FISIOLOGIA E METABOLISMO DA VIDEIRA CV. SYRAH NO ...

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A determinação do teor de proteína solúvel total foi realizada de
acordo com o método proposto por Bradford (1976) utilizando o mesmo extrato obtido para a
determinação dos açúcares. Como curva padrão utilizou-se a caseína (1 mg mL -1 ) e a leitura
foi feita por espectrofotometria no comprimento de 595 nm, sendo o teor de proteínas
expresso em μg g -1 MF.
3.4.5 Atividade das invertases (EC 3.2.1.26)
As atividades da invertase ácida do vacúolo (IAV), invertase ácida da
parede celular (IAP) e invertase neutra do citossol (INC) foram realizadas de acordo com
Nascimento et al. (1998) a partir da fase fenológica ‘L’, cacho fechado (BAILLOD e
BAGGIOLINI, 1993) durante o ciclo produtivo das plantas. Para as análises da atividade das
invertases foram coletadas folhas opostas ao cacho em diferentes plantas entre 8:00 e 9:00
horas da manhã, acondicionadas em sacos plásticos previamente identificados, armazenadas
em isopor, contendo gelo e levadas para o laboratório de Sementes e Fisiologia Vegetal da
Embrapa Semiárido, sendo armazenadas em freezer a -20 o C até os ensaios enzimáticos. As
folhas congeladas foram maceradas em tampão de extração constituído de tampão fosfato de
potássio, 50 mmol L -1 , pH 7,0; 0,7% de mercaptoetanol e 6% de MnSO 4 5mmol L -1 , na razão
de 1,0 g de material vegetal por 10 mL de tampão de extração, centrifugando a 15500 x g
durante 15 minutos. Coletou-se o sobrenadante para determinação da atividade da INC e IAV.
O precipitado resultante foi ressuspendido em 5mL da solução de extração, centrifugado
novamente e coletado o sobrenadante para determinação da atividade da IAP. Após a coleta
dos extratos enzimáticos, os mesmos foram congelados até a realização das análises. Os
ensaios das invertases foram realizados em meio de reação, constituído de 0,5 mL de extrato
enzimático; 2,5 mL de tampão fosfato de potássio 50 mmol L -1 , pH 7,0 para INC ou tampão
citrato de sódio 50 mmol L -1 , pH 5,0 para IAP e IAV e de 1,0 mL de sacarose 100 mmol L -1 ,
como substrato. O meio de reação foi mantido durante 30 minutos em banho-maria a 35 o C.
Foram retiradas alíquotas de 0,5mL para a determinação da atividade enzimática ao final de
cada tempo de reação (tempo 0= 10’ e tempo 1= 30’ após). Ao final do ensaio foi quantificado
o teor de açúcares redutores (AR) do meio de reação, pelo método do DNS. A atividade de