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Material e Métodos 75
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3.5. Fracionamento, Diluição e Envase do Sêmen
O esquema de fracionamento, diluição e envase do sêmen está
demonstrado na Figura 4. Após a remoção das amostras para realização das
análises iniciais (Item 3.8), eram realizados os cálculos para fracionamento e
distribuição do sêmen em volumes iguais entre os cinco grupos experimentais
(C, TC, TD, TA e TL). As alíquotas de sêmen fracionado continham
aproximadamente 550 x 10 6 sptz e foram diluídas para se obter o equivalente a
5,5 doses inseminantes de 0,25 mL com 100 x 10 6 sptz cada o que
correspondia a uma concentração espermática final de 400 x 10 6
espermatozóides/mL.
A diluição foi realizada em três etapas (Figura 5) nas quais foram
adicionados ao sêmen, os componentes, frações e soluções que
representavam o volume final da diluição: sêmen + ST + meio diluidor
(FA+F1+F2). Na 1ª etapa da diluição o sêmen fracionado era transferido para
cinco tubos de ensaio mantidos em banho-maria (32 o C) que continham
previamente a FA do meio diluidor adicionada da ST correspondente a cada
grupo experimental. Para manter uma condição de igualdade, os volumes
adicionados das ST e FA eram os mesmos para todos os tratamentos dentro
do mesmo ejaculado sendo preservada a concentração dos aditivos ajustandose
o volume da FA de acordo com o volume da alíquota de sêmen. O volume
total dessa primeira etapa de diluição representava ¼ do volume final da
diluição. Após a cuidadosa e completa homogeneização do conteúdo de cada
tubo experimental, a mistura foi co-incubada por 15 minutos em banho-maria a
32 o C. Na 2ª etapa da diluição acrescentava-se vagarosamente aos tubos
experimentais a F1 do meio diluidor em um montante também correspondente
a ¼ do volume final da diluição completando-se assim ½ do volume final da
diluição ao final desta etapa (¼ da 1ª etapa + ¼ da 2ª etapa = ½). Realizada
uma cuidadosa homogeneização procedia-se a 3ª etapa da diluição
acrescentando-se suavemente a F2 do meio diluidor cuja quantidade
correspondia a ½ do volume final da diluição. Assim, após todas as etapas se
obtinha o volume total da diluição (¼ da 1ª etapa + ¼ da 2ª etapa + ½ da 3ª
etapa).