は PCR 反 応 自 体 をチェックするためのものです。
Control Template を 加 えた 場 合 サンプル 中 にマイコプラズマが 含 まれて
いてもマイコプラズマ 由 来 のバンドが 検 出 できないことがありますので、
判 定 には 使 用 しないでください。
3)サンプル 中 に 多 量 のマイコプラズマが 含 まれている 場 合 には、マイコプ
ラズマ 由 来 のバンドのみが 検 出 され、Control Template 由 来 のバンドが
検 出 できない 場 合 があります。
4)Control Template は 人 工 的 に 作 成 したもので、 内 部 配 列 にマイコプラズ
マの 配 列 は 含 んでいません。
タカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 5
製 品 コード 6601

V.Application(Mycoplasma と Ureaplasma の PCR による 検 出 )
11 種 類 のマイコプラズマと、1 種 類 のウレアプラズマを 培 養 、DNA を 調 製 し、PCR 反 応
を 行 った(100 μl 反 応 系 で 実 施 )。ブランクとしてヒト DNA とマウス DNA をそれぞれ 鋳
型 とした PCR 反 応 も 同 時 に 行 った。
【 結 果 】
1st PCR
2nd PCR
Lane M:pHY Marker
1:M. hyopneumoniae
2:M. neurolyticum
3:M. fermentans
4:M. pulmonis
5:M. hyorhinis
6:M. orale
7:M. capricolum
8:M. arthritidis
9:M. salivarium
10:M. hominis
11:M. arginini
12:U. urealyticum
13:human DNA
14:mouse DNA
1st PCR だけのマイコプラズマの 検 出 限 界 は、M. capricolum で 1 ng、M. hyopneumoniae
と U. urealyticum で 100 pg、その 他 のマイコプラズマで 10 pg であった。ただし、ヒト・
マウス DNA 100 ng を 用 いると、 非 特 異 的 バンドが 現 われた。
2nd PCR を 行 った 場 合 のマイコプラズマの 検 出 限 界 は、M. capricolum と M. hyopneumoniae
で 100 fg、その 他 のマイコプラズマで 10 fg であった。 一 方 、ヒト・マウス DNA 100 ng を
鋳 型 にしても、 非 特 異 的 バンドは 認 められなかった。
VI.Q&A
Q 1. 培 養 上 清 をサンプルとして 使 用 したいのですが、どのような 培 地 が 使 用 可 能 です
か?
A 1. タカラバイオでは、TaKaRa Ex Taq ®、TaKaRa Taqを 使 用 して 以 下 のような 結 果 を
得 ています。
1. 10% FCS 含 有 の DMEM、RPMI 培 地 を 用 いて、 継 代 後 、3 ~ 6 日 間 細 胞 培
養 を 行 った 培 養 上 清 について、 培 養 上 清 を 直 接 PCR の 反 応 系 に 1/10 量 加
えマイコプラズマの DNA を 増 幅 させることが 可 能 でした。
2. FCS 原 液 を 直 接 PCR 反 応 系 に 1/10 量 加 えて 反 応 阻 害 を 起 こらないことを 確
認 しました。
Q 2. ヒト 肺 炎 のマイコプラズマ(M. pneumoniae)は 検 出 できますか?
A 2. できません。
タカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 6
製 品 コード 6601

VII. 参 考 文 献
1) Uemori, T., Asada, K., Kato, I. and Harasawa, R. (1992) System. Appl. Microbiol. 15, 181-
186.
2) 上 森 隆 司 、 浅 田 起 代 蔵 、 加 藤 郁 之 進 、 原 澤 亮 (1991) マイコプラズマ 研 究 、 第 18 回 日
本 マイコプラズマ 学 会 記 録 , 29-31.
VIII. 注 意
・ 本 製 品 は 研 究 用 として 販 売 しております。ヒト、 動 物 への 医 療 、 臨 床 診 断 用 には 使 用 し
ないようご 注 意 ください。また、 食 品 、 化 粧 品 、 家 庭 用 品 等 として 使 用 しないでください。
・ タカラバイオの 承 認 を 得 ずに 製 品 の 再 販 ・ 譲 渡 、 再 販 ・ 譲 渡 のための 改 変 、 商 用 製 品 の
製 造 に 使 用 することは 禁 止 されています。
タカラバイオ( 株 )http://www.takara-bio.co.jp/ 7
製 品 コード 6601

v201103Da