ESTUDO DA INFLUÊNCIA DE PSICROTRÓFICOS AERÓBIOS E DE ...

um aquecimento entre 95 ºC a 100 ºC durante 15 min (± 1 min). Depois do tubo
arrefecido (operação que não deverá exceder os 30 min), colocaram-se 500 μL na
“barrete” contendo os reagentes do “kit” VIDAS E. coli O157 ECO, a qual foi colocada
no aparelho mini VIDAS ® para realização do ensaio. Os casos que se revelaram
positivos foram sujeitos a testes de confirmação e identificação. Assim, a partir do
meio CT-MacConkey, com o auxílio de uma ansa descartável, foi efectuado o
isolamento nos meios sólidos CT-SMAC e O157 H7 ID-F.
Nos casos em que os testes de confirmação não se revelaram coincidentes com o
resultado obtido no mini-VIDAS, realizou-se a concentração selectiva de E. coli O157
através do método de separação imunomagnética, utilizando para o efeito o “kit”
Dynabeads ® anti - E. coli O157 através do método de referência. Assim, retirou-se o
prato magnético do aparelho Dynal Magnetic Particle Concentrator ® MPC-S (Dynal
Biotech ASA, Oslo, Noruega) e colocaram-se os tubos de microcentrifugação de 1,5
mL (em número igual ao número de amostras) no referido aparelho. Resuspendeu-se
o Dynabeads anti - E. coli O157 no Vortex (Vortex-Genic, Scientific Industries, Inc.,
Bohemia, USA) e colocou-se
20 μL em cada um dos tubos, adicionando-se posteriormente 1 mL do meio CT-
MacConkey utilizado anteriormente. Após fecho dos tubos, inverteu-se o Dynal MPC-S
constantemente durante 10 min e inseriu-se novamente o prato magnético no
aparelho, inverteu-se novamente o Dynal MPC-S várias vezes, com o objectivo de
concentrar as esferas numa das paredes do tubo (isto é, na parede que se encontrava
encostada ao prato magnético). Depois de atingido este objectivo, os tubos foram
abertos e retiradas as amostras sobrenadantes. Retirou-se novamente o prato
magnético e adicionou-se a cada tubo 1 mL de tampão de lavagem, fechando-se os
tubos novamente e invertendo-se o Dynal MPC-S para resuspensão das esferas. Após
resuspensão tornou-se a colocar o prato magnético no aparelho e inverteu-se
novamente de forma contínua, tendo este procedimento a finalidade de concentrar as
esferas e tal como na fase anterior retirar o liquido sobrenadante dos tubos. Adicionouse
novamente 1 mL de tampão de lavagem a cada tubo e inverteram-se novamente
para resuspensão das esferas. Repetiu-se o procedimento acima indicado uma
terceira vez até chegada à fase de nova retirada de sobrenadante. Por fim, retirou-se o
prato magnético do Dynal MPC-S e resuspendeu-se o complexo Dynabeads-Bactéria
em 100 μL de tampão de lavagem sob agitação no Vortex. Após esta fase de
separação imuno-magnética (IMS), inoculou-se 0,1 mL da suspensão obtida nos
meios sólidos CT-SMAC e O157 H7 ID-F, sendo os meios incubados nas condições
anteriormente referidas.
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