INTEGRIDADE E FUNCIONALIDADE DOS ... - Ainfo - Embrapa

Revisão de Literatura 17
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seminal (CELEGHINI, 2005). Uma das primeiras tentativas do uso combinado
de sondas fluorescentes para o espermatozóide ovino foi relatada por Harrison
& Vickers (1990). Os referidos autores combinaram duas sondas fluorescentes
para avaliação da integridade de espermatozóides ovinos, o diacetato de
carboxifluoresceína (CFDA) e o iodeto de propídio (PI) e propuseram a
avaliação distinta de células vivas com acrossomo reagido daquelas vivas com
acrossomo intacto, assim como células mortas reagidas daquelas mortas não
reagidas, permitindo um exame direto de cada mudança em espermatozóides
vivos em suspensão. Os autores ainda relacionaram a coloração da peça
intermediária por CFDA à integridade das mitocôndrias.
O método de avaliação simultânea da integridade de membrana
plasmática e status acrossomal permite distinguir a célula com reação
acrossomal verdadeira daquela apresentando uma falsa reação acrossomal.
Nesse sentido, combinações duplas de sondas fluorescentes foram
inicialmente empregadas para distinguir simultaneamente os espermatozóides
viáveis ou não viáveis e o status acrossomal em ovinos (MEDINA, 1995;
VALCÁRCEL et al., 1997; SUKARDI et al., 1997).
Valcárcel et al. (1997) testaram duplas colorações em espermatozóides
ovinos envolvendo uma primeira etapa na qual as células eram marcadas com
o Hoechst 33258, seguida pela marcação com vários tipos de lecitinas
conjugadas à fluoresceína. Os referidos autores não obtiveram sucesso com o
uso do iodeto de propídio visto que o corante parecia difundir-se de células
coradas para células originalmente intactas. Segundo eles, o excesso de PI
presente nas células foi suficiente para marcar todas as células após o
procedimento de permeabilização com etanol utilizado na técnica o que
provavelmente não aconteceu com o Hoechst 33258. Sukardi et al. (1997)
sugeriram, que o excesso de PI no meio externo, precisava ser removido ou
diluído antes da permeabilização à FITC-PSA das células viáveis. Assim, eles
utilizaram um método de remoção do excesso de PI por meio da filtração que
segundo eles, aparentemente não provocou o estresse das membranas de
espermatozóides ovinos.
Tentando simplificar o uso combinado de sondas fluorescentes no
sêmen de bovino, Celeghini (2005) testou várias associações para avaliação