ESTUDO DA INFLUÊNCIA DE PSICROTRÓFICOS AERÓBIOS E DE ...

As estirpes isoladas foram posteriormente ensaiadas para a pesquisa de factores de
patogenicidade, a qual se efectuou com recurso a testes de biologia molecular, na
Unidade de Enterobactérias do INSA, como já referido em 3.4.4.4.
3.4.4.10 – Método utilizado na pesquisa da toxina diarreica de
Bacillus cereus
Para pesquisa de toxina diarreica de B. cereus foi seguido o procedimento descrito na
bula apensa ao “kit” de detecção de toxinas BCET-RPLA, sendo seguida a
metodologia referente à pesquisa em fluidos de cultura. Para tal, inoculou-se uma
colónia isolada em meio Brain Heart Infusion (BHI) (Oxoid TM , Basingstone, Hampshire,
UK) (Anexo 31) que se incubou a 37 ºC ± 1 ºC durante 18 h. A cultura assim obtida, foi
centrifugada durante 20 min a uma velocidade de 900 g (Centrifuga KS-8000, Kubota
Corporation, Osaka, Japão). Entretanto, preparou-se uma micro placa de forma a que
cada fila tivesse 8 poços e cada 2 filas correspondessem a uma amostra. Distribuiu-se
25 μL de diluente em cada poço das 2 filas, excepto no primeiro poço. Adicionou-se 25
μL da amostra aos 1º e 2º poços de ambas as filas. Posteriormente, iniciando no 2º
poço de cada fila, fizeram-se diluições, transferindo sucessivamente 25 μL de cada
amostra, e deixou-se o ultimo poço apenas com diluente. A cada um dos poços da
primeira fila adicionaram-se 25 μL de látex sensibilizado e a cada um dos poços da
segunda fila adicionaram-se 25 μL de controlo de látex. Agitou-se manualmente a
placa, cobriu-se para evitar a evaporação e incubou-se em local livre de vibrações, à
temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC, neste laboratório) e durante 24 h.
3.5 – Contaminação das saladas com Listeria monocytogenes
3.5.1 - Preparação e determinação do inoculo a utilizar com Listeria
monocytogenes
Com o objectivo de definir a quantidade de L. monocytogenes (g/mL) a utilizar para
contaminação das saladas, de forma a obter contagens em placa da ordem de 10 2 a
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