FISIOLOGIA E METABOLISMO DA VIDEIRA CV. SYRAH NO ...
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48 cujos teores de açúcares solúveis e insolúveis são produzidos em grande quantidade. Após a coleta das folhas foi preparado o extrato, onde pesou-se 1 grama da amostra, colocou-se 5mL de álcool etílico 80% e centrifugou-se a 3000 x g por 10 minutos, sendo repetido três vezes este processo; em seguida, coletou-se o sobrenadante que foi congelado em freezer a -20ºC, para posterior utilização para determinação de açúcares solúveis totais, açúcares redutores e proteína solúvel total. 3.4.2 Açúcares solúveis totais A quantificação dos teores de açúcares solúveis totais em μg g -1 de matéria fresca (MF) foi realizada durante o ciclo por espectrofotometria no comprimento de onda de 620 nm, utilizando-se curva padrão de glicose conforme metodologia descrita por Morris (1948) e Yemm e Willis (1954), onde o reagente de antrona provocou reação hidrolítica e desidratante sobre os carboidratos presentes nas folhas amostradas. As ligações glicosídicas foram hidrolisadas e os açúcares simples desidratados formando furfural ou hidroximetilfurfural. Essas substâncias se condensaram com a antrona (9,10-dihidro-9- oxoantraceno) dando um produto de coloração azul petróleo (SILVA et al., 2003). 3.4.3 Açúcares redutores Os açúcares redutores foram quantificados por espectrofotometria no comprimento de onda de 540nm, utilizando-se curva padrão de glicose e pelo método do ácido 3-5-dinitrossalicílico (DNS) proposto por Miller (1959). Os resultados obtidos foram expressos em μg g -1 MF. 3.4.4 Determinação do teor de proteína solúvel total
49 A determinação do teor de proteína solúvel total foi realizada de acordo com o método proposto por Bradford (1976) utilizando o mesmo extrato obtido para a determinação dos açúcares. Como curva padrão utilizou-se a caseína (1 mg mL -1 ) e a leitura foi feita por espectrofotometria no comprimento de 595 nm, sendo o teor de proteínas expresso em μg g -1 MF. 3.4.5 Atividade das invertases (EC 3.2.1.26) As atividades da invertase ácida do vacúolo (IAV), invertase ácida da parede celular (IAP) e invertase neutra do citossol (INC) foram realizadas de acordo com Nascimento et al. (1998) a partir da fase fenológica ‘L’, cacho fechado (BAILLOD e BAGGIOLINI, 1993) durante o ciclo produtivo das plantas. Para as análises da atividade das invertases foram coletadas folhas opostas ao cacho em diferentes plantas entre 8:00 e 9:00 horas da manhã, acondicionadas em sacos plásticos previamente identificados, armazenadas em isopor, contendo gelo e levadas para o laboratório de Sementes e Fisiologia Vegetal da Embrapa Semiárido, sendo armazenadas em freezer a -20 o C até os ensaios enzimáticos. As folhas congeladas foram maceradas em tampão de extração constituído de tampão fosfato de potássio, 50 mmol L -1 , pH 7,0; 0,7% de mercaptoetanol e 6% de MnSO 4 5mmol L -1 , na razão de 1,0 g de material vegetal por 10 mL de tampão de extração, centrifugando a 15500 x g durante 15 minutos. Coletou-se o sobrenadante para determinação da atividade da INC e IAV. O precipitado resultante foi ressuspendido em 5mL da solução de extração, centrifugado novamente e coletado o sobrenadante para determinação da atividade da IAP. Após a coleta dos extratos enzimáticos, os mesmos foram congelados até a realização das análises. Os ensaios das invertases foram realizados em meio de reação, constituído de 0,5 mL de extrato enzimático; 2,5 mL de tampão fosfato de potássio 50 mmol L -1 , pH 7,0 para INC ou tampão citrato de sódio 50 mmol L -1 , pH 5,0 para IAP e IAV e de 1,0 mL de sacarose 100 mmol L -1 , como substrato. O meio de reação foi mantido durante 30 minutos em banho-maria a 35 o C. Foram retiradas alíquotas de 0,5mL para a determinação da atividade enzimática ao final de cada tempo de reação (tempo 0= 10’ e tempo 1= 30’ após). Ao final do ensaio foi quantificado o teor de açúcares redutores (AR) do meio de reação, pelo método do DNS. A atividade de
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cujos teores de açúcares solúveis e insolúveis são produzidos em grande quantidade. Após a<br />
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para posterior utilização para determinação de açúcares solúveis totais, açúcares redutores e<br />
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3.4.2 Açúcares solúveis totais<br />
A quantificação dos teores de açúcares solúveis totais em μg g -1 de<br />
matéria fresca (MF) foi realizada durante o ciclo por espectrofotometria no comprimento de<br />
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Morris (1948) e Yemm e Willis (1954), onde o reagente de antrona provocou reação<br />
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Os açúcares redutores foram quantificados por espectrofotometria no<br />
comprimento de onda de 540nm, utilizando-se curva padrão de glicose e pelo método do ácido<br />
3-5-dinitrossalicílico (DNS) proposto por Miller (1959). Os resultados obtidos foram<br />
expressos em μg g -1 MF.<br />
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