Μέθοδοι προσδιορισμού κλασικής κλινικής χημείας
Μέθοδοι προσδιορισμού κλασικής κλινικής χημείας
Μέθοδοι προσδιορισμού κλασικής κλινικής χημείας
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
Σχολή Επαγγελμάτων Υγείας και Πρόνοιας<br />
Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων<br />
Συμπληρωματικές σημειώσεις <strong>κλινικής</strong> <strong>χημείας</strong><br />
<strong>Μέθοδοι</strong> <strong>προσδιορισμού</strong><br />
<strong>κλασικής</strong> <strong>κλινικής</strong> <strong>χημείας</strong><br />
ΠΕΤΡΟΣ Λ. ΚΑΡΚΑΛΟΥΣΟΣ<br />
Βιολόγος Msc, PhD, EurClinChem<br />
Τεχνολόγος Ιατρικών Εργαστηρίων<br />
ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΦΑΡΜΟΓΩΝ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ AΤΕΙ ΑΘΗΝΩΝ<br />
Έκδοση Πρώτη<br />
ΑΘΗΝΑ 2012
<strong>Μέθοδοι</strong> <strong>προσδιορισμού</strong> <strong>κλινικής</strong> <strong>χημείας</strong> Δρ. Π. Καρκαλούσου<br />
Βασικοί ορισμοί<br />
Εταιρείες <strong>κλινικής</strong> <strong>χημείας</strong> που παρέχουν τα πρότυπα <strong>κλινικής</strong> ενζυμολογίας<br />
SSCC = Scandinavian Federation of Clinical Chemistry<br />
SFBC = Société Française de Biologie Clinique<br />
IFCC = International Federation of Clinical Chemistry<br />
DGKC = Deutsche Gesellschaft für Klinische Chemie<br />
Factor. Συντελεστής πολλαπλασμού που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της<br />
δραστηρικότητας του ενζύμου πολλαπλασιαζόμενος με το ΔΑ/min.<br />
ΙU/L (Διεθνείς μονάδες ανά λίτρο). Μία διεθνής μονάδα (IU) είναι η ποσότητα του<br />
ενζύμου που καταλύει 1 μmol υποστρώματος σε 1 min.<br />
λ (μήκος κύματος). Μήκος κύματος μέτρησης της απορρόφησης της ενζυμικής<br />
αντίδρασης ισούνται με 340 nm όταν μετρώνται συνένζυμα (NAD + , NADH, NADPH,<br />
NADP + ) και με 405 nm όταν μετρώνται οργανικές ενώσεις.<br />
Προσδιορισμός γ-GT. Μέθοδος Szaz<br />
Η παρουσία του ενζύμου καταλύει την μεταφορά της ομάδας L-γ-Γλουταμύλο από το μόριο<br />
του L-γ-Γλουταμύλο 3-καρβόξυ 4-νιτρανιλίδιο (GLUPA-C) στο μόριο της γλυκυλογλυκίνης. Η<br />
αύξηση της απορρόφησης στα 405 nm οφείλεται στo παραγόμενο 5-άμινο-2-νίτροβενζοϊκο<br />
οξύ και είναι ανάλογη της δραστικότητας της γ-GT στο δείγμα.<br />
γ-GT<br />
L-γ-γλουταμυλο-3-καρβοξυ-4-νιτροανιλίδη + γλυκυλογλυκίνη =====<br />
L-γ-γλουταμυλο-γλυκυλογλυκίνη + 5-αμινο-2-νιτροβενζοϊκό οξύ<br />
Factor = 1158<br />
λ = 405 nm<br />
ΦΤ: Άνδρες: 11 – 49 (37 o C), Γυναίκες: 7 – 32 (37 o C)<br />
Προσδιορισμός GOT/AST. Μέθοδος IFCC<br />
Η παρουσία του ενζύμου καταλύει την μεταφορά μιας αμινομάδας από το μόριο του Lασπαρτικού<br />
στο μόριο του α-κετογλουταρικου οξέος. Το παραγόμενο οξαλοξικό οξύ<br />
παρουσία του ενζύμου μηλική αφυδρογονάση (MDH) ανάγεται προς L-μηλικό οξύ με<br />
ταυτόχρονη οξείδωση του συνενζύμου NADH σε NAD + . Η ελάττωση της απορρόφησης στα<br />
340 nm είναι ανάλογη της δραστικότητας της GOT στο δείγμα.<br />
AST<br />
α-κετογλουταρικό + L-ασπαρτικό === L-γλουταμικό + οξαλοξικό
<strong>Μέθοδοι</strong> <strong>προσδιορισμού</strong> <strong>κλινικής</strong> <strong>χημείας</strong> Δρ. Π. Καρκαλούσου<br />
MDH<br />
οξαλοξικό + NADH + H+ MDH===== L-μηλικό + NAD +<br />
Factor = 1746<br />
λ = 340 nm<br />
ΦΤ: < 45 U/L (37 o C)<br />
Προσδιορισμός GPT/ALT. Μέθοδος IFCC<br />
Η παρουσία του ενζύμου καταλύει την μεταφορά μιας αμινομάδας από το μόριο της Lαλανίνης<br />
στο μόριο του α-κετογλουταρικού οξέος. Το παραγόμενο πυροσταφυλικό οξύ<br />
παρουσία του ενζύμου γαλακτική αφυδρογονάση (LDH) ανάγεται προς L-γαλακτικό οξύ με<br />
ταυτόχρονη οξείδωση του συνενζύμου NADH σε NAD + . Η ελάττωση της απορρόφησης στα<br />
340 nm είναι ανάλογη της δραστικότητας της GPT στο δείγμα.<br />
ALT<br />
α-κετογλουταρικό + L-αλανίνη === L-γλουταμικό + πυροσταφυλικό<br />
LDH<br />
πυροσταφυλικό + NADH + H + === L-γαλακτικό + NAD +<br />
Factor = 1746 (37 o C) ή 952 (25 o C)<br />
λ = 340 nm<br />
ΦΤ: < 45 U/L (37 o C)<br />
Προσδιορισμός CK. Κινητική UV – NA. DGKV (N-ακετυλο-κυστείνης - NAC).<br />
H παρουσία του ενζύμου CK καταλύει την απόσπαση μιας φωσφορικής ομάδας από το<br />
μόριο της φωσφορικής κρεατίνης και το σχηματιζόμενο ATP με την βοήθεια του ενζύμου<br />
εξοκινάση (ΗΚ) οδηγεί σε φωσφορυλίωση της γλυκόζης. Η παραγόμενη 6-φωσφορική<br />
γλυκόζη παρουσία του ενζύμου αφυδρογονάση της 6-φωσφορικής γλυκόζης (G6P-DH)<br />
οξειδώνεται προς 6-φωσφορικό γλυκονικό οξύ με ταυτόχρονη αναγωγή του συνενζύμου<br />
NADP + σε NADPH. Η αύξηση της απορρόφησης στα 340 nm είναι ανάλογη της<br />
δραστικότητας της CK στο δείγμα.<br />
CK<br />
φωσφορική κρεατίνη + ADP === κρεατίνη + ATP<br />
HK<br />
γλυκόζη + ATP === 6-P-γλυκόζη + ADP<br />
G6P-DH<br />
6-P-γλυκόζη + NADP + ====== 6-P-γλυκονικό + NADPH + H +
<strong>Μέθοδοι</strong> <strong>προσδιορισμού</strong> <strong>κλινικής</strong> <strong>χημείας</strong> Δρ. Π. Καρκαλούσου<br />
Factor = 4207<br />
λ = 340 nm<br />
ΦΤ: Άνδρες: 25 – 195 U/L, Γυναίκες 24 – 170 U/L.<br />
Προσδιορισμός CK-MB. Ανοσοδέσμευση - Κινητική UV – NAC<br />
Η ανθρώπινη CK-MB αποτελείται από δύο υπομονάδες, CK-M και CK-B,οι οποίες διαθέτουν<br />
αμφότερες ενεργό κέντρο. Με τη βοήθεια ειδικών αντισωμάτων έναντι της CK-M, η καταλυτική<br />
δραστικότητα των υπομονάδων CK-M στο δείγμα αναστέλλεται κατά 99,6% χωρίς να<br />
επηρεάζονται οι υπομονάδες CK-B. Η δραστικότητα της υπόλοιπης CK-B, η οποία αντιστοιχεί<br />
στο ήμισυ της δραστικότητας της CK-MB, προσδιορίζεται με τη μέθοδο CK-NAC με<br />
πολλαπλασιασμό του αποτελέσματος επί 2.<br />
Factor = 4207<br />
λ = 340 nm<br />
ΦΤ:<br />
Προσδιορισμός ALP. DEA Buffer, DGKC (37 ο C)<br />
Η παρουσία του ενζύμου, σε αλκαλικό περιβάλλον 2-αμινο-2-μεθυλο-1-προπανόλης (AMP),<br />
καταλύει την υδρόλυση του υποστρώματος p-φωσφορική νιτροφαινόλη (pNPP) προς<br />
σχηματισμό της έγχρωμης ένωσης p-νιτροφαινόλη. Η αύξηση της απορρόφησης στα 405 nm<br />
είναι ανάλογη της δραστικότητας της ALP στο δείγμα.<br />
ALP<br />
φωσφορικό p-νιτροφαινύλιο + H2O ==== Η3PO4 + p-νιτροφαινόλη<br />
Factor = 2759<br />
λ = 405 nm<br />
ΦΤ: παιδιά 180 – 1200 U/L, ενήλικες 98 - 279 (37 ο C)<br />
Προσδιορισμός ALP. AMP Buffer, IFCC (37 o C)<br />
Η παρουσία του ενζύμου, σε αλκαλικό περιβάλλον 2-αμινο-2-μεθυλο-1-προπανόλης (AMP),<br />
καταλύει την υδρόλυση του υποστρώματος p-φωσφορική νιτροφαινόλη (pNPP) προς<br />
σχηματισμό της έγχρωμης ένωσης p-νιτροφαινόλη. Η αύξηση της απορρόφησης στα 405 nm<br />
είναι ανάλογη της δραστικότητας της ALP στο δείγμα.<br />
ALP<br />
φωσφορικό p-νιτροφαινύλιο + AMP ==== Η3PO4 + p-νιτροφαινόλη<br />
Factor = 2759
<strong>Μέθοδοι</strong> <strong>προσδιορισμού</strong> <strong>κλινικής</strong> <strong>χημείας</strong> Δρ. Π. Καρκαλούσου<br />
λ = 405 nm<br />
Άνδρες: 40 - 129 U/L (37 ο C)<br />
Γυναίκες: 35 - 104 U/L (37 ο C)<br />
Παιδιά: Έως ενός έτους: < 462 U/L (37 ο C)<br />
Από 1 έως 12 έτη: < 300 U/L (37 ο C)<br />
Από 13 έως 17 έτη αγόρια: < 390 U/L (37 ο C)<br />
κορίτσια: < 187 U/L (37 ο C)<br />
Προσδιορισμός LDH. P -> L, SFBC (37 ο C)<br />
Ρυθμιστικό διάλυμα Tris και υπόστρωμα πυροσταφυλικό. Παρουσία του ενζύμου LDH το<br />
πυροσταφυλικό οξύ ανάγεται προς L-γαλακτικό οξύ με ταυτόχρονη οξείδωση του συνενζύμου<br />
NADΗ σε NAD + . Η ελάττωση της απορρόφησης στα 340 nm είναι ανάλογη της δραστικότητας<br />
της LDH στο δείγμα.<br />
LDH<br />
Πυροσταφυλικό + NADH + H + ==== L-γαλακτικό + NAD +<br />
Factor = 8095<br />
λ = 340 nm<br />
ΦΤ: 240 – 470 nm<br />
Προσδιορισμός LDH. L -> P, DGKC (25 ο C)<br />
LDH<br />
L-γαλακτικό + NAD + ==== Πυροσταφυλικό + NADH + H<br />
Factor = 8095<br />
λ = 340 nm<br />
ΦΤ: 120 – 240 nm<br />
Προσδιορισμός AMYL. CNPG3, IFCC (37 ο C)<br />
Η δραστικότητα της αμυλάσης προσδιορίζεται κινητικά χρησιμοποιώντας σαν υπόστρωμα την<br />
ένωση 2 - chloro - p-νιτροφαινυλ - α-D-μαλτοτριοζίδιο (CNP-G3). Πλεονέκτημα αυτού του<br />
υποστρώματος είναι ότι αμφότερες οι αμυλάσες του ορού παγκρεατική (P-τύπος) και<br />
σιελογόνος (S-τύπος) αντιδρούν με την ίδια ταχύτητα και σχεδόν ποσοτικά (>95%). Η<br />
παρουσία του ενζύμου αμυλάση καταλύει την υδρόλυση του υποστρώματος CNP-G3 προς<br />
σχηματισμό της έγχρωμης ένωσης 2-χλώρο 4-νιτροφαινολη (CNP). Η αύξηση της<br />
απορρόφησης στα 405 nm είναι ανάλογη της δραστικότητας της αμυλάσης στο δείγμα.<br />
α-αμυλάση<br />
10 CNP-G3 --------------- 9 CNP + CNPG2 + 9G3 + G<br />
CNP: 2-χλώρο 4-νιτροφαινολη<br />
CNP-G3: 2 - chloro - p-νιτροφαινυλ - α-D-μαλτοτριοζίδιο
<strong>Μέθοδοι</strong> <strong>προσδιορισμού</strong> <strong>κλινικής</strong> <strong>χημείας</strong> Δρ. Π. Καρκαλούσου<br />
G: Γλυκόζη<br />
Factor = 3954 για ορό και 7908 ούρα.<br />
λ = 405 nm<br />
ΦΤ: 50 – 127 U/L<br />
Προσδιορισμός AMYL. PNPG3, IFCC (37 ο C) - Hitachi<br />
Η παρουσία του ενζύμου αμυλάση καταλύει την υδρόλυση του υποστρώματος 2-χλωρο 4νιτροφαινυλο<br />
α-D-μαλτροτριοζίδιο (CNPG3) προς σχηματισμό της έγχρωμης ένωσης 2χλώρο<br />
4- νιτροφαινολη (CNP). Η αύξηση της απορρόφησης στα 405 nm είναι ανάλογη της<br />
δραστικότητας της αμυλάσης στο δείγμα.<br />
α-αμυλάση<br />
5 αιθυλιδενο-G7PNP + 5 H2O --------------- 2 αιθυλιδενο-G5 + 2 G2PNP + 2<br />
αιθυλιδενο-G4 + 2 G3PNP + αιθυλιδενο-G3 + G4PNP<br />
Συγκεκριμένοι ολιγοσακχαρίτες, όπως η 4,6-αιθυλιδενο-(G7) p-νιτροφαινυλ-(G1)-α, Dμαλτοεπταοσίδη<br />
(αιθυλιδενο-G7PNP) διασπώνται υπό την καταλυτική δράση των ααμυλασών.<br />
Τα κλάσματα G2PNP, G3PNP και G4PNP που σχηματίζονται κατ’ αυτόν τον τρόπο<br />
υδρολύονται πλήρως προς p-νιτροφαινόλη και γλυκόζη από την α-γλυκοσιδάση.<br />
α-γλυκοσιδάση<br />
2 G2PNP + 2 G3PNP + G4PNP + 14 H2O -------------------- 5 PNP + 14 G<br />
(PNP = p-νιτροφαινόλη, G = γλυκόζη)<br />
Η ένταση του χρώματος της p-νιτροφαινόλης που σχηματίζεται είναι ευθέως ανάλογη της<br />
καταλυτικής δραστικότητας της α-αμυλάσης και μετράται φωτομετρικά.<br />
Προσδιορισμός ACP. Hillmann, IFCC (37 ο C)<br />
ACP<br />
α-ναφθόλ-φωσφατάση + Η2Ο ------- α-ναφθολ + Η3PO4<br />
α-ναφθόλ + Fast Red TR ----- Αζω-χρωστική<br />
Factor = 750<br />
λ = 405 nm<br />
ΦΤ: 50 – 127 U/L
Change language