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Material e Métodos 79
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previamente aquecido à 32 o C, temperatura estabelecida como inicial para
todos os processamentos. A máquina foi programada para executar uma curva
de refrigeração a uma velocidade de 0,25°C/minuto até 5°C, sendo as palhetas
mantidas nessa temperatura até completar 120 minutos do início da
refrigeração (AZEVEDO et al., 2005). Antes de passar para a etapa de
congelação, uma palheta de cada tratamento foi removida para a realização
dos testes in vitro (Momento – sêmen refrigerado: S-RE).
A etapa de congelação era iniciada transferindo-se o cilindro contendo
as palhetas para imersão em nitrogênio líquido (N2L) e acionando-se o início da
curva de congelação automatizada correspondente a uma velocidade de queda
de temperatura na ordem de -20°C/minuto até atingir –120°C. Ao final do
processo as palhetas eram imersas no N2L, colocadas em raques previamente
identificadas e armazenadas em botijão criogênico até a sua descongelação.
3.7. Descongelação e Incubação do Sêmen
Esquema resumido da descongelação e incubação do sêmen pode ser
visualizado na Figura 6. Cinco palhetas, uma de cada grupo experimental,
foram descongeladas de cada um dos 25 carneiros, perfazendo um total de
125 amostras. As palhetas foram descongeladas em banho-maria a 42 o C por
20 segundos sendo o sêmen, transferido para microtubos de 1,5 mL
previamente aquecidos e mantidos à 37 o C e dos quais se removiam amostras
para as avaliações in vitro (Momento - sêmen congelado-descongelado: S-CD).
Uma amostra de sêmen de 88µL foi diluída na proporção de 1:1 em meio
sintético de oviduto (SOF – Anexo I), homogeneizada e incubada à 37 o C por
duas horas, e submetida após esse período às avaliações in vitro (Momento -
sêmen incubado: S-IN).
3.8. Avaliação do Sêmen
Esquema resumido da avaliação do sêmen pode ser visualizado nas
Figuras 4 e 6. Amostras de sêmen nos diferentes momentos (S-FR, S-RE, S-
CD e S-IN) foram submetidas aos testes in vitro como descrito a seguir.