“Ecologia química de esponjas marinhas: multifuncionalidade ... - UFF

Biologia Marinha
Pós-Graduação - uff
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
CENTRO DE ESTUDOS GERAIS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MARINHA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA MARINHA
“Ecologia química de esponjas marinhas:
multifuncionalidade, variação congenérica,
intrapopulacional, latitudinal e estádios de vida”
SUZI MENESES RIBEIRO
2008
i

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
CENTRO DE ESTUDOS GERAIS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MARINHA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA MARINHA
“Ecologia química de esponjas marinhas:
multifuncionalidade, variação congenérica,
intrapopulacional, latitudinal e estádios de vida”
SUZI MENESES RIBEIRO
ORIENTAÇÃO
PROF. Dr. RENATO CRESPO PEREIRA
PROF a . Dr a . VALÉRIA LANEUVILLE TEIXEIRA
Niterói 2008
ii

SUZI MENESES RIBEIRO
“Ecologia química de esponjas marinhas:
multifuncionalidade, variação congenérica,
intrapopulacional, latitudinal e estádios de vida”
BANCA EXAMINADORA:
__________________________________________________
Prof. Dr. Renato Crespo Pereira
Universidade Federal Fluminense
__________________________________________________
Prof a . Dr a . Valéria Laneuville Teixeira
Universidade Federal Fluminense
___________________________________________________
Prof a Dr a. Gisele Lôbo Hajdu
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
__________________________________________________
Prof. Dr. Abílio Soares Gomes
Universidade Federal do Rio de Janeiro
___________________________________________________
Dr. Fernando Coreixas Moraes
Museu Nacional
Universidade Federal do Rio de Janeiro
____________________________________________________
Dr a. Diana Negrão Cavalcanti
Fundação Oswaldo Cruz
(Suplente)
ABRIL 2008
Tese apresentada ao Curso de Pós-
Graduação em Biologia Marinha da
Universidade Federal Fluminense
como requisito parcial para a obtenção
do grau de Doutor em Biologia
Marinha.
iii

R 484 Ribeiro, Suzi Meneses
Ecologia química de esponjas marinhas: multifuncionalida-
de, variação congenérica, intrapopulacional, latitudinal e está
-dios de vida./ Suzi Meneses Ribeiro.—Niterói, RJ : [s.n.] ,
2008.
132f
Tese—(Doutorado em Biologia Marinha)—Universidade
Federal Fluminense, 2008.
1. Poríferos. 2 Ecologia Química. 3. Tethya sp. 4. Compo-
sição química. I.Título.
CDD.: 593.4
iv

AGRADECIMENTOS
Agradeço ao Renato a orientação e todo apoio durante a execução desse
projeto. Agradeço a Valéria por me apresentar o “incrível mundo da química” e ter
paciência todas as vezes que precisei de muitas explicações. A Etiene Clavico por
ter me incentivado a iniciar o doutorado e também todo o apoio na finalização
dessa tese, mesmo que longe, via MSN. Obrigada!
Durante os quatro anos, foram muitas saídas de campo, seja para coletar ou
fazer experimentos e muitas pessoas me ajudaram, espero não ter esquecido de
ninguém: Patricia Oliveira Silva, Etiene Clavico, Daniela Lopes, Marquinhos, Svenja
Hampl, Bruno Lopes, Pedro Ribeiro, Amanda Ferreira, Mariana Melão, Camilla F.
Souza, Ricardo Rogers, Magui Vallin, Juliana Ferrari, Bernardo P. da Gama,
Ecidine Alves Barbosa (agradeço em especial as coletas em dias de chuva), Aline
Oliveira, Marcelo Vasconcelos, Wilton Ferreira, Fredy Ortiz, Gláucia Ank, Leonardo
Lima, Amanda Ferreira, Eduardo Xavier, Carlos Brito e a nova geração do Lab,
Rodrigo, Natália e Claudinha.
Agradeço a Ludmila Bomeny, Joel de Paula, Odinéia Pamplona, Éverson M.
Bianco que me ajudaram prontamente sempre que me senti perdida no laboratório
de química. Aprendi muito com vocês. Obrigada!
Ao Lab. de Ressonância Magnética (UFF), Lab. de Porifera (Museu
Nacional/UFRJ).
Alexandre Santos de Souza (IBAMA) pela identificação dos paguros, Diana
Calvalcanti (análises CG/MS), Prof. Keyla e Prof. Moisés (Instituto de Matemática,
Departamento de Estatística) pelas análises estatísticas.
Agradeço a minha família, José, Josefa, Pedro, Shele e Mariane por serem
pessoas maravilhosas.
v

A Eunice por todas (e foram muitas) vezes que apareci na secretaria
precisando de algo, em especial, a paciência momentos antes do meu estágio no
exterior quando eu não agüentava mais tantos papéis.
Ao Dr. Guilherme Muricy pela ajuda prestada sempre que precisei e por ter
sido meu grande incentivador na carreira científica.
Ao Dr.Mikel Becerro por me receber no Centro de Estudos Avançados de
Blanes (Catalunha, Espanha), a Dr. Ioshune Uriz, Adriana Villamor e Oriol Sacristan
(CEAB) por tanta ajuda nos trabalhos de campo que não daria para enumerar, Dr.
Cristobo e Dr a . Pilar (Galícia, ES) por serem pessoas tão maravilhosas além de
profissionais exemplares.
A Ana Lumbreras e Marc Terradas pela inestimável amizade e grande
torcida para finalização desse trabalho. Todos os meus amigos do CEAB, pessoas
tão especiais e que compartilharam comigo momentos que certamente nunca
esquecerei.
A Dulce Gilson Mantuano, pela inestimável amizade e pelas inumeráveis,
produtivas e engraçadíssimas discussões ao longo da vida. A Patrícia (minha irmã)
por me dar a alegria de sua amizade durante tantos anos...
Ao meus amigos de Marambaia: Ester, Viviane e Tiago. Sempre passo
ótimos momentos com vocês. Obrigada!
Agradeço ao Matthew J. Parker pelas figuras e revisão do inglês, além de ter
me suportado nos difíceis momentos finais da tese.
Agradeço a CAPES pela bolsa de doutorado e estágio de doutorando no
exterior (PDEE) que foram fundamentais na execução desse trabalho. A FAPERJ
pelos recursos do laboratório.
projeto.
Ao IBAMA por conceder as autorizações necessárias para execução desse
vi

SUMÁRIO
Ficha catalográfica............................................................................................ iv
Agradecimentos................................................................................................ v
Resumo............................................................................................................. ix
Abstract............................................................................................................. x
Lista de figuras ................................................................................................. xi
Lista de tabelas................................................................................................. xiv
Introdução geral.............................................................................................. 1
Esponjas marinhas e seu potencial químico.......................................... 1
Capítulo 1 - Perfil químico e defesas antipredação do gênero Tethya
(Porifera: Demospongiae).................................................................................
1. Introduçao............................................................................................ 12
2. Materiais e métodos............................................................................ 17
3. Resultados.......................................................................................... 26
4. Discussão............................................................................................ 46
5. Conclusões.......................................................................................... 52
Capítulo 2 – Variação intrapopulacional nos metabólitos de Tethya sp. e
perfil químico dos brotos...................................................................................
1. Introdução............................................................................................ 55
2. Materiais e métodos............................................................................ 58
3. Resultados.......................................................................................... 68
4. Discussão............................................................................................ 69
5. Conclusões.......................................................................................... 71
Capítulo 3 - Multifuncionalidade na química defensiva de Hymeniacidon
heliophila (Parker, 1910) contra predadores.....................................................
11
54
72
vii

1. Introduçao............................................................................................ 73
2. Materiais e métodos............................................................................ 75
3. Resultados........................................................................................... 78
4. Discussão............................................................................................ 82
5. Conclusões.......................................................................................... 85
Capítulo 4 - Variação latitudinal na produção de defesa química em
esponjas do Atlântico Sul, Atlântico Norte e Mediterrâneo...............................
1. Introduçao........................................................................................... 89
2. Materiais e métodos............................................................................ 93
3. Resultados........................................................................................... 96
4. Discussão............................................................................................ 98
5. Conclusões.......................................................................................... 107
Conclusões gerais........................................................................................... 108
Referências bibliográficas.............................................................................. 110
ANEXO I – Artigo: Variability on the defensive strategies of two Tethya
species (Porifera: Demospongiae)”, submetido ao periódico “Biological
Bulletin”
ANEXO II – Artigo: “Como as esponjas marinhas interagem no meio em que
vivem?”, aceito para publicação na revista “Ciência Hoje”
88
viii

RESUMO
As esponjas estão entre os organismos marinhos dos quais se têm extraído
diversos produtos naturais. Essa diversidade química estimulou o desenvolvimento
da ecologia química de esponjas, porém, poucos trabalhos investigaram a ecologia
química de esponjas na costa brasileira. Os objetivos desse trabalho foram: a)
descrever o perfil químico e as defesas antipredação químicas e físicas de duas
espécies do gênero Tethya; b) descrever a variação nos metabólitos secundários
da esponja Tethya sp.; c) descrever o perfil químico dos brotos de Tethya sp.; d)
investigar se extratos de Hymeniacidon heliophila com baixa, média e alta
polaridades reduzem o consumo de ouriços, peixes e paguros e e) avaliar a
existência de variação latitudinal na eficiência de defesa química contra o consumo
por peixes em esponjas de três regiões distintas (Atlântico Norte, Atlântico Sul e
mar Mediterrâneo). Em ensaios de laboratório, o extrato bruto de Tethya sp. evitou
a predação por paguros, o que não ocorreu com Tethya rubra. Em ambas espécies
as espículas e a combinação de espículas com extrato bruto foram defensivas. Os
três extratos brutos de Hymeniacidon heliophila foram repelentes a predação por
paguros, enquanto apenas o de alta polaridade evitou a predação por ouriços e o
de média polaridade, eficiente contra a predação por peixes generalistas. Concluiu-
se que esponjas com perfis químicos muito semelhantes (Tethya sp. e Tethya
rubra) podem apresentar distintas estratégias defensivas. A multiplicidade nas
defesas antipredação foram constatadas em extratos de Hymeniacidon heliophila.
Não foram encontradas tendências latitudinais em defesas químicas antipredação
contra peixes generalistas em esponjas do Mediterrâneo, Atlântico Norte e Atlântico
sul.
ix

ABSTRACT
Sponges are amongst a group of marine organisms from which many, diverse,
natural products have been extracted. This chemical diversity has stimulated the
development of the sponges’ chemical ecology, however, there have been few
works investigating the chemical ecology of sponges from the Brazilian coastline.
This work aims to: a) describe the chemical profile and the physical & chemical anti-
predatory defenses of two different Tethya species; b) describe the secondary
metabolite variations in Tethya sp.; c) evaluate the chemical profile of the buds of
Tethya sp.; d) investigate if extracts from Hymeniacidon heliophila, with low,
medium and high polarities can reduce consumption by sea urchins, fishes and
hermit crabs and e) evaluate the existence of latitudinal variation in the chemical
defense effectiveness of marine sponges in three distinct regions (North Atlantic,
South Atlantic and the Mediterranean). In laboratory tests, the crude extract of
Tethya sp. avoids predatory attacks from hermit crabs, whilst this does not happen
with Tethya rubra. In both Tethya species, the spicules and the combination of
spicules with crude extract, demonstrated defensive properties. Of the three crude
extracts of Hymeniacidon heliophila, all were a deterrent to hermit crabs. Only high
polarities defended against sea urchins, whilst medium polarity, was efficient in
defending against generalist fish. In conclusion even sponges with similar chemical
composition (Tethya sp. and Tethya rubra) may present different defensive
strategies. Multiple anti-predatory defenses were recorded in extracts of
Hymeniacidon heliophila. In related sponges from North Atlantic, South Atlantic and
the Mediterranean, consistent latitudinal inclination in anti-predatory chemical
defenses of sponges, against generalist fish, was not found.
x

LISTA DE FIGURAS
Capítulo 1
Figura 1 Esqueleto básico de um esterol do tipo colestano. 14
Figura 3
Exemplar de Tethya sp. (A) e Praia de Tarituba, Paraty - RJ (B).
Figura 4 Exemplar de Tethya rubra (A) e Ilha do Frade, Baía de Todos os
Santos – BA (B).
Figura 5 Indivíduos de paguros Calcinus tibicen (A) e Clibanarius antillensis
(B).
18
Figura 6 Praia de Itaipu (costão esquerdo), Niterói - Rio de Janeiro. 18
Figura 7 (A) Incorporação do gel a matriz quadriculada, (B) detalhe do
alimento após cortado na malha, contendo um controle e um
tratamento e (C) unidade experimental utilizada: pote plástico com
um paguro e alimento artificial.
Figura 8 (A) unidade experimental contendo um alimento controle e um
alimento tratamento, (B) molde em acrílico utilizado para obtenção
dos alimentos.
Figura 9
(A) limpeza das espículas a vácuo, (B) Espículas limpas.
Figura 10 Partição com funil de bromo realizada com os extratos brutos em
acetona de Tethya sp. e Tethya rubra.
Figura 11 Filtração com funil de Büchner realizada com o extrato bruto de
Tethya sp.
Figura 12 Cromatografia em camada delgada do extrato bruto em acetona
de Tethya sp. (A) e Tethya rubra (B). Eluente: AcOEt/ Hexano 1:1.
Figura 13 RMN 1 H (CDCl3, 300 MHz, TMS como referência interna) do
extrato bruto de Tethya sp. coletada em Parati (RJ) (acima) e
Tethya rubra coletada na Bahia (abaixo).
Figura 14 CG/MS do extrato bruto em acetona de T. rubra, BA (1,4
mg/1mL).
Figura 15 CG/MS do extrato bruto em acetona de Tethya sp., BA (1,4
mg/1mL).
Figura 16 Extrato bruto em acetona de T. rubra (à esquerda), padrão de
colesterol (ao meio) e extrato bruto em acetona de Tethya sp. (à
direita).
Figura 17
CCD das frações 1-63 de Tethya sp. Eluente: AcOt/Hexano 1:1
Figura 18
CCD das frações 1-41 Tethya rubra. Eluente: AcOt/Hexano 1:1
Figura 19 Estrutura dos principais esteróis detectados das espécies de
Tethya sp. (RJ) e Tethya rubra (BA).
Figura 20 Média de consumo de alimentos artificiais contendo extratos
brutos em acetona das esponjas Tethya sp. e Tethya rubra e dos
respectivos controles. N = número de réplicas. A barra vertical em
cada coluna corresponde ao desvio padrão.
17
18
20
21
22
24
25
26
27
28
29
30
31
32
34
35
xi

Figura 21 Média de consumo de alimentos artificiais controle e tratamento
contendo espículas das esponjas Tethya sp. e Tethya rubra pelo
paguro Calcinus tibicen. N = número de réplicas. A barra vertical
em cada coluna corresponde ao desvio padrão.
Figura 22 Média de consumo de alimentos artificiais contendo controle e
tratamento contendo espículas e extrato bruto das esponjas
Tethya sp. e Tethya rubra pelo paguro Calcinus tibicen. N =
número de réplicas. A barra em cada coluna corresponde ao
desvio padrão.
Figura 23 Média de consumo de alimentos artificiais contendo extrato bruto
das esponjas Tethya sp. e Tethya rubra por peixes generalistas. N
= número de réplicas. A barra em cada coluna corresponde ao
desvio padrão.
Figura 24 Média de consumo de alimentos artificiais contendo espículas das
esponjas Tethya sp. e Tethya rubra. N = número de réplicas. A
barra vertical em cada coluna corresponde ao desvio padrão.
Figura 25 Média de consumo de frações de Tethya sp. N = número de 40
réplicas. A barra em cada coluna corresponde ao desvio padrão.
Figura 26 Média de consumo de alimentos artificiais contendo as frações 41
obtidas com clorofórmio e água destilada de Tethya sp. N =
número de réplicas. A barra vertical em cada coluna corresponde
ao desvio padrão.
Figura 27 Média de consumo de alimentos artificiais contendo as frações 42
obtidas com clorofórmio e água destilada de Tethya sp. N =
número de réplicas. A barra vertical em cada coluna corresponde
ao desvio padrão.
Figura 28 Comparação da fração ativa com as frações 37-39 e 42. 43
Figura 29 Média de consumo de alimentos artificiais contendo as frações 37-
39 e 42 pelo paguro Calcinus tibicen. N = número de réplicas. A
barra vertical em cada coluna corresponde ao desvio padrão.
36
37
38
39
44
xii

Capítulo 2
Figura 1 (A) Um broto de Tethya sp. na extremidade da pinça. Escala = 1
cm, (B) brotos vistos sob lupa.
Figura 2 Estrutura dos principais esteróis detectados das espécies de
Tethya sp. (RJ) e Tethya rubra da (BA).
Figura 3 Concentração de colesta-4,6-dienol-3 em 10 indivíduos de Tethya
sp.
Figura 4
Concentração de colesterol em 10 indivíduos de Tethya sp.
Figura 5 Concentração de ergosta-5,22-dienol-3 em 10 indivíduos de Tethya
sp.
Figura 6 Concentração de ergosta-5,24(28)-dienol-3 em 10 indivíduos de
Tethya sp.
Figura 7 Concentração de estigmasta-5-enol-3 em 10 indivíduos de Tethya
sp.
Figura 8 Cromatograma do extrato bruto dos brotos de Tethya sp. (CG/MS).
Figura 9 Cromatograma do extrato bruto de adultos de Tethya sp. (CG/MS). 68
Figura 10
Colesta-5-enol- 3-ona-7 (presente nos brotos, não detectado nos
69
indivíduos adultos).
Capítulo 3
Figura 1 Esponja Hymeniacidon heliophila (Parker, 1910). Foto: G. Muricy. 75
Figura 2 Praia de Itaipu, Niterói, Rio de Janeiro. A seta indica o local de
coleta dos organismos (Modificado de Salvador e Silva 2002).
Figura 3 Enseada do Forno, Arraial do Cabo, Rio de Janeiro. A seta indica o
local onde foram realizados experimentos (Modificado de Ribeiro et
al. 2003).
Figura 4 Método de obtenção dos três extratos de Hymeniacidon heliophila
(EB1, EB2, EB3).
Figura 5 Cromatografia em camada delgada dos extratos de Hymeniacidon
heliophila. (A) Placa não revelada e (B) placa revelada com sulfato
cérico.
Figura 6 Média de consumo de alimentos controle e tratamento contendo
extratos de Hymeniacidon heliophila pelo paguro Calcinus tibicen.
O número de réplicas utilizados está indicado acima das colunas
correspondentes assim como o valor de p. A barra em cada coluna
corresponde ao desvio padrão.
Figura 7 Média de consumo de alimentos controle e tratamento contendo
extratos de Hymeniacidon heliophila pelo ouriço Litechinus
variegatus. O número de réplicas utilizados está indicado acima
das colunas correspondentes assim como o valor de p. A barra em
cada coluna corresponde ao desvio padrão.
61
63
64
64
65
65
66
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76
76
77
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79
80
xiii

Figura 8 Média de consumo de alimentos controle e tratamento contendo
extratos de Hymeniacidon heliophila por peixes generalistas. O
número de réplicas utilizados está indicado acima das colunas
correspondentes assim como o valor de p. A barra em cada coluna
corresponde ao desvio padrão.
Capítulo 4
Figura 1 Os pontos vermelhos indicam os locais de coleta no Atlântico Norte
e Mediterrâneo. 1 = Ria de Ferrol (La Coruña), 2 = Cabo de Creus
(Catalunha), 3 = L’Estartit (Catalunha) e 4 = Blanes (Catalunha).
Figura 2 Os pontos vermelhos indicam as localidades de coleta no Atlântico
Sul, Rio de Janeiro (Brasil).
Figura 4 Média de consumo de alimentos controle e tratamento contendo
extrato bruto das esponjas do Atlântico Sul e Mediterrâneo. A barra
em cada coluna corresponde ao desvio padrão, o valor de p está
ao lado de cada coluna e N = 20 em todos os casos.
Figura 5 Média de consumo de alimentos controle e tratamento contendo
extrato bruto das esponjas. A barra em cada coluna corresponde
ao desvio padrão, o valor de p está ao lado de cada coluna e N =
20 em todos os casos.
81
90
91
96
97
xiv

Introdução geral
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Trabalhos realizados na costa brasileira na área de ecologia
química de esponjas.
Capítulo 1
Tabela 1 Tempo de retenção (Tr), massa molecular (M + ), principais
fragmentos em CG/MS, fórmula molecular e código da
estrutura dos esteróis detectados.
Tabela 2 Percentagens relativas (%) dos esteróis detectados em
CG/MS nos espécimes de Tethya sp. (RJ) e Tethya rubra
(BA).
Tabela 3 Pesos e porcentagens relativas resultantes da filtração do
extrato bruto de Tethya sp. com diferentes solventes.
Capítulo 2
Tabela 1
Capítulo 4
Pesos e porcentagens resultantes da filtração do extrato
bruto de Tethya sp. com diferentes solventes.
Tabela 1 Esponjas marinhas estudadas. AN=Atlântico Norte,
AS=Atlântico Sul e MED=Mediterrâneo.
Tabela 2 Porcentagem de extrato em função do peso seco obtido das
esponjas estudadas.
10
33
33
40
69
92
95
xv

Introdução geral
______________________________________________________________________
Introdução geral
Esponjas marinhas e seu potencial químico
As esponjas marinhas são animais multicelulares primitivos, com
ocorrência registrada desde o Pré-Cambriano (Li et al. 1998, Hooper & van
Soest 2002). As esponjas estão distribuídas em ambientes marinhos e
dulciaquícolas, dos pólos às regiões tropicais. Em muitos habitats bênticos,
incluindo costões rochosos, recifes de coral e grutas submarinas, dentre outros,
as esponjas são, freqüentemente, os organismos dominantes (Bergquist 1978,
Hooper 1995, Diaz & Rutzler 2001). Elas se alimentam através de filtração por
um sistema aquífero inalante e exalante com poros externos que são
conectados à câmaras de coanócitos (Hooper et al. 2002) (Figura 1).
Atualmente, existem 7.000 espécies de esponjas descritas, mas estima-se que
este número possa chegar a 15.000 em todo o mundo (Hooper & van Soest,
2002).
Existem quatro Classes de esponjas: Calcarea, Hexactinellida,
Demospongiae e Archaeocyatha. A Classe Calcarea reúne esponjas marinhas
com espículas constituídas por carbonato de cálcio e são distribuídas em todos
os oceanos do mundo, mas a maioria ocorrendo em águas costeiras e rasas. A
Classe Hexactinellida inclui esponjas marinhas que possuem espículas
1

Introdução geral
______________________________________________________________________
silicosas hexactinais e são conhecidas vulgarmente como “esponjas-de-vidro”,
muitas delas ocorrendo em grandes profundidades. A Classe Demospongiae é
a que reúne o maior número de táxons, compreendendo 90% das espécies de
esponjas, marinhas e dulciaquícolas, e que possuem o esqueleto formado por
espículas silicosas ou fibras de espongina, podendo possuir ambos ou, ainda,
nenhum deles (Hooper et al. 2002) (Figura 2). A Classe Archeocyatha inclui
esponjas fósseis que existiram no período Cambriano (Hooper et al. 2002).
No Brasil, são conhecidas aproximadamente 350 espécies de esponjas,
porém, estima-se que existam mais 300 espécies a serem descritas (Hajdu et
al. 1999).
Atualmente, as esponjas marinhas são consideradas alvos de grande
relevância na busca por moléculas com diversas atividades biológicas. No
entanto, o potencial químico de esponjas marinhas começou a ser conhecido
pela comunidade científica desde a década de 50, com os trabalhos realizados
por Bergmann e colaboradores (Bergmann 1949, Bergmann & Feeney 1950,
1951, Bergmann & Burke 1955a, b, Bergmann et al. 1957). Assim, podemos
considerar que os estudos químicos de esponjas iniciaram-se com as
pesquisas sobre os produtos naturais da esponja Tectitethya crypta (de
Laubenfels, 1953). Os nucleosídeos isolados desta esponjas, assim como
correspondentes metabólitos análogos, exibiram forte atividade biológica que
resultou na produção industrial do Ara-C (Cytosar-U ® Upjohn), que é usado
para o tratamento de leucemia e do Ara-A (Vira-A ® Parke-Davis), utilizado no
tratamento da herpes. Outros produtos antivirais como, por exemplo, a
azidotimidina (AZT), usada internacionalmente
2

Introdução geral
______________________________________________________________________
Figura 1. Esquema do sistema aquífero de poríferos (Reproduzido de Muricy & Hajdu, 2006)
Figura 2. Exemplos de esponjas das Classes Calcarea (A), Demospongiae (B), Hexactinellida
(C) e Archaeocyatha (D). Fonte: A e B - acd.ufrj.br/labpor/; C - www.apus.ru/ D -
www.keyobs.be/.
no tratamento de pacientes com Síndrome da Imudeficiência Adquirida (Sida)
foram sintetizados a partir de nucleosídeos extraídos de T. crypta. Mais
recentemente, no mínimo quatro produtos extraídos de esponjas estão em
processo de testes clínicos de fase I para serem comercializados por sua forte
3

Introdução geral
______________________________________________________________________
atividade antitumoral (e.g. KRN 7000, LAF389, Discodermolídeo e HTI286)
(Thakur & Muller 2004).
O potencial farmacológico de substâncias obtidas de esponjas constitui
uma vasta área de investigação (e.g. Schmitz & Gopichand 1978, Stonard &
Anderson 1980, Kashman et al. 1989, Faulkner 1992, Kelecom 1992). De fato,
as esponjas estão entre os organismos dos quais se têm extraído um grande
número de produtos naturais (Figura 3). Mais de cinco mil substâncias foram
isoladas de esponjas marinhas (Bakus et al. 1986, Scheuer 1990, Pawlik 1993,
Faulkner 1998, Blunt & Munro 2003, Blunt et. al. 2006).
Algas vermelhas
5% Outros
Tunicados
7%
6%
Equinodermas
6%
Microorganismos
18%
Celenterados
21%
Esponjas
37%
Figura 3. Distribuição de produtos naturais marinhos, por filo. Outros= moluscos, briozoários,
algas verdes e pardas (Fonte: Blunt et al. 2006)
Geralmente, os produtos naturais provenientes de organismos marinhos
possuem novas estruturas quando comparados àqueles encontrados em
organismos terrestres (Fenical 1982). Esses metabólitos constituem exemplos
de variados tipos de estruturas moleculares que incluem substâncias
terpenoídicas, ácidos aminados, alcalóides, substâncias de origem biossintética
mista, entre outras (McClintock & Baker 2001). Assim, a proliferação de
estudos de química de produtos naturais, que buscavam principalmente a
4

Introdução geral
______________________________________________________________________
descoberta de novas moléculas, impulsionou o desenvolvimento da ecologia
química de organismos marinhos como um todo (Pereira 2002).
Ecologia química de esponjas marinhas
A ecologia química marinha é uma área recente de investigação e
possui caráter interdisciplinar. O enfoque biológico desse campo de pesquisa
avalia, por exemplo, como agem e quais as implicações ecológicas dos
metabólitos secundários presentes nos organismos. Por outro lado, a
elucidação de estruturas moleculares ativas, assim como as proposições
biogenéticas na formação dessas moléculas constituem algumas das
abordagens possíveis no campo de estudo químico (Pereira 2002).
Os metabolitos secundários, também comumente chamados de produtos
naturais, podem atuar em diversos tipos de interações biológicas no meio
marinho, como defesa química anti-herbivoria e anti-predação, como
alelopático em interações competitivas, no estabelecimento de mutualismos, ou
em processos reprodutivos (Engel & Pawlik 2000, Pereira 2002), inibição de
assentamento de larvas (Hirota et al. 1998) e defesa química contra patógenos
(McCaffrey & Endean 1985).
Dentre os diversos tipos de interações biológicas, as esponjas são
especialmente alvos de investigações sobre a presença e a atuação de
defesas químicas contra a predação. As esponjas marinhas produzem defesa
química anti-predação, particularmente devido à aparente ausência de
proteção física em seus tecidos e também por serem elas sésseis, não
podendo assim escapar dos predadores (Pawlik 1993).
5

Introdução geral
______________________________________________________________________
Uma marcante característica da ocorrência de metabólitos secundários é
a intensa variabilidade quali- e quantitativa nos organismos que os produzem
(Van Alstyne et al. 2001). Em outras palavras, o teor de um determinado
metabólito secundário não é uma característica absoluta, mas um aspecto
extremamente variável. Diversos fatores têm sido apontados como causadores
de variação em teores de defesa química em organismos marinhos, tais como
o nível de exposição dos organismos a consumidores (= pressão de predação),
a profundidade, a época do ano, a localização geográfica da comunidade ou
até mesmo a ação de consumidores pode alterar a defesa química em
organismos marinhos dentre outros (Pereira 2002). A variação em diferentes
partes de um organismo também pode ter forte influência na busca de padrões
gerais de defesas em organismos marinhos e pouco se sabe sobre esse tema
(Chanas & Pawlik 1997, Pawlik 1998, Becerro et al. 1995).
Uma das interações mais estudadas no contexto da ecologia química
marinha é a predação. Comunidades de esponjas podem ser significativamente
reduzidas quando inexiste uma estratégia de proteção eficiente (Hill et al. 2005,
Wulff 2006). Durante muitas décadas os efeitos das defesas químicas e físicas
tiveram suas ações estudadas isoladamente. Porém, assim como ocorre em
algas, pode haver um efeito de maximização da atividade quando ambas
estratégias defensivas são usadas simultaneamente, reproduzindo o que pode
ocorrer na natureza. No entanto, a interação de diferentes tipos de defesas tem
sido pouco estudada no campo da ecologia química marinha (Jones et al.
2005).
Outro fator que afeta diretamente a distribuição e a abundância de
invertebrados é a redução da densidade de larvas, causada pelo consumo por
6

Introdução geral
______________________________________________________________________
peixes, tanto em regiões temperadas como tropicais (Thorson 1946, 1950,
Gaines & Roughgarden 1987, Olson & McPherson 1987, Young & Chia 1987,
Lindquist & Hay 1996). Durante muitas décadas acreditava-se que a maioria
das larvas marinhas seriam presas vulneráveis à maior parte dos organismos
planctívoros (Orians & Janzen 1974). No entanto, alguns poucos estudos
constataram que, além de presentes em indivíduos adultos, as defesas
químicas também ocorrem em suas unidades de propagação, constituindo uma
importante estratégia de sobrevivência somadas a outras já conhecidas como,
por exemplo, a transparência e o pequeno tamanho da larva (Brooks & Dobson
1965, Zaret & Kerfoot 1975) e as defesas morfológicas (Pennington & Chia
1984).
Poucas vezes na literatura avaliou-se a variabilidade de defesa química
entre espécies com grande afinidade taxonômica. Em geral, a presença de
certas classes de substâncias é conservativa dentro de grupos de esponjas,
representando uma característica taxonômica (Bergquist & Wells 1983,
Braekman et al. 1992, van Soest & Braekman 1999). Porém, a relação que
pode existir em respostas antipredação em um grupo de esponjas com a
mesma classe de substâncias ainda é pouco conhecida, ou seja, não se sabe
ainda se esponjas com perfis químicos semelhantes exibiriam respostas
semelhantes a predadores.
As principais teorias em ecologia química são advindas de estudos
realizados com plantas terrestres (Hay & Steinberg 1992). Dentre as principais
teorias destacam-se: a Teoria de Defesa Ótima (TDO) e a Hipótese de Balanço
Crescimento-Diferenciação (HBCD).
7

Introdução geral
______________________________________________________________________
A TDO (McKey 1974, Rhoades 1976) prediz que a planta canaliza as
defesas para as partes do corpo que estão mais vulneráveis ou que são
fundamentais para sua vida. Essa forma de alocação de defesas representaria
uma economia no gasto energético para produzi-las, pois a maior concentração
de defesa alocada seria à regiões específicas. Em esponjas marinhas esse
tema é bastante controverso. Concordando com essa teoria, Schupp et al.
(1999) constataram uma maior concentração de metabólitos nas partes mais
visíveis da esponja Oceanapia sp. O mesmo tipo de variação foi encontrado na
esponja antártica Latrunculia apicalis (Furrow et al. 2003) e em Ectyoplasia
ferox (Kubanek et al. 2002). Em Cacospongia sp. também foi evidenciada a
existência de maior concentração dos sesterterpenos escalaradiol e
desacetilescalaradiol no extrato bruto das porções mais vulneráveis que
incluíam as extremidades e o ectossoma (Becerro et al. 1998). Porém, até as
mais baixas concentrações do extrato encontrado no tecido da esponja foram
eficazes para evitar a predação por peixes (Becerro et al. 1998), o que não
corroboraria a TDO. Em desacordo com essa teoria, nas esponjas
Xestospongia muta, Chondrilla nucula e Crambe crambe não foram
encontradas evidências de maior concentração de metabólitos na superfície
(Chanas & Pawlik 1997, Pawlik 1998, Becerro et al. 1995, respectivamente). Na
esponja Dysidea granulosa, a maior concentração de metabólitos secundários
foi encontrada no endossoma, ou seja, o inverso do esperado de acordo com a
TDO (Becerro & Paul 2004).
O tipo de habitat também pode influenciar na produção de metabólitos.
No caso da esponja mediterrânea Crambe crambe, foram detectadas maiores
8

Introdução geral
______________________________________________________________________
concentrações de metabólitos secundários em indivíduos expostos quando
comparados aos ciáfilos (Becerro et al. 1995).
Variações sazonais foram encontradas na esponja Chondrilla nucula,
onde exemplares coletados em época de inverno não possuíam defesas
químicas contra predação por peixes, ao passo que exemplares coletados em
outras épocas do ano elas estavam presentes (Swearingen & Pawlik 1998).
Estudos iniciados na década de 60 registraram que organismos
marinhos venenosos e peçonhentos ocorrem mais freqüentemente em águas
quentes (Halstead & Mitchell 1963, Cleland & Southcott 1965, Russell 1965). A
existência de grande diversidade de consumidores em regiões tropicais foi o
ponto de partida para o desenvolvimento de hipóteses para explicar essa
relação (Levin & York 1978). Do ponto de vista ecológico, o desenvolvimento
de defesas em organismos sujeitos à altos níveis de predação constitui um
importante fator para a manutenção de populações nessas regiões.
Estudos comparativos com algas marinhas tropicais e temperadas
também constataram uma maior freqüência de química defensiva relacionada
com a grande diversidade de herbívoros existente em regiões tropicais (Gaines
& Lubchenco 1982, Steneck 1986, Hay 1991, Coley & Aide 1991). Inclusive,
espécies de algas que vivem em locais de baixa e alta intensidade de
herbivoria, possuem padrões similares de composição química, porém,
concentrações maiores de substâncias repelentes são produzidas pelos
indivíduos provenientes de locais com alta herbivoria (Paul & Fenical 1987,
Paul & Van Alstyne 1988). Em contrapartida, a tolerância à químicas
defensivas parece ser maior em consumidores tropicais do que em temperados
(Cronin et al. 1997).
9

Introdução geral
______________________________________________________________________
Como pode-se observar, diversos fatores podem influenciar a atuação e
alocação das defesas químicas em esponjas. O conhecimento desses fatores é
fundamental para a melhor compreensão de processos químicos, ecológicos e
evolutivos que influenciam na biodiversidade bentônica marinha.
No Brasil, apesar da grande abundância e diversidade de esponjas,
poucos trabalhos se dedicaram ao estudo de ecologia química de esponjas
(Tabela 1).
Tabela 1. Trabalhos realizados na costa brasileira na área de ecologia química de
esponjas.
Espécie Local Aspecto estudado Referência
Geodia corticostylifera RJ Antipredação
Antiincrustação
Quimiotaxia
Clavico et alli, 2006
Mycale microsigmatosa RJ Antiincrustação Pereira et alli, 2002a
Aplysina fulva RJ Antiincrustação Pereira et alli, 2002a
Ircinia strobilina BA Antipredação Epifânio et alli, 1999
No capítulo 1 desta Tese, é apresentado um estudo realizado com
intuito de avaliar o perfil químico e a ecologia química de duas espécies
congenéricas de esponjas marinhas, Tethya sp. e Tethya rubra. A atuação de
defesas conjugadas, por sinergia, também foi analisada nesse capítulo.
No capítulo 2, foi investigada a variação intrapopulacional em alguns
metabólitos de Tethya sp. e também a possibilidade de ocorrência de defesa
química nos brotos, que são estruturas de propagação vegetativa.
10

Introdução geral
______________________________________________________________________
O capítulo 3 apresenta os resultados de um estudo realizado com
extratos da esponja Hymeniacidon heliophila avaliados como defesa frente à
diferentes consumidores.
No capítulo 4, o tema da hipótese latitudinal foi testado utilizando
espécies aparentadas coletadas em regiões do Atlântico Sul, Atlântico Norte e
Mediterrâneo.
11

Capítulo 2
______________________________________________________________________
Capítulo 1
Perfil químico e defesas antipredação do
gênero Tethya (Porifera: Demospongiae)

Capítulo 1
______________________________________________________________________
1. Introdução
Os metabólitos secundários, também chamados complementares ou
especiais, fazem parte de diversas classes de substâncias orgânicas e são
produzidas por vias sintéticas derivadas do metabolismo primário (Teixeira
2002). Esses metabólitos são elementos essenciais em estudos de ecologia
química, em especial, por serem importantes mediadores de interações
biológicas em organismos marinhos e terrestres (Schmitt et al. 1995, de Nys et
al. 1995, 1998, Hay et al. 1998).
Dentre os invertebrados marinhos, as esponjas marinhas se destacam
como fonte de produtos naturais (Blunt et al. 2006). Mais de 40% dos
metabolitos provenientes de organismos marinhos foram isolados de esponjas
(Seo et al. 1997). Os metabólitos de esponjas são substâncias que possuem
diversas origens biogenéticas como: esteróides, terpenóides, peptídeos,
poliquetídeos, purinas e pirimidinas, além de produtos biossintéticos mistos. É
importante destacar que numerosos compostos encontrados em esponjas
também exibiram potentes e diversas bioatividades, o que propiciou o
desenvolvimento de novos medicamentos (Newman & Cragg 2004, O´Keefe
2001, Seo et al. 1997). Além disso, os estudos de esponjas são responsáveis
pelo aumento do conhecimento no campo dos produtos de organismos em
associação simbióticas, pois muitos metabólitos de esponjas são na realidade
produzidos por bactérias e fungos simbiontes (Teixeira 2002).
13

Capítulo 1
______________________________________________________________________
Apesar de estarem presentes em variados invertebrados, diversos
estudos evidenciaram que substâncias esteroídicas são especialmente
freqüentes, abundantes e com grande diversidade estrutural em esponjas
marinhas (Kanazawa 2001, Rudi et al. 2001, Lerch & Falkner 2001, Sheikh &
Djerassi 1974, D’Áuria et al. 1993, Malik et al. 1988, Teshima et al. 1983).
Esteróis derivados de esponjas, também podem possuir atividade citotóxica,
antiviral, antimicrobial e inibidora de enzimas (Seo et al. 1997).
Os esteróis são micromoléculas de 27 a 39 átomos de carbono
pertencentes ao grupo dos esteróides. Apresentam, portanto, como esqueleto
básico, um sistema tetracíclico (ciclopentano-peridrofenantrênico) substituído
no carbono 17 por uma cadeia lateral acíclica de 8 a 10 ou mais átomos de
carbono (Figura 1). Os esteróis provenientes de invertebrados marinhos
diferem dos ficosteróis típicos (esteróis de algas) por possuírem 26 a 30
átomos de carbono, envolvendo diferentes padrões de alquilações e
insaturações na cadeia lateral, modificações no núcleo tetracíclico e
polioxigenações nos anéis e/ou na cadeia lateral (D'Auria et al. 1993).
Diferente dos esteróis terrestres é particularmente difícil estabelecer a
origem correta destas substâncias nos organismos marinhos. Elas podem ter a
sua origem a partir de processos de:
1. Biossíntese de novo, ou seja, captação de precursores biossintéticos de
organismos produtores e posterior produção de esteróis por rota própria;
2. Obtenção e armazenamento a partir da dieta alimentar, sem posteriores
transformações químicas;
14

Capítulo 1
______________________________________________________________________
3. Obtenção e armazenamento a partir da dieta alimentar, com posteriores
transformações químicas;
4. Obtenção e armazenamento a partir de simbiontes (ex: fungos, algas e
bactérias)
HO
2
3
1
4
10
19
5
11
9
H
6
12
13
H
8
7
18
H
21 22
Figura 1. Estrutura química básica de um esterol do tipo colestano.
14
15
O estudo das propriedades bioativas dos metabólitos secundários de T.
crypta resultaram na síntese de produtos análogos (Figura 2), o ARA-A
(antiviral utilizado contra o vírus Herpes simplex) e o ARA-C (antitumoral
utilizado no tratamento da leucemia linfóide). Posteriormente, o estudo de
esteróis foi evidenciado em Tethya aurantia (Sheikh & Djerassi 1974,
Gunatilaka et al. 1981). Nessa espécie foram isolados também o monoéter
glicerol alquil (2S)-1-(hexadeciloxi)-2,3-propanediol, (2S)-1-(16-metil-
heptadeciloxi)-2,3-propanediol e (2S)-1-(15-metil-heptadeciloxi)-2,3-propanediol
(Smith & Djerassi 1987), além de alantoína e adenosina (Weber et al. 1981). O
estudo de carotenóides em Tethya amamensis registrou a presença da
17
20
16
23
24
26
25
27
15

Capítulo 1
______________________________________________________________________
tethyanina (Tanaka & Yamamoto 1984). Proteínas citotóxicas foram extraídas
de Tethya ingalli (O`Keefe 2001) e duas enzimas exopolifosfatases da esponja
Tethya lyncurium foram purificadas e caracterizadas (Lorenz et al. 1995).
Atividade hemolítica e larvicida foram encontradas no extrato aquoso de uma
espécie de Tethya não identificada proveniente de Mumbai, India (Indap &
Pathare 1998).
O desenvolvimento dos estudos químicos de esponjas forneceu a base
para o surgimento de pesquisas no campo de ecologia química. Nas últimas
décadas, o conhecimento sobre defesas contra predação tem sido ampliado,
especialmente devido à multiplicação de investigações no campo da ecologia
marinha em ambientes tropicais, temperados e antárticos. Diversos organismos
têm sido estudados, como ascídias (Davis 1991, Lindquist et al. 1992, Tarjuelo
et al. 2002), algas (Paul & Van Alstyne 1988, Pereira et al. 2000, Pereira et al.
2002), corais (Sammarco & Coll 1988, Harvell & Fenical 1989, O’Nell & Pawlik
2002), equinodermas (Rideout et al. 1979, Bakus 1981, McClintock & Vernon
1990), moluscos (Pawlik et al. 1988; Fontana et al. 1993) e esponjas (Puyana
et al. 2003, Becerro & Paul 2004, Clavico et al. 2006).
As esponjas são organismos conspícuos em comunidades bentônicas,
apesar da aparente vulnerabilidade a predação, pois possuem corpos macios
supostamente sem defesas. Até mesmo em ambientes com elevada pressão
de predação, como recifes de corais, as esponjas podem constituir populações
representativas (Diaz et al. 1990, Alcolado 1991, Sarmento & Correia 2002,
Ribeiro & Muricy 2004). No entanto, diversos organismos são conhecidos por
consumirem esponjas, como peixes (Randall & Hartman 1968, Wulff 1994,
Dunlap & Pawlik 1998), estrelas-do-mar (Schiebling 1982, Sheild & Witman
16

Capítulo 1
______________________________________________________________________
1993, McClintock et al. 1994), ouriços (Birenheide et al. 1993, Santos et al.
2002), poliquetas (Pawlik 1983), tartarugas (Meylan 1988, 1990, León &
Bjorndal 2002), caranguejos (Hazlett 1968, 1981, Schembri 1982) e anfípodas
(Oshel & Steele 1985).
Apesar da existência de trabalhos sobre atividades farmacológicas (Silva
et al. 2006, Seleguim et al. 2007) de esponjas desse gênero na costa brasileira,
pouco se sabe sobre as características químicas dessas esponjas.
O objetivo desse capítulo foi descrever o perfil químico e as defesas
antipredação químicas e físicas de duas espécies do gênero Tethya do Rio de
Janeiro e da Bahia (Tethya sp. e Tethya rubra).
17

Capítulo 1
______________________________________________________________________
2. Materiais e Métodos
2.1. Coletas
Os espécimes de Tethya sp. (Figura 3A) foram coletados através de
mergulho livre na Praia de Tarituba, Paraty - Rio de Janeiro (Figura 3B) nos
meses de abril e setembro de 2004, julho de 2005, junho de 2006 e agosto de
2007. Nesse local, as esponjas habitam a faixa entre-marés. Após a coleta,
estes foram congelados em freezer para posterior liofilização. Os exemplares
de Tethya rubra (Figura 4A) foram coletados na Ilha do Frade, Baía de Todos
os Santos, Salvador – Bahia (Figura 4B) no mês de agosto de 2004, seguindo
os mesmos procedimentos descritos acima.
Os paguros Calcinus tibicen e Clibanarius antillensis (Figura 5A e B,
respectivamente) utilizados nos ensaios foram coletados na Praia de Itaipu,
Niterói – RJ (Figura 6) e devolvidos no mesmo local ao fim de cada ensaio.
Figura 3. Exemplar de Tethya sp. (A) e Praia de Tarituba, Paraty - RJ (B). Escala=1cm
18

Capítulo 1
______________________________________________________________________
Figura 4. Exemplar de Tethya rubra (A) e Ilha do Frade, Baía de Todos os Santos –
BA (B). Escala = 1 cm.
Figura 5. Indivíduos de paguros Calcinus tibicen (A) e Clibanarius antillensis (B).
Escala = 1 cm.
Figura 6. Praia de Itaipu (costão esquerdo), Niterói - Rio de Janeiro.
19

Capítulo 1
______________________________________________________________________
2.2. Ensaios biológicos
Os alimentos artificiais para paguros e peixes foram preparados de
acordo com Wadell & Pawlik (2000a). A concentração natural dos extratos
brutos foi reproduzida nos alimentos artificiais. Para a preparação de 9 ml de
alimento para paguros ou peixes utilizou-se 0,09 g de carragenana, 8,55 ml de
água destilada, 0,45 g de lula liofilizada em pó, 1 ml de solvente e extrato bruto.
O extrato bruto a ser testado foi solubilizado e aderido à lula em pó liofilizada
no alimento-tratamento. Nos alimentos-controle, apenas o solvente foi
adicionado à lula em pó. Nos ensaios de defesa física, as espículas foram
adicionadas ao alimento-tratamento. A carragenana foi diluída na água e
aquecida por 20 segundos em um forno de microondas, em seguida foi
acrescentada à lula. O gel obtido através dessa mistura foi aderido a uma
matriz plástica com volume de 9 ml, dependendo da quantidade disponível de
extrato bruto (Figura 7 A e B). Em cada recipiente plástico com tampa (400 ml)
foram colocados um paguro e um alimento controle e tratamento (Figura 7 C).
20

Capítulo 1
______________________________________________________________________
Figura 7. (A) Incorporação do gel a matriz quadriculada, (B) detalhe do alimento após
cortado na malha, contendo um controle e um tratamento e (C) unidade experimental
utilizada: pote plástico com um paguro e alimento artificial.
O tempo de consumo nesses ensaios variou de 24 a 72 horas. Os potes
plásticos foram colocados em aquários (50 a 100 litros, com água natural do
mar) no Laboratório Úmido de Ecologia Química Marinha, na Universidade
Federal Fluminense.
Nos ensaios de predação por peixes, o alimento artificial foi preparado
com um molde de 20ml (Figura 8 B), onde barbantes eram colocados de modo
que estivessem no meio dos alimentos artificiais para que pudessem ser
amarrados nas unidades experimentais (Figura 8 A). As unidades
experimentais foram oferecidas em campo para peixes. O tempo de consumo
dos alimentos durou de 5 a 15 minutos. Depois de recolhidos, cada alimento
teve seu consumo quantificado em porcentagem.
21

Capítulo 1
______________________________________________________________________
Figura 8. (A) unidade experimental contendo um alimento controle e um alimento
tratamento, (B) molde em acrílico utilizado para obtenção dos alimentos.
2.3. Isolamento das espículas
Pequenos de esponjas de aproximadamente 1cm 3 foram aquecidos em
ácido nítrico até completa dissolução da matéria orgânica. Posteriormente, foi
realizada lavagem das espículas em água destilada utilizando um funil de
Büchner em um kitasato conectado a uma bomba a vácuo (Figura 9). Esse
procedimento de lavagem em água foi realizado 20 vezes para eliminar o ácido
nítrico.
Figura 9. (A) limpeza das espículas a vácuo, (B) Espículas limpas.
22

Capítulo 1
______________________________________________________________________
2.4. Análises químicas
Análises de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1 H)
comprovaram que não houve perda ou modificação dos componentes
majoritários do extrato bruto obtido de material úmido ou liofilizado, assim
optou-se por utilizar o material liofilizado.
Os extratos brutos foram analisados através de RMN 1 H (300MHz,
CDCl3) e cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrômetro de massas.
Para separação de componentes foram feitas colunas cromatográficas em gel
de sílica com misturas de solventes orgânicos como eluentes. Para
identificação dos produtos naturais puros foram feitas análises de RMN em 1D
de 1 H e de carbono ( 13 C-APT) e experimentos de 2D de COSY ( 1 H x 1 H).
A análise por cromatografia em fase gasosa (CG) foi realizada em
equipamento HP 6890 acoplado a espectrofotômetro de massas (EM) a 70 eV,
em aparelho HP 5973 (CGAR/EM), coluna DB-5 MS, 30 m de comprimento,
0,25 µm de espessura de filme. O gás carreador foi hélio.
As amostras foram injetadas com divisão de fluxo ("split"), na razão 1:10.
A programação de temperatura foi iniciada a 50°C com rampa de 10°C/min até
atingir 300°C, que foi mantida por 10 minutos. A temperatura do injetor foi
fixada em 270°C e a do detector em 300°C.
A amostras foram diluídas em diclorometano e injetou-se 1 µl da amostra
na concentração de 100 ppm.
23

Capítulo 1
______________________________________________________________________
O isolamento de produtos foi feito a partir do fracionamento do extrato
bruto em acetona (100% por 7 dias) em cromatografia de coluna (2 cm x 50
cm) em gel de sílica (Merck 70 – 230 "mash"). O extrato bruto foi solubilizado
em clorofórmio (CHCl3 100%) que também foi utilizado como primeiro eluente,
sendo acrescido de acetato de etila (AcOEt), segundo um gradiente de
polaridade. Foram recolhidas 63 frações do extrato bruto da esponja marinha
Tethya sp. Os solventes e misturas de solventes utilizados durante a coluna
cromatográfica foram os seguintes: frações 0-42, CHCl3; 43-47, CHCl3 / AcOEt
(9:1); 48-50, CHCl3 / AcOEt (8:2); 51-53, CHCl3 / AcOEt (7:3); 54-56, CHCl3 /
AcOEt (1:1), 57-59, AcOEt (100%); 60-63 e metanol (MeOH) para limpeza da
coluna. Na coluna cromatográfica do extrato bruto de Tethya rubra foram
utilizados os seguintes solventes ou misturas de solventes: frações 0-15, CHCl3
; 16-30, CHCl3 / AcOEt (9:1); 31-33, CHCl3 / AcOEt (7:3); 34-35, CHCl3 / AcOEt
(1:1); 36-37, CHCl3 / AcOEt; 38-41, MeOH. Em ambos os casos foram
recolhidos amostras de 100 ml.
Para a preparação das frações utilizou-se cromatografia em camada
delgada (CCD) de gel de sílica 60 F254 marca Merck. As placas foram reveladas
pelo borrifamento de sulfato cérico, seguido de aquecimento.
2.5. Partição e filtração
Para identificação da fração ativa biologicamente contra predação foram
utilizados dois métodos: partição e filtração.
O extrato bruto foi particionado utilizando os seguintes solventes:
clorofórmio, hexano, metanol e água de acordo com o esquema da Figura 10.
24

Capítulo 1
______________________________________________________________________
A filtração foi feita em um funil de Büchner, utilizando os solventes
hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol (Figura 11).
Figura 10. Partição com funil de bromo realizada com os extratos brutos em acetona
de Tethya sp. e Tethya rubra.
Água destilada
Clorofórmio Hexano
Metanol (20%) + água destiladada
metanol
acetato de etila
diclorometano
hexano
Figura 11. Filtração com funil de Büchner realizada com o extrato bruto de Tethya sp.
25

Capítulo 1
______________________________________________________________________
2.6. Análises estatísticas
Para testar a normalidade dos dados foi utilizado o teste de Kolmogorov
Smirnov e para detectar diferenças significativas (considerando p

Capítulo 1
______________________________________________________________________
3. Resultados
3.1. Perfil químico de Tethya sp. e Tethya rubra
A cromatografia em camada delgada (Figura 12), RMN de 1 H (Figura
13) e CG/MS (Figura 14 e 15) dos extratos brutos em acetona de Tethya sp. e
T. rubra evidenciaram a semelhança nos componentes majoritários de ambas
espécies .
Figura 12. Cromatografia em camada delgada do extrato bruto em acetona de Tethya
sp. (A) e Tethya rubra (B). Eluente: Hexano/AcOEt 1:1.
27

Capítulo 1
______________________________________________________________________
Figura 13. RMN 1 H (CDCl3, 300 MHz, trimetilsilano como referência interna) do extrato
bruto de Tethya sp. coletada em Parati (RJ) (acima) e Tethya rubra coletada na Bahia
(abaixo).
28

Capítulo 1
______________________________________________________________________
Abundance
240000
220000
200000
180000
160000
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
Time-->
26.09
28.24
26.61
27.17
27.27
27.64
25.58
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
Figura 14. CG/MS do extrato bruto em acetona de T. rubra, BA (1,4 mg/1mL).
29

Capítulo 1
______________________________________________________________________
Abundance
1400000
1300000
1200000
1100000
1000000
900000
800000
700000
600000
500000
400000
300000
200000
100000
0
Time-->
TIC: DSUZIRJ.D
26.11
26.62
28.25
27.17
25.58 27.27
27.64
28.41
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
Figura 15. CG/MS do extrato bruto de Tethya sp., RJ (1,7 mg/1mL).
30

Capítulo 1
______________________________________________________________________
A cromatografia em camada delgada dos extratos brutos juntos com o
padrão do colesterol indicou que os esteróis constituem a classe majoritária em
Tethya sp. e T. rubra (Figura 16).
Figura 16. Extrato bruto em acetona de Tethya rubra (à esquerda), padrão do
colesterol (ao meio) e extrato bruto em acetona de Tethya sp. (à direita).
31

Capítulo 1
______________________________________________________________________
Figura 17. CCD das frações 1-63 de Tethya sp. Eluente: Hexano/AcOEt 1:1.
32

Capítulo 1
______________________________________________________________________
Figura 18. Cromatografia em camada delgada das frações 1-41 de Tethya rubra (B).
Eluente: Hexano/AcOEt1:1.
Em CG/MS foram detectadas e identificadas oito substâncias
majoritárias de natureza esteroidal (Figuras 14 e 15, Tabelas 1 e 2) tanto em
Tethya sp. como em Tethya rubra.
33

Capítulo 1
______________________________________________________________________
Tabela 1. Tempo de retenção (Tr), massa molecular (M + ), principais
fragmentos por CG/MS, fórmula molecular e código da estrutura dos esteróis
detectados.
Esteróis
identificados
colesta-5,22dienol-3
(1b)
Tr
(em
minutos)
M + Principais fragmentos Fórmula
molecular
25,58 384 384 [M + ], 366, 351, 300,
271, 265, 213, 159, 145,
111, 95, 69, 55 , 41
colesterol (1a) 26,11 386 386 [M + ], 368, 353, 326,
301, 275, 255, 213, 159,
ergosta-5,22dienol-3
(1d)
ergosta-5,24(28)dienol-3
(1e)
ergosta-5-enol-3
(1c)
estigmasta-5,22dienol-3
(1g)
estigmasta-5,enol-
3(1f)
estigmasta-
5,24(28)-dienol-3
(1h)
145, 107, 95, 81, 43
26,62 398 398 [M + ], 380, 365, 337,
300, 255, 213, 159, 133,
105, 69, 55, 41
27,17 398 398 [M + ], 383, 380, 365,
314, 281, 271, 229, 159,
145, 105, 81, 55, 41
27,27 400 400 [M + ], 382, 367, 340,
315, 289, 281, 255, 207,
159, 145, 107, 105, 81, 55,
43
27,64 412 412 [M + ], 394, 369, 351,
300, 271, 256, 207, 159,
133, 105, 69, 55
28,25 414 414 [M + ], 396, 381, 329,
303, 213, 161, 145, 107,
81, 43
28,41 412 414 [M + ],, 396, 381, 314,
296, 281, 255, 229, 207,
145, 119, 95, 81, 55
Estrutura
C27H44O 1b
C27H46O 1a
C28H46O 1d
C28H46O 1e
C28H48O 1c
C29H48O 1g
C29H50O 1f
C29H48O 1h
Tabela 2. Percentagens relativas (%) dos esteróis detectados por CG/MS nos
espécimes de Tethya sp. (RJ) e Tethya rubra (BA).
Esteróis identificados Fig. % relativa de esteróis % relativa de esteróis
19 Tethya sp. (RJ) Tethya rubra (BA)
colesta-5,22-dienol-3 1b 6,13 3,36
colesterol 1a 45,57 45,82
ergosta-5,22-dienol-3 1d 19,69 16,89
ergosta-5,24(28)-dienol-3 1e 6,64 6,53
ergosta-5-enol-3 1c 5,75 6,79
estigmasta-5,22-dienol-3 1g 2,66 3,01
estigmasta-5,enol-3 1f 9,39 17,59
estigmasta-5,24(28)-dienol-3 1h 4,17 n.d.
34

Capítulo 1
______________________________________________________________________
A análise de similaridade utilizando a presença e a percentagem relativa
dos diferentes tipos de esteróis através do índice de Bray-Curtis indicou que a
semelhança entre os dois extratos corresponde a 90%.
HO
2
3
HO
2
3
1
10
4
19
5
1
4
10
11
9
19
H
6
5
1
12
13
H
11
9
H
6
8
7
2
18
H
12
21
14
13
H
8
7
18
H
15
R
21
17
14
16
15
R
17
16
21 22
20
21 22
Figura 19. Estrutura dos principais esteróis detectados das espécies de Tethya sp.
(RJ) e Tethya rubra da (BA).
20
23
a
b
c
d
23
a
24
24
26
25
26
27
25
27
e
f
g
h
28
29
35

Capítulo 1
______________________________________________________________________
3.2. Ecologia química
Na avaliação do efeito do extrato bruto de Tethya sp. (RJ) como defesa
frente à predação, foi verificado que ele atua de modo significativo na
repelência dos paguros Calcinus tibicen e Clibanarius antillensis (Figura 20). O
mesmo efeito não ocorreu com o extrato bruto de Tethya rubra (BA) que foi
consumido indiscriminadamente por ambas as espécies de paguros (Figura
20). A concentração natural de extrato bruto calculada e utilizada nos
experimentos foi de 0,0245 g/ml e 0,0294 g/ml, em Tethya sp. e T. rubra,
respectivamente.
Consumo em porcentagem
100
80
60
40
20
0
n=18
p=0,204
n=30
p=0,152
n=20
p

Capítulo 1
______________________________________________________________________
Nos testes com espículas incorporadas ao alimento artificial, o
tratamento foi significativamente menos consumido pelo paguro Calcinus
tibicen. As concentrações testadas em Tethya sp. e T. rubra foram 0,08684 e
0,40164 g/ml, respectivamente (Figura 21).
Consumo em porcentagem
100
80
60
40
20
0
n=22
p=0,005
Tethya rubra Tethya sp.
Controle
Tratamento
n=21
p< 0,001
Figura 21. Média de consumo de alimentos controle e tratamento contendo espículas
das esponjas Tethya sp. e Tethya rubra pelo paguro Calcinus tibicen. n = número de
réplicas. A barra em cada coluna corresponde ao desvio padrão.
O efeito dos dois tipos de defesas (física e química) associados foi
testado com a confecção de alimentos contendo espículas e extrato bruto das
esponjas T. rubra e Tethya sp. (Figura 22). Em ambos os casos, o alimento
tratamento foi significativamente menos consumido.
37

Capítulo 1
______________________________________________________________________
Consumo em porcentagem
100
80
60
40
20
0
n=13
p

Capítulo 1
______________________________________________________________________
Consumo (%)
100
80
60
40
20
0
n=10
p=0,0101
n=10
p=0,0425
Tethya sp. Tethya rubra
Controle
Tratamento
Figura 23. Média de consumo de peixes generalistas de alimentos contendo extrato
bruto das esponjas Tethya sp. e Tethya rubra. n = número de réplicas. A barra em
cada coluna corresponde ao desvio padrão.
Nos ensaios utilizando espículas de Tethya sp. e Tethya rubra, houve
inibição do consumo por peixes generalistas apenas no caso de Tethya sp.
(p=0,0050 - Figura 24). As concentrações de espículas testadas foram
proporcionalmente as mesmas utilizadas em testes de predação por paguros.
39

Capítulo 1
______________________________________________________________________
Consumo (%)
100
80
60
40
20
0
n=10
p=0,0050
n=10
p=0,1235
Tethya sp. Tethya rubra
Controle
Tratamento
Figura 24. Média de consumo de peixes generalistas de alimentos controle e
tratamento contendo espículas das esponjas Tethya sp. e Tethya rubra. n = número de
réplicas. A barra em cada coluna corresponde ao desvio padrão.
3.3. Fracionamento do extrato bruto
A quantidade de 1,26 g de extrato bruto em acetona de Tethya sp. foi
filtrado usando-se hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol (Tabela
3), segundo um gradiente de polaridade. As frações diclorometano (DCM) e
acetato (ACET) inibiram significativamente o consumo pelos paguros, enquanto
nas duas outras frações, hexano e metanol não houve consumo diferencial
(Figura 25).
40

Capítulo 1
______________________________________________________________________
Tabela 3. Pesos e porcentagens relativas resultantes da filtração do extrato
bruto de Tethya sp. com diferentes solventes.
Consumo em porcentagem
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
Solvente utilizado
Massa obtida
(em g)
Porcentagem
HEXANO
0,10
8,0
DICLOROMETANO 0,89 71,2
ACETATO DE ETILA 0,16 12,8
METANOL 0,10 8,0
0
n=27
p=0,6209
n=19
p

Capítulo 1
______________________________________________________________________
Na primeira partição realizada utilizando os solventes clorofórmio e água
destilada, apenas os componentes da fração clorofórmica inibiram o consumo
(Figura 26).
Consumo (porcentagem)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
n=20
p

Capítulo 1
______________________________________________________________________
Consumo em porcentagem
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
n=23
p

Capítulo 1
______________________________________________________________________
Fração hexânica
Frações reunidas 37-39
Fração 42
Figura 28. Comparação da fração ativa com as frações 37-39 e 42.
44

Capítulo 1
______________________________________________________________________
Consumo (porcentagem)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
n=18
p=0,360930
n=24
p=0,236924
fração 37-39 fração 42
Controle
Tratamento
Figura 29. Média de consumo pelo paguro Calcinus tibicen de alimentos artificiais
contendo as frações 37-39 e 42. n = número de réplicas. A barra em cada coluna
corresponde ao desvio padrão.
4. Discussão
4.1. Perfil químico
Os esteróides são substâncias amplamente distribuídas em organismos
marinhos, como algas, corais, ascídias e esponjas (Seo et al. 1997, Yu et al.
2006). As esponjas são conhecidas por possuírem esteróides de alta
complexidade e esqueletos incomuns (Paul & Puglisi 2004), no entanto, no
presente estudo não encontramos esteróides de tipos raros ou incomuns.
45

Capítulo 1
______________________________________________________________________
As diversas análises químicas realizadas, corroboradas ainda pela
estatística (alto índice de similaridade), apontam para uma grande semelhança
nos componentes esteroidais majoritários das duas espécies de Tethya
estudadas, apesar de tratarem-se de espécies morfologicamente distintas
(Ribeiro 2003, Ribeiro & Muricy 2004). É possível que exista diferença na
composição química dessas espécies, porém, isso deve ser ao nível dos
componentes minoritários.
Os tipos de esteróis identificados em T. rubra e Tethya sp. são
semelhantes aos de algas verdes ou cianobactérias. Inclusive esse tipo de
associação possui registros na literatura como, por exemplo, o caso de algas
verdes encontradas no coanossoma de Tethya seychellensis nas Ilhas
Maldivas (Gaino & Sarà 1994). Essa associação em partes profundas do
esqueleto da esponja é possibilitada através da transmissão de luz através do
feixe de espículas coanossomais (Gaino & Sarà 1994). Na espécie Tethya
orphei (também provenientes das Ilhas Maldivas), cianobactérias foram
encontradas em associação mutualística (Gaino et al. 2006). Em um estudo
comparativo foi registrada a existência de diferenças espaciais na composição
das bactérias associadas em T. aurantium (Thiel et al. 2006). De outro modo,
sabemos que T. aurantium possui a capacidade de sintetizar o colesterol e o
24-metilenocolesterol, a partir do demosterol. Sendo assim, é difícil definir a
possível origem dos esteróis nessas esponjas, que tanto possuem vasta gama
de simbiontes como possuem capacidade metabólica de produzir essas
substâncias.
Na literatura podemos encontrar a presença de esteróis altamente
oxidados em esponjas Tethya (Sheikh & Djerassi 1974, Seo et al. 1997). No
46

Capítulo 1
______________________________________________________________________
entanto, no presente estudo esse tipos químicos não foram encontrados. A
semelhança entre os esteróides encontrados nas duas espécies estudadas e
outras espécies na literatura indica que esse grupo de substâncias não é um
bom marcador químico-taxonômico ao nível de espécie, porém, é possível que
seja importante em nível genérico.
Embora, diversas funções farmacológicas sejam conhecidas em
metabólitos secundários de esponjas do gênero Tethya (Barnett et al. 1980,
Silva et al. 2006, Seleguim et al. 2007), pouco se conhece sobre as possíveis
funções ecológicas dessas substâncias. Isso motivou a investigação sobre as
defesas antipredação dessas duas espécies.
4.2. Ecologia química
O extrato de Tethya sp. inibiu o consumo dos paguros Calcinus tibicen e
Clibanarius antillensis, o que confirma a capacidade de defesa química dessa
espécie contra esses predadores. Como não existiu diferença de consumo
entre as duas espécies, optou-se por utilizar apenas Calcinus tibicen nos
ensaios posteriores.
O extrato de Tethya rubra não inibiu o consumo desses caranguejos.
Apenas um trabalho na literatura científica utilizou paguros em testes de
predação: em Waddell & Pawlik (2000) o extrato bruto de 87% das espécies
testadas foram significativamente pouco consumidas pelo paguro Paguristes
punticeps.
A hipótese de balanço crescimento-diferenciação (Rhoades 1979),
considerada inicialmente para plantas terrestres, enfatiza que os recursos
devem ser alocados entre os processos de crescimento e diferenciação, sendo
47

Capítulo 1
______________________________________________________________________
que o processo de crescimento precede o processo de diferenciação,
admitindo a existência de sobreposições (Cronin & Hay 1996). Embora não
existam estudos sobre o desenvolvimento de Tethya, os indivíduos de T. rubra
são nitidamente maiores que os indivíduos de Tethya sp. (observação pessoal).
Talvez, T. rubra compense a ausência de defesa química alocando energia
para um crescimento mais eficiente, reforçando a hipótese de balanço
crescimento-diferenciação. No entanto, os extratos brutos das duas espécies
de Tethya não inibiram o consumo de peixes generalistas em experimentos de
campo, ao contrário, estimularam o consumo. O peixe Pomacanthus paru
consome Tethya cf. nigra na costa brasileira (Batista 2006), podendo indicar
mais uma espécie do gênero que não possui defesas contra o consumo por
peixes. No entanto, o extrato bruto de Tethya actinia foi considerado eficaz
evitando o consumo do peixe Thalassoma bifasciatum (Pawlik et al. 1995). Isso
evidencia as peculiaridades específicas nas defesas antipredação. Não
sabemos se predadores de grande porte, como peixes são mais dificilmente
afetados por químicas defensivas dessas esponjas. No presente estudo, a
concentração dos metabólitos foi bastante semelhante em Tethya sp. e Tethya
rubra (0,0245 g/ml e 0,0294 g/ml, respectivamente), o que, nesse caso, nos fez
concluir que a concentração dos metabólitos não está relacionado com a
existência de defesas ou não.
Durante muito tempo não existiram evidências de defesas físicas em
esponjas (Chanas & Pawlik 1995). Esse mecanismo de defesa foi
experimentalmente comprovado pela primeira vez em esponjas das Bahamas e
Mar Vermelho (Burns & Ilan 2003) e mostrou que a função das espículas não
apenas sustentam o corpo da esponja, mas também a defendem contra
48

Capítulo 1
______________________________________________________________________
predadores. Em trabalhos anteriores, as espículas não evitaram a predação
pelo paguro Paguristes puticeps, nem pelas estrelas-do-mar Echinaster
echinophorus e Echinaster sentus (Waddell & Pawlik 2000a, b). No presente
estudo, as espículas foram bastante eficientes em evitar a predação por
paguros Calcinus tibicen. Burns & Ilan (2003) concluíram que apenas espículas
maiores que ~250 repeliam a predação pelos peixes generalistas Thalassoma
klunzingeri e T. bifasciatum. Em Tethya sp. e T. rubra, existem espículas bem
maiores (de 800 a 1.800 µm). Espículas maiores, possivelmente afetam mais
eficientemente organismos de pequeno porte, como o paguro C. tibicen do que
peixes e estrelas do mar, devido aos tamanhos relativos do aparato bucal e
estômago desses animais.
A concentração natural calculada de espículas em T. rubra foi cinco
vezes maior que em Tethya sp. Por essa razão, não foi possível aderir a
concentração natural de espículas na matriz de carragenana que é a base do
alimento artificial. O ensaio foi realizado com espículas em aproximadamente
um terço da concentração natural e isso pode signicar que a repelência a
predadores causadas por essas espículas pode ser ainda maior que a
detectada neste estudo. De maneira geral, as concentrações de espículas
encontradas nessas espécies de Tethya são superiores aos encontrados em
diversas espécies caribenhas (Tabela 4).
49

Capítulo 1
______________________________________________________________________
Tabela 4. Densidade de espículas em espécies do Brasil e Caribe em ordem
decrescente. * Jones et al. 2005. a de Bahamas, consistência macia. b de Florida Keys,
consistência rígida. c de Bahamas, consistência rígida.
Espécie Densidade (g/mL-1)
Tethya rubra (presente estudo) 0,4016
Tethya sp. (presente estudo) 0,0868
*Xestospongia muta c 0,0692
*Xestospongia muta b 0,0397
*Cribrochalina infundibulum 0,0294
*Cynachyrella alloclada 0,0276
*Xestospongia muta a 0,0240
*Tedania ignis 0,0146
*Svenzea zeai 0,0116
*Clathria virgultosa 0,0102
*Niphates digitalis 0,0094
*Agelas clathroides 0,0052
A densidade de espículas foi relacionada positivamente com o fluxo de
água (Palumbi 1986, McDonald et al. 2002). Além disso, dentro do corpo da
esponja, as espículas podem ter uma distribuição diferenciada, se acumulando
em algumas partes e apresentando menor densidade em outras. Por isso, para
o cálculo da concentração natural foi utilizada a média de cinco fragmentos de
diferentes esponjas englobando tanto o ectossoma como o endossoma.
50

Capítulo 1
______________________________________________________________________
A simulação da defesa física em alimentos artificiais possui limitações uma vez
que apresentam as espículas desorganizadas e distribuídas de forma
homogênea, diferentes da situação encontrada na natureza.
Alguns trabalhos sugerem que as defesas químicas são a principal
forma de defesas antipredação, enquanto as espículas e espongina possuem
função estrutural principalmente (Chanas & Pawlik 1995, 1996, Pawlik et al.
1995). Porém, estratégias físicas de defesas representadas pelas espículas
foram mais importantes que químicas em T. rubra. Isso pode funcionar
especialmente em espécies que não possuem química defensiva. De qualquer
forma, as defesas parecem funcionar especificamente para um determinado
predador. Por exemplo, as espículas não funcionam bem para defender
esponjas de peixes ou estrelas do mar (Pawlik et al. 1995, Chanas & Pawlik
1996, Waddell & Pawlik 2000b). No entanto, as espículas podem ser a
principal defesa de T. rubra contra o consumo por paguros e isso pode ocorrer
em outras espécies de esponjas em relação a outros predadores.
O efeito da união das defesas químicas e físicas em esponjas é ainda
pouco estudado (Jones et al. 2005). No presente estudo, foi considerada a
existência de aditismo em ambos os casos, uma vez que não houveram
diferenças significativas no consumo das defesas isoladas quando comparadas
ao consumo dos dois elementos associados. A existência de aditismo nas
defesas antipredação já foi registrada para outras espécies de esponjas como
Cribrochalina infundibullum e Tedania ignis, por exemplo (Jones et al. 2005).
Esponjas podem apresentar diferentes estratégias contra a predação,
mesmo apresentando grande afinidade taxonômica, como por exemplo, Tethya
(presente estudo), Dysidea, Niphates e Mycale (Pawlik et al. 1995).
51

Capítulo 1
______________________________________________________________________
Recentemente, foi registrado que predadores podem distinguir espécies
congenéricas simpátricas, como foi o caso da estrela do mar Oreaster
reticulatus que preda Tedania ignis, mas não Tedania klausi que ocorre no
mesmo local (Wulff 2006). É importante destacar que essas espécies possuem
poucas diferenças externas, o que evidencia a existência de uma detecção
química apurada por parte dos predadores. Por outro lado, Pawlik et al. (1995)
encontrou homogeneidade de respostas de defesas antipredação ao nível de
ordem, como houve em Homosclerophorida e Axinellida, e também de gênero,
Agelas e Plakortis.
As duas espécies estudadas apresentaram semelhança quase total em
seus componentes químicos majoritários e ainda assim possuem diferentes
efeitos sobre paguros. Em duas espécies do gênero Mycale, pequenas
diferenças detectadas na composição de ácidos graxos foi sugerida como
responsáveis pelas diferenças encontradas na capacidade de impedir o
assentamento de larvas do poliqueta Hydroides elegans (Lee et al. 2007). No
caso de Tethya, é provável que a substância causadora da defesa esteja
contida na porção de elementos minoritários do extrato, dada a grande
semelhança na composição dos componentes majoritários.
Em Callyspongia spp. apesar da existência diferenças de composição
nas bactérias associadas, análises em CG-MS encontraram mais de 60% dos
compostos similares (Qian et al. 2006). Nas duas esponjas estudadas, C.
plicifera e Callyspongia sp, o extrato bruto inibiu o assentamento das larvas da
craca Balanus amphitrite e do poliqueta Hydroides elegans (Qian et al. 2006).
Apesar da capacidade de mobilidade já comprovada em esponjas do
gênero Tethya (Fishelson 1981, Nikel 2006) não existem evidências que essa
52

Capítulo 1
______________________________________________________________________
característica pode atuar contra a predação, tornando de suma importância o
papel exercido pelas defesas químicas e físicas para manutenção dessas
populações.
A partir do fracionamento do extrato bruto de Tethya sp. seguido por
ensaios biológicos, encontramos que a fração ativa hexânica é rica em
esteróis, como foi observado através de análises químicas. Porém, nos testes
biológicos realizados com as frações semi purificadas não foi possível indicar
diferenças significativas no consumo de alimentos artificiais (Figura 29). Isso
pode ser atribuído ao fato de que a quantidade testada foi inferior a
concentração natural esperada.
5. Conclusões
O perfil químico de Tethya sp. e Tethya rubra é bastante semelhante,
especialmente no que diz respeito aos componentes majoritários. Apesar disso,
as respostas antipredação dessas espécies apresenta diferenças. Isso
evidenciou a importância dos metabolitos minoritários como responsáveis por
defesas antipredação nestas espécies.
Ao contrário das defesas químicas, as defesas provenientes de
componentes estruturais (defesas físicas) são geralmente vistas como menos
eficientes e com papel secundário na capacidade defensiva, porém, no caso da
esponja Tethya rubra, as espículas representaram maior eficácia que seu
extrato bruto.
O efeito sinergístico que pode existir quando consideramos a atuação
das espículas em conjunto com as defesas químicas não foi detectada em
53

Capítulo 1
______________________________________________________________________
nenhuma das duas espécies estudadas, sendo considerado aditismo o efeito
encontrado.
54

Capítulo 2
______________________________________________________________________
Capítulo 2
Variação intrapopulacional nos metabólitos de
Tethya sp. e perfil químico dos brotos

Capítulo 2
______________________________________________________________________
1.Introdução
Diversos fatores têm sido apontados como causadores de variações na
produção dos metabólitos secundários. Em ambientes terrestres sabe-se que a
qualidade e intensidade da luz, deficiências minerais, disponibilidade de água,
temperatura, estágio fisiológico, genética, estresse, predadores, patógenos e
competidores são alguns dos fatores que regulam a produção de metabólitos
secundários em plantas superiores (Rice 1984, Karban & Baldwin 1997, Wink
1999).
Em ambientes marinhos, o nível de exposição dos organismos a
consumidores, a época do ano, a localização geográfica da comunidade ou até
mesmo a ação de consumidores pode alterar a defesa química dos organismos
(Pereira 2002). A existência dessa variação foi evidenciada principalmente em
trabalhos sobre algas, corais moles e moluscos (Ávila & Paul 1997, Meyer &
Paul 1992, Van Alstyne & Paul 1992, Sudatti et al. 2006). Estudos também
apontam a predação como um dos principais fatores que influenciam variações
na produção de metabólitos (Paul & Van Alstyne 1992, Teeyapant & Proksch
1993, Cronin & Hay 1996).
Poucas vezes na literatura avaliou-se a variabilidade de defesas entre
espécies com grande afinidade taxonômica. Inclusive, a presença de certas
classes de substâncias é conservativa dentre os grupos de esponjas,
representando uma característica taxonômica (Bergquist & Wells 1983;
Braekman et al. 1992). Porém, a relação que pode existir em respostas
antipredação em um grupo de esponjas com as mesmas classes de
56

Capítulo 2
______________________________________________________________________
substâncias ainda é desconhecida, ou seja, não se sabe se esponjas com
perfis químicos semelhantes têm respostas semelhantes à predação.
Pawlik et al. (1995) encontrou uma grande homogeneidade na resposta
de repelência a predadores em extratos brutos de esponjas pertencentes à
uma mesma ordem e a um mesmo gênero. Apesar disso, algumas espécies do
mesmo gênero podem mostrar diferentes respostas a predadores, bem como
Mycale laevis - sem defesa e M. laxissima - com defesa química (Pawlik et al.
1995). Nesse estudo, porém, o perfil químico das espécies envolvidas não foi
avaliado.
Estudos indicaram que além de estarem presentes em indivíduos
adultos, defesas contra a predação podem ocorrer em suas unidades de
propagação, constituindo uma importante estratégia de sobrevivência,
somadas a outras já conhecidas como a transparência e o pequeno tamanho
da larva (Brooks & Dobson 1965, Zaret & Kerfoot 1975) e defesas morfológicas
(Pennington & Chia 1984, Morgan 1989).
Durante muitas décadas acreditava-se que a maioria das larvas
marinhas eram presas totalmente vulneráveis para a maior parte dos
organismos planctívoros, inclusive foi proposta de incompatibilidade biológica
no rápido desenvolvimento de novos tecidos e a presença de substâncias
tóxicas (Orians & Janzen 1974).
Os primeiros trabalhos sobre este tema evidenciaram a existência de
defesas químicas em larvas de estrela-do-mar (Lucas et al. 1979), ascídias
(Young & Bingham 1987, Lindquist et al. 1992) e em ovos de nudibrânquios
(Pawlik et al. 1988). Uriz et al. (1996) constataram que larvas da esponja
Dysidea avara não eram consumidos pelo ouriço Paracentrotus lividus.
57

Capítulo 2
______________________________________________________________________
Lindquist & Hay (1996) pesquisaram as defesas químicas de larvas de
esponjas marinhas e corais caribenhos. Eles concluíram que, de maneira geral,
alguns grupos de invertebrados possuem larvas impalatáveis, enquanto outros
não. Por exemplo, as larvas das 11 espécies de esponjas testadas foram
impalatáveis para peixes e, ao contrário, larvas de corais hermatípicos foram
palatáveis. No entanto, larvas impalatáveis nem sempre são provenientes de
adultos impalatáveis, como foi o caso da esponja Callyspongia vaginalis
(Lindquist & Hay 1996). A palatabilidade das larvas pode variar também entre
espécies em um grupo e até mesmo entre indivíduos dentro de uma espécie,
como foi o caso das gorgônias (Lindquist & Hay 1996). Outra interessante
descoberta é que as larvas impalatáveis, depois de atacadas e rejeitadas não
sofrem dano que prejudique o seu desenvolvimento.
Algumas espécies de esponjas se reproduzem de maneira assexuada,
por brotamento, como Tethya e Chondrilla (Bergquist & Sinclair 1973, Fell
1993). Não se sabe se, nesse caso, as unidades reprodutivas também podem
apresentar defesas químicas.
As defesas químicas presentes em estruturas de propagação podem
atuar contra consumidores e competidores, além de constituírem,
presumivelmente, uma vantagem em caso de invasões (Pereira 2002).
O gênero Tethya é caracterizado por esponjas com simetria radial,
esqueleto composto por espículas e se reproduz sexuada e assexuadamente,
o que a torna ideal para estudo de defesas químicas, físicas, interações entre
defesas, assim como investigações sobre defesas em suas unidades de
propagação, os brotos. Esse gênero, representado por diversas espécies,
possui ampla distribuição na costa brasileira (Ribeiro 2003), porém, ainda não
58

Capítulo 2
______________________________________________________________________
foram alvos de estudos ecológicos, ou mesmo sobre efeitos aditivos, sinérgicos
ou antagônicos de defesas químicas e físicas, seja em indivíduos adultos ou
em suas estruturas reprodutivas, os brotos.
O objetivo desse capítulo foi investigar: (a) a variação nos metabólitos
secundários da esponja Tethya sp. e (b) o perfil químico dos brotos de Tethya
sp.
2. Materiais e Métodos
2.1. Coletas
Ver sessão “Coletas” no Capítulo 1.
Para obtenção dos brotos de Tethya sp., espécimes desta esponja foram
coletados e os brotos foram separados dos adultos com auxílio de lupa e pinça
(Figura 3). Posteriormente, as amostras foram congeladas para liofilização.
Figura 1. (A) Um broto de Tethya sp. na extremidade da pinça. Escala = 1 cm, (B)
brotos vistos sob lupa.
59

Capítulo 2
______________________________________________________________________
2.2. Extração química e isolamento de produtos naturais
Os brotos liofilizados foram extraídos em acetona durante 3 dias,
ocorrendo filtração e troca de solvente a cada 24 horas. Os extratos brutos em
acetona dos brotos e dos adultos foram analisados em CG/MS (veja Capítulo
1).
60

Capítulo 2
______________________________________________________________________
3. Resultados
3.1. Variação intrapopulacional de esteróis em Tethya sp.
A concentração do colesta-4,6-dienol-3 (Figura 2 - 2a) variou de 1,35 %
a 12,11% entre os dez indivíduos analisados (Figura 3). Dos oito metabólitos
estudados, o colesterol (Figura 2 - 1a) alcançou as maiores porcentagens e
variou de 11,39 % a 35,45% (Figura 2 - Figura 4). A concentração do ergosta-
5,22-dienol-3 (Figura 2 - 1d) variou de 3,19 % a 10,55% (Figura 2 - Figura 5). A
concentração do ergosta-5,24(28)-dienol-3 (Figura 2 - 1e) foi a menor dentre as
substâncias analisadas, variou de 1,95 % a 6,90% (Figura 6). A concentração
do estigmasta-5-enol-3 (Figura 2 - 1f) variou de 4,56% a 11,92% (Figura 7).
61

Capítulo 2
______________________________________________________________________
HO
2
3
HO
2
3
1
10
4
19
5
1
4
10
11
9
19
H
6
5
1
12
13
H
11
9
H
6
8
7
2
18
H
12
21
14
13
H
8
7
18
H
15
R
21
17
14
16
15
R
17
16
21 22
20
21 22
Figura 2. Estrutura dos principais esteróis detectados das espécies de Tethya sp. (RJ)
e Tethya rubra da (BA).
20
23
a
b
c
d
23
a
24
24
26
25
26
27
25
27
e
f
g
h
28
29
62

Capítulo 2
______________________________________________________________________
13%
10%
8%
5%
3%
0%
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
colesta-4,6-dienol-3
Figura 3. Concentração de colesta-4,6-dienol-3 em 10 indivíduos de Tethya sp.
40%
30%
20%
10%
0%
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
colesterol
Figura 4. Concentração de colesterol em 10 indivíduos de Tethya sp.
63

Capítulo 2
______________________________________________________________________
12%
10%
8%
6%
4%
2%
0%
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
ergosta-5,22-dienol-3
Figura 5. Concentração de ergosta-5,22-dienol-3 em 10 indivíduos de Tethya sp.
8%
6%
4%
2%
0%
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
ergosta-5,24(28)-dienol-3
Figura 6. Concentração de ergosta-5,24(28)-dienol-3 em 10 indivíduos de Tethya sp.
64

Capítulo 2
______________________________________________________________________
15%
12%
9%
6%
3%
0%
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
estigmasta-5-enol-3
Figura 7. Concentração de estigmasta-5-enol-3 em 10 indivíduos de Tethya sp.
65

Capítulo 2
______________________________________________________________________
Figura 8. Cromatograma do extrato bruto dos brotos de Tethya sp. (CG/MS).
Legenda:
A = Colesta-5,22-dienol-3 (C27H44O; FM = 384.34), Figura 2 - 1b
B = Colesterol (C27H46O; FM = 386.36), Figura 2 - 1a
C = Ergosta-5,22-dienol-3 (C28H46O; FM = 398.36), Figura 2 - 1d
D = Estigmasta-5,24-dienol-3 (C29H50O; FM = 414.39), Figura 2 - 1h
E = (provável) Colesta-5-enol- 3-ona-7 (C27H44O2; FM = 400.33), Figura 10
66

Capítulo 2
______________________________________________________________________
Figura 9. Cromatograma do extrato bruto de adultos de Tethya sp. (CG/MS).
Legenda:
A = Colesterol (PM = 386.36; FM = C27H46O) Figura 2 - 1a
B = Ergosta-5,22-dienol-3 (PM = 398.36; FM = C28H46O) Figura 2 - 1d
C = Ergosta-5, 24(28)-dienol-3 (PM = 398.36; FM = C28H46O) Figura 2 - 1e
D = Estigmasta-5-enol-3 (PM = 414.39; FM = C29H50O) Figura 2 - 1f
67

Capítulo 2
______________________________________________________________________
Tabela 1. Concentração relativa (%) dos principais esteróis de Tethya sp. nos brotos e
nos adultos. N.d. = não detectado.
Produto Concentração relativa (%)
Adultos
Concentração relativa (%)
Brotos
Colesta-5,22-dienol-3 n.d. 8,96
Colesterol 45,57 22,12
Ergosta-5,22-dienol-3 19,69 12,48
Estigmasta-5,24-dienol-3 9,39 16,38
Colesta-5-enol- 3-ona-7 n.d. 11,37
Ergosta-5, 24(28)-dienol-3 6,64 n.d.
HO O
Figura 10. Colesta-5-enol- 3-ona-7 (presente nos brotos, não detectado nos indivíduos
adultos)
4. Discussão
Diversos fatores, tanto bióticos quanto abióticos têm sido indicados
como responsáveis pela variação na concentração de metabólitos secundários
em organismos marinhos (e.g. Lubchenco & Gaines 1981, Becerro et al. 1995,
Pawlik 1997, 1998, Becerro & Paul 2004). No entanto, esse estudo foram
encontradas significativas variações nas concentrações de metabólitos entre
indivíduos de uma mesma população e coletados em um único evento, ou seja,
68

Capítulo 2
______________________________________________________________________
sujeitos aos mesmos fatores abióticos (como nível de exposição, luminosidade,
hidrodinamismo) e fatores bióticos (sujeitos a mesma intensidade de predação
e aos mesmos predadores, competidores e etc...). Isso indica que variações
intra-individuais intrínsecas podem ser tão importantes como as causadas por
fatores externos ao organismo. No entanto, a amplitude dessa variação não é
conhecida entre populações, pois não existem outros dados na literatura para
comparação.
Embora se encontre na literatura algumas menções sobre variabilidade
intrapopulacional na produção de metabolitos secundários em organismos
marinhos (Hay 1996, Pereira & da Gama 2008, como revisões), até bem pouco
tempo não existia qualquer estudo que realmente tivesse analisada cada
indivíduio de uma determinada população. Numa avaliação de 70 indivíduos da
macroalga vermelha Laurencia obtusa foi constatado que existe uma grande
variabilidade intrapopulacional na produção de um metabolito majoritário que
atua como defesa química contra herbívoros (Sudatti et al. 2006).
Os estudos em ecologia química, sejam eles com espécies marinhas ou
terrestres, começam pela obtenção de extratos brutos provenientes de um
número variável de indivíduos submetidos à extração. A quantidade de extrato
obtida, em função da quantidade de material, revela o teor natural em uma
espécie, mas perde-se a amplitude de variabilidade natural, seja de um extrato
ou mesmo de uma substância. No entanto, a variabilidade na produção de um
determinado metabolito é um aspecto extremamente importante uma vez que é
nesta variabilidade que uma determinada interação biológica é estabelecida. A
variabilidade encontrada em indivíduos de Tethya sp., neste estudo, assim
como a observada em Laurencia obtusa (Sudatti et al. 2006), podem indicar ser
69

Capítulo 2
______________________________________________________________________
essa uma variação comum e constitui aspecto fundamental para o
entendimento da ecologia e evolução das interações mediadas quimicamente.
As análises em CG/MS do extrato bruto dos brotos evidenciaram sua
semelhança com os produtos principais dos adultos, os esteróis. Apenas
esteróis de ampla ocorrência foram observados nos brotos e nos adultos. No
entanto, o colesterol, por exemplo, é muito mais abundante nos adultos
(45,57%) do que nos brotos (22,12%), indicando que pode haver acumulação
deste esterol ao longo de seu ciclo de vida. Foi possível notar que esteróis
mais oxidados são encontrados nos brotos, inclusive produtos contendo um
grupamento acetona (Fig. 10).
No presente estudo não foram realizados ensaios para verificação de
ação defensiva antipredação do extrato bruto dos brotos, particularmente
devido à pequena quantidade de extrato obtida. Sem dúvidas, o reduzido
tamanho destes brotos requer um esforço enorme para que se tenha biomassa
suficiente para obtenção de extrato adequado para a realização de testes. No
entanto, é possível pressupor a existência de defesas químicas antipredação
nos brotos devido a sua semelhança com o perfil os adultos analisados. Por
outro lado, alguns estudos mostram a apossibilidade de transmissão de
bactérias dos adultos para os brotos. Se, de fato, as bactérias estão envolvidas
na produção das substâncias defensivas nesta espécie de esponja, a
possibilidade de defesas do broto é ainda maior (Thiel et al. 2006).
70

Capítulo 2
______________________________________________________________________
Hoje sabemos que diversas estruturas de propagação são igualmente
defendidas como os adultos onde são gerados, incluem zigotos de macroalgas
(Hay et al. 1998, Schnitzler et al. 1998) e larvas de diversos invertebrados
como estrelas-do-mar (Lucas et al. 1979), ascídias esponjas e corais (Young &
Bingham 1987, Lindquist et al. 1992, Lindquist & Hay 1996) e e ovos de
nudibrânquios (Pawlik et al. 1988). Se vir a ser confirmada futuramente, os
brotos de Tethya sp. serão o primeiro exemplo de estrutura de propagação
vegetativa possuindo defesa química antipredação.
5. Conclusão
A variação nas concentrações dos metabólitos secundários pode ocorrer
não apenas devido a fatores externos à esponja (biótico e abióticos), mas deve
ser considerado também fator intrínseco, uma vez que encontramos variações
em diversos metabólitos de Tethya sp.
A possibilidade de defesa nos brotos de Tethya sp. pode ser uma
importante vantagem ecológica para essa espécie, uma vez que as taxas de
mortalidade de larvas (=estruturas de propagação) é apontada como um dos
fatores fundamentais no estabelecimento de populações marinhas bentônicas.
71

Capítulo 3
______________________________________________________________________
Capítulo 3
Multifuncionalidade na química defensiva de
Hymeniacidon heliophila contra predadores

Capítulo 3
______________________________________________________________________
1. Introdução
Defesas químicas que inibem o consumo por predadores ocorrem em
diversos organismos marinhos, inclusive em esponjas (Pawlik et al. 1995,
Pereira et al. 2000, Waddell & Pawlik, 2000 a, b; Clavico et al. 2006)
constituindo um dos aspectos mais estudados no âmbito da ecologia química
marinha (Waddel & Pawlik 2000, Pawlik et al. 2002, Burns & Ilan 2003, Toms &
Schupp 2007).
As defesas antipredação representam uma importante vantagem
ecológica, pois possibilitam a permanência de populações de indivíduos que a
produzem em ambientes com alta pressão de predação, como é o caso de
ambientes tropicais, onde muitas vezes, são organismos dominantes na
comunidade (Reiswig 1973, Shuchanek et al. 1983, Wenner et al. 1983). Entre
outros parâmetros, essa dominância pode ser causada pela presença de
metabólitos secundários que inibem a predação. Contudo, a produção de
metabólitos secundários preconiza um considerável gasto metabólico e uma
medida para otimizar o custo energético de sua produção é a possibilidade de
múltiplas atuações para essas substâncias (Schmitt et al. 1995, Pereira et al.
2003).
Múltiplas funções de metabólitos secundários foram bem demonstradas
no trabalho de Thompson et al. (1985) no qual os autores relatam que extratos
de quarenta espécies de esponjas marinhas de San Diego exibiram atividades
biológicas e/ou ecológicas em relação a distintas atividades como: inibição de
desenvolvimento de fungos e bactérias, inibição de assentamento e
metamorfose de larvas de invertebrados marinhos e, também, defesa
73

Capítulo 3
______________________________________________________________________
antipredação por diversos peixes. Neste estudo, a maior parte dos extratos foi
eficiente em mais de um dos testes realizados, evidenciando a
multifuncionalidade dessas substâncias. Porém, quando tratamos de defesas
antipredação, pouco se sabe sobre a amplitude do efeito dos metabólitos
contra a ação de variados predadores. Quanto mais ampla a atuação dessas
substâncias, maior a vantagem ecológica adquirida pela esponja e mais
chances de estabelecimento de novas populações, uma vez que a predação é
a principal interação responsável pela mortalidade de organismos bênticos e a
distribuição de esponjas pode ser fortemente afetada pela atuação de
predadores (Pawlik 1997, 1998).
Geralmente, as defesas antipredação são testadas em ensaios
utilizando apenas um tipo de predador, o que não permite dimensionar a
magnitude da proteção ao consumo representado pelas substâncias químicas
contidas em uma espécie de esponja. O entendimento desse aspecto é muito
importante para melhor compreensão do papel ecológico de defesas químicas
nas interações presa-predador envolvendo esponjas marinhas.
O gênero Hymeniacidon é amplamente distribuído no mundo e no Brasil
está restrito a região sul e sudeste, de Santa Catarina ao Rio de Janeiro
(Mothes et al. 2003, Muricy & Hajdu, 2006) sendo representado apenas pela
espécie H. heliophila (Figura 1). Essa espécie é umas das mais resistentes à
poluição, sendo abundante em praias da Baía de Guanabara que recebem
diariamente grande quantidade de poluição orgânica e inorgânica (Perri 2000).
A esponja Hymeniacidon heliophila é encontrada comumente na faixa entre
marés e a capacidade de ocupar ambientes com alta intensidade luminosa
pode ser relacionada à presença de uma potente substância anti-oxidante que
74

Capítulo 3
______________________________________________________________________
ocorre em abundância em H. heliophila, o L-5-hidroxitriptofano (Lysek et al.
2003). Além disso, esta espécie possui substâncias com atividade
antibacteriana (Muricy & Silva 1999) e suas células já foram utilizadas com
sucesso em culturas, inclusive de espécies que produzem moléculas bioativas
(Pomponi & Willoughby 1994, Custódio et al. 2004)
f
Figura 1. Esponja Hymeniacidon heliophila (Parker 1910). Foto: G. Muricy.
O objetivo da pesquisa reunida neste capítulo foi investigar se extratos
de Hymeniacidon heliophila atuam como defesa antipredação frente a ouriços,
peixes e paguros, constituindo múltiplas funções ou expressões ecológicas.
2. Materiais e Métodos
2.1. Locais de coleta e experimentos
Exemplares da esponja Hymeniacidon heliophila foram coletados
através de mergulho livre na Praia de Itaipu, Niterói – Rio de Janeiro (Figura 2).
Nesse local, H. heliophila é abundante e ocupa a faixa entre-marés. As
esponjas foram mantidas congeladas até a liofilização. Os ouriços (Lytechinus
75

Capítulo 3
______________________________________________________________________
variegatus) e paguros (Calcinus tibicen) utilizados em experimentos também
foram coletados nesse local e devolvidos após o término de cada ensaio. Os
experimentos com peixes generalistas foram realizados na Enseada do Forno,
Arraial do Cabo – Rio de Janeiro (Figura 3).
Figura 2. Praia de Itaipu, Niterói, Rio de Janeiro (Modificado de Salvador e Silva
2002). A seta indica o local de coleta dos organismos.
76

Capítulo 3
______________________________________________________________________
Figura 3. Enseada do Forno, Arraial do Cabo, Rio de Janeiro (Modificado de Ribeiro et
al. 2003). A seta indica o local onde foram realizados experimentos.
2.2. Obtenção de extratos brutos
A extração dos espécimes de Hymeniacidon heliophila foi realizada de
modo seqüencial, a partir da esponja liofilizada, utilizando três solventes de
polaridade crescente (hexano (C6H14), acetato de etila (AcOEt) e uma mistura
1:1 de Acetona (Me2CO)/MeoH (Figura 4).
77

Capítulo 3
______________________________________________________________________
Figura 4. Método de obtenção dos três extratos de Hymeniacidon heliophila (EB1-
Haxano, EB2- Acetato de etila, e EB3- Metanol).
2.3. Bioensaios
Ver detalhes no Capítulo 1, página 19-21.
2.4. Tratamento Estatístico
A normalidade dos dados foi aferida com o teste de Kolmogorov-
Smirnov. Os dados em porcentagem foram previamente transformados para
arco-seno de acordo com a recomendação de Zar (1999). Para análise dos
resultados dos bioensaios, foi utilizado o teste t para amostras dependentes e
considerado significativo p < 0,05.
78

Capítulo 3
______________________________________________________________________
3. Resultados
As cromatografias dos extratos de H. heliophila mostraram grande
similaridade entre os componentes químicos dos extratos EB1 e EB2 (manchas
cromatográficas similares), enquanto o extrato EB3 apresenta composição
química distinta dos extratos anteriores, devido a presença de componentes
mais polares (Figura 5). A presença dos mesmos componentes nos extratos
EB1 e EB2 deve-se a utilização de um método seqüencial de extração não-
exaustivo. A diferença entre os dois extratos, portanto, deve ser atribuída a
variação quantitativa dos componentes químicos.
Figura 5. Cromatografia em Camada Delgada dos extratos de Hymeniacidon
heliophila. (A) Placa não revelada e (B) placa revelada com sulfato cérico.
79

Capítulo 3
______________________________________________________________________
No bioensaio com o paguro Calcinus tibicen, o consumo do extrato EB1
e EB2 foi significativamente inferior ao controle (p < 0,001 e 0,035,
respectivamente) caracterizando a ação defensiva de ambos os extratos. No
entanto, o extrato EB3 foi eficaz como defesa frente a Calcinus tibicen apenas
durante as primeiras 15 horas de experimento (p < 0,001, Figura 6) enquanto
que nas horas subseqüentes a diferença de consumo entre controle e
tratamento não foi significativa (p = 0,103).
Consumo (%)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
n=28
p

Capítulo 3
______________________________________________________________________
ligeiramente mais consumidos do que seus respectivos controles, mas não
estatisticamente significativos para caracterizar um estímulo ao consumo (p=
0,43 e 0,42, respectivamente, Figura 7).
Consumo (%)
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
n=23
p=0,02313
n=23
p=0,4328
EB1 EB2 EB3
Controle
Tratamento
n=23
p=0,4170
Figura 7. Média de consumo de alimentos artificiais, controle e tratamento (contendo
extratos de H. heliophila) pelo ouriço Lytechinus variegatus. O número de réplicas
utilizadas está indicado acima das colunas correspondentes assim como o valor de p.
A barra vertical acima de cada coluna corresponde ao desvio padrão.
Em relação ao consumo por peixes, os extratos EB1 e EB3 não aturam
como defesa química (p= 0,4955 e 0,1590, respectivamente), mas apenas o
EB2 (p= 0,0288, Figura 8).
81

Capítulo 3
______________________________________________________________________
Consumo (%)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
n=20
p=0,4955
n=20
p=0,0288
n=20
p=0,1590
EB1 EB2 EB3
Controle
Tratamento
Figura 8. Média de consumo de alimentos artificiais controle e tratamento (contendo
extratos de H. heliophila) por peixes em campo. O número de réplicas utilizadas está
indicado acima das colunas correspondentes assim como o valor de p. A barra vertical
acima de cada coluna corresponde ao desvio padrão.
82

Capítulo 3
______________________________________________________________________
4. Discussão
A cromatografia evidenciou a semelhança na composição das
substâncias majoritárias dos extratos brutos em Hexano-EB1 e Acetato de
Etila-EB2, enquanto o extrato em Metanol-EB3, possui composição química
distinta. Estudos químicos mais aprofundados são necessários para um melhor
conhecimento sobre a composição desses extratos ou mesmo para que
possam explicar as expressões ecológicas que possuem, seja como defesa
antipredação ou de qualquer outra natureza.
Os três extratos testados (alta, média e baixa polaridades) foram
capazes de inibir o consumo por paguros. O extrato mais polar (Metanol-EB3)
pode ter funcionado apenas nas primeiras 15 horas de experimento devido a
sua rápida dissolução na água do aquário, devido à compatibilidade de
polaridade dos componentes extraídos por metanol. No entanto, os dois outros
extratos (Hexano-EB1 e Acetato de Etila-EB2) mantiveram a ação defensiva
por razão oposta à resposta do EB3. Os paguros testados, da espécie Calcinus
tibicen, ocorrem comumente na mesma faixa de H. heliophila na Praia de Itaipu
e seriam capazes de consumir pequenos pedaços de esponja se esta não
apresentar nenhum tipo de defesa. A inibição causada pelos três extratos de H.
heliophila significa uma importante proteção que pode estar representada por
substâncias de classes químicas distintas. Não sabemos se essas substâncias
podem atuar em conjunto e ter seu efeito potencializado (efeito sinergístico).
De qualquer maneira, H. heliophila parece estar eficientemente protegida da
predação por paguros.
83

Capítulo 3
______________________________________________________________________
O extrato em hexano-EB-1 foi o único que atuou como defesa frente ao
ouriço Lytechinus variegatus. Os ouriços são importantes consumidores de
organismos bentônicos, em especial bancos de algas, mas sabe-se que ele
apresenta hábito generalista por consumir uma grande variedade de
invertebrados (Barnes, 1987), inclusive esponjas marinhas (Vance 1979, Ayling
1981, Santos et al. 2002). Aparentemente, em H. heliophila, apenas
substâncias apolares causam inibição de consumo por ouriços. Outra espécie
desse gênero, Hymeniacidon sp. também possui defesas químicas contra a
predação pelo ouriço Diadema setosum (Burns et al. 2003), no entanto, foi
utilizado o extrato bruto total (não separado por polaridades), o que não permite
comparações em relação a polaridade da(s) substância(s) envolvida(s) na
defesa contra ouriços.
De uma maneira geral, duas abordagens são empregadas na avaliação
da ação defensiva de metabólitos secundários no ambiente marinho. Na
abordagem simpátrica deve-se considerar a possibilidade de contra-adaptação
por parte do consumidor vivendo associado ao organismo produtor de alguma
defesa química potencial (McClintock & Baker 1997). Ao contrário, na
abordadem alopátrica avalia-se a magnitude de uma ação defensiva (Hay
1996). No presente trabalho foi empregada uma abordagem simpátrica para os
ensaios com o ouriço L. variegatus e o paguro Calcinus tibicen, mas a eficácia
da ação defensiva foi verificada, ou seja, estes consumidores não
desenvolveram qualquer tipo de adaptação para minimizar esta ação. De fato,
não basta ocorrer próximo, pois apenas consumidores que vivem diretamente
associados a hospedeiros são conhecidos por consumirem seus hospedeiros e
a ele viverem associados (Hay 1992). Os indivíduos de L. variegatus, ao
84

Capítulo 3
______________________________________________________________________
contrário daqueles de Calcinus tibicen, ocorrem em faixa do litoral abaixo de
onde ocorre H. heliophila. No entanto, a partir dos resultados obtidos, podemos
afirmar que H. heliophila possui defesa química eficiente para protegê-la da
ação de ambos consumidores simpátricos.
Em relação ao consumo por peixes generalistas, apenas o extrato
considerado de média polaridade foi eficaz em inibir a predação por estes
vertebrados. Durante o ensaio, era freqüente a observação de Stephanolepsis
hispidus (família Monacanthidae) consumindo, preferencialmente, os alimentos
artificiais. Isso pode ter ocorrido devido a sua conhecida abundância na região
de Arraial do Cabo, e também por possuir hábito alimentar onívoro (Ferreira et
al. 2004, Ferreira et al. 2001). O extrato hidrofílico da esponja H. heliophila da
costa dos Estados Unidos foi menos consumido pelo peixe generalista
Lagodon rhomboides, enquanto o extrato lipofílico não inibiu o consumo por
esse peixe (Stachowicz & Hay 2000). Inclusive, caranguejos do gênero Libinia
utilizam-se de H. heliophila para se camuflar e evitar a predação sobre eles
(Stachowicz & Hay 2000). A esponja intacta (in natura) também foi oferecida a
L. rhomboides em ensaios e foi pouquíssimo consumida, em torno de 10% em
média (Stachowicz & Hay 2000). O extrato bruto de H. heliophila também foi
eficaz na inibição do consumo pelo peixe Thalassoma klunzingeri (Burns et al.
2003) Curiosamente, em experimentos com estrelas-do-mar, Waddell & Pawlik
(2000a) utilizaram H. heliophila para alimentá-las em tanques antes de iniciar
experimentos de consumo com extratos de outras espécies de esponjas,
evidenciando assim que contra as estrelas Echinaster echinophorus e E.
sentus não existem defesas eficazes em H. heliophila. Por outro lado, estes
resultados expressam que a defesa química não é uma característica absoluta
85

Capítulo 3
______________________________________________________________________
de uma espécie. Ela pode variar em concentração, dependendo do local onde
a espécie que a produz ocorre, assim como em ação frente diferentes
consumidores (Pereira & da Gama 2008).
A substância 5-hidroxitriptofano já foi isolada de extratos polares dessa
esponja, e possui atividade antibiótica, no entanto, não se sabe se esta pode
ser responsável pela atividade antipredação contra quaisquer consumidores
(Pomponi & Willoughby 1994).
A inibição de consumo por extratos de alta polaridade (ouriços, paguros),
média e baixa polaridade (peixes, paguros) sugere que classes diferentes de
substâncias estejam relacionadas a ação defensiva antipredação nesta
esponja. Algumas substâncias esteroidais dessa esponja já foram identificadas,
como: colesterol, colestanol, brassicasterol, 24-metilcolesterol, 24-etilcolesterol
(Granato et al. 2000). Geralmente, substâncias dessa natureza dificilmente
estão especificamente relacionadas à defesa do organismo, pois são
amplamente distribuídas em esponjas. No entanto, estudos com a esponja
Tethya sp. (ver capítulo 1 desta tese) indicam a possibilidade de defesa
provenientes de substâncias esteroidais. Por outro lado, se as substâncias
majoritárias fossem responsáveis pela defesa, era de se esperar resultados de
defesa semelhantes entre EB1 e EB2, o que não ocorreu.
Entretanto, independente da natureza química, os metabólitos
secundários contidos em H. heliophila possuem múltiplas atuações contra
predação, o que pode compensar o gasto energético envolvido na produção
e/ou armazenamento dos mesmos. A repelência de consumo contra distintos
predadores pode conferir proteção e possibilitar a sobrevivência dessa esponja
em habitats com intensa predação.
86

Capítulo 3
______________________________________________________________________
5. Conclusões
A esponja Hymeniacidon heliophila possui diferentes classes de
substâncias envolvidas na inibição do consumo por distintos predadores. Essa
característica pode representar uma importante vantagem para
estabelecimento em locais com variedades de predadores, o que comumente
ocorre em ambientes tropicais.
Análises químicas mais detalhadas são necessárias para elucidação das
substâncias envolvidas nas defesas.
87

Capítulo 4
______________________________________________________________________
Capítulo 4
Variação latitudinal na produção de defesa
química em esponjas marinhas

Capítulo 4
______________________________________________________________________
1. Introdução
As defesas químicas são amplamente conhecidas em organismos
marinhos (McClintock & Baker 2001). Essas defesas não existem, porém, como
algo constante podendo variar quali- ou quantitativamente em função de fatores
ambientais ou devido à características genéticas (Uriz et al. 1991, Becerro et al.
1995, 1998).
Um tipo de variabilidade, de ampla escala, denominada hipótese
latitudinal, ainda permanece sem o devido entendimento ou mesmo
esclarecimento. Estudos iniciados na década de 60 constataram que
organismos marinhos venenosos e peçonhentos ocorrem mais freqüentemente
em águas quentes (Halstead & Mitchell 1963; Clealand & Southcott 1965,
Russell 1965). A existência de grande diversidade de consumidores em regiões
tropicais foi o ponto de partida para o desenvolvimento de hipóteses para
explicar essa relação. Por exemplo, a herbivoria é significativamente mais
intensa em florestas tropicais do que temperadas e, de fato, isso se reflete na
maior concentração de alcalóides em plantas tropicais (Levin & York 1978) e
substâncias fenólicas (Coley & Aide 1991). Do ponto de vista ecológico, o
desenvolvimento de defesas em organismos sujeitos a altos níveis de predação
constitui um importante fator para a manutenção de populações nessas
regiões.
Estudos comparativos com algas marinhas tropicais e temperadas
também relacionaram uma maior freqüência e abundância de química
defensiva relacionada à grande diversidade de herbívoros existente em regiões
tropicais (Gaines & Lubchenco 1982, Steneck 1986, Hay 1991, Bolser & Hay
89

Capítulo 4
______________________________________________________________________
1996). Inclusive, espécies de algas que vivem em locais de baixa e alta
intensidade de herbivoria, possuem padrões similares de substâncias químicas,
porém, concentrações maiores de substâncias repelentes são produzidas pelos
indivíduos provenientes de locais com grande pressão de herbivoria (Paul &
Fenical 1987, Paul & Van Alstyne 1988a). A tolerância à químicas defensivas
parece ser maior em consumidores tropicais do que aqueles de regiões
temperadas (Steinberg et al. 1991, Cronin et al. 1997).
A ictiotoxicidade de extratos de esponjas de diferentes latitudes foi
testada e, de fato, aqueles obtidos de esponjas coletadas em locais próximos
ao Equador tiveram mais de 60% do total de esponjas classificadas como
tóxicas (Bakus & Green, 1974). O método utilizado neste estudo, no entanto,
quase não é mais utilizado atualmente, pois reproduz uma situação
ecologicamente pouco natural, onde os extratos são diluídos na água em um
recipiente fechado, e nessa situação a tolerância do peixe é testada.
Recentemente, Ruzicka & Gleason (2007) evidenciaram uma diminuição nas
defesas químicas de esponjas de locais temperados quando comparadas
àquelas de localidades sub-tropicais utilizando o método de incorporação de
extratos em alimentos artificiais que são oferecidos à peixes.
Por outro lado, diversos estudos não encontraram nenhuma relação
entre latitude do local de coleta com as propriedades químico-defensivas de
esponjas marinhas (McCaffrey & Endean 1985, McClintock 1987, Van der
Vyver et al. 1990).
Esponjas marinhas temperadas e tropicais foram comparadas em
relação à química defensiva, tanto com predadores simpátricos quanto
alopátricos (Becerro et al. 2003). Tanto a química defensiva quanto a eficácia
90

Capítulo 4
______________________________________________________________________
entre predadores simpátricos e alopátricos foram consideradas equivalentes
em esponjas de regiões tropicais e temperadas. De fato, outros fatores podem
estar envolvidos na variação latitudinal de defesas em esponjas como, por
exemplo, o papel das defesas físicas, a sinergia que pode haver entre defesas
químicas e físicas, dentre outros. A influência exercida pelo conteúdo
energético assim como a composição das espículas de esponjas da Antártica
foram analisados e não seguem um padrão hipotetizado para altas latitudes
(McClintock, 1987).
O objetivo desse capítulo foi avaliar a existência de variação latitudinal
na eficiência de defesa química em esponjas marinhas de três regiões
distintas: Atlântico Norte, Atlântico Sul e mar Mediterrâneo.
91

Capítulo 4
______________________________________________________________________
2. Materiais e Métodos
2.1. Coleta das esponjas
As esponjas utilizadas para comparação latitudinal foram coletadas
através de mergulho autônomo no Atlântico Norte, Atlântico Sul e
Mediterrâneo. No Atlântico Norte, as esponjas Dysidea avara, Desmacidon
fructicosum, Haliclona oculata, Polymastia robusta e Tedania pilarriosae foram
coletadas na Ria de Ferrol (Galícia, Espanha - Figura 1). Na localidade de
Punta Fornelos, essas esponjas foram coletadas na faixa de 5 até 18 metros de
profundidade em dois de outubro de 2006.
No mar Mediterrâneo, a esponja Chondrosia reniformis foi coletadas em
Blanes e Aplysina aerophoba em L’Estartit e Cap de Creus (Cataluña, Espanha
– Figura 1), em profundidade de 8 a 13 metros, no mês de outubro de 2006.
No Atlântico Sul, as esponjas Amphimedon viridis, Desmapsamma
anchorata, Chondrosia collectrix, Dysidea etheria e Aplysina fulva foram
coletadas em Angra dos Reis e Polymastia janeirensis em Arraial do Cabo
(Estado do Rio de Janeiro, Brasil) em profundidade de 1 até 10 metros, no mês
de junho e julho de 2006.
2.2. Ensaios
Os ensaios anti-predação por peixes foram realizados no costão
esquerdo da Enseada do Forno, Arraial do Cabo (Rio de Janeiro, Brasil).
92

Capítulo 4
______________________________________________________________________
Figura 1. Os pontos vermelhos indicam os locais de coleta no Atlântico Norte e
Mediterrâneo. 1 = Ria de Ferrol (La Coruña), 2 = Cabo de Creus (Catalunha), 3 =
L’Estartit (Catalunha) e 4 = Blanes (Catalunha).
93

Capítulo 4
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Figura 2. Os pontos vermelhos indicam as localidades de coleta no Atlântico Sul, Rio
de Janeiro (Brasil).
As esponjas foram pareadas de acordo com a afinidade taxonômica,
compartindo o mesmo gênero, família ou ordem, dependendo do material
coletado. Foram combinados 7 pares de espécies com afinidades taxonômicas
(Tabela 1).
94

Capítulo 4
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Tabela 1. Esponjas marinhas estudadas. AN=Atlântico Norte, AS=Atlântico Sul e
MED=Mediterrâneo.
Ordem Família Gênero/Espécie Local
Hadromerida Polymastiidae Polymastia janeirensis Boury-Esn., 1973
Hadromerida Polymastiidae Polymastia robusta Bowerbank, 1866
Poecilosclerida Tedaniidae Tedania ignis (Duch. & Mich, 1864) AS
Poecilosclerida Tedaniidae Tedania pilarriosae Cristobo, 2002 AN
Poecilosclerida Myxilidae Desmapsamma anchorata (Carter, 1882) AS
Poecilosclerida Desmacididae Desmacidon fructicosum (Montagu, 1818) AN
Haplosclerida Niphatidae Amphimedon viridis Duch. & Mich, 1864 AS
Haplosclerida Chalinidae Haliclona oculata (Pallas, 1766)
AN
Dendroceratida Dysideidae Dysidea etheria de Laubenfels, 1936 AS
Dendroceratida Dysideidae Dysidea avara (Schmidt, 1862)
AN
Verongida Aplysinidae Aplysina fulva (Pallas, 1766) AS
Verongida Aplysinidae Aplysina aerophoba Schmidt, 1862 MED
Hadromerida Chondrillidae Chondrosia collectrix (Schmidt, 1870) AS
Hadromerida Chondrillidae Chondrosia reniformis (Nardo, 1847) MED
2.2. Obtenção de extratos
O volume de um pequeno pedaço de cada espécie de esponja foi
medido por deslocamento de água do mar em uma proveta. Foi obtida uma
relação entre o peso seco e o volume da esponja para posterior cálculo da
concentração de extratos a serem utilizados nos alimentos artificiais; ou seja, a
concentração de extrato de cada esponja foi reproduzida volumetricamente nos
alimentos artificiais. Antes da liofilização, as esponjas foram cortadas em
pedaços e congeladas. Após, a liofilização as esponjas foram pesadas.
AS
AN
95

Capítulo 4
______________________________________________________________________
As esponjas liofilizadas foram extraídas em acetona, com troca de
solvente 24 horas e 72 horas após o início da extração. Utilizou-se solvente
suficiente para cobrir o volume de esponja a ser extraída e, após cada filtração,
a mesma quantidade de solvente era colocada. O solvente foi evaporado em
evaporador rotatório. A concentração natural dos extratos brutos foi calculada
em função do volume de cada espécie.
Para a realização de cromatografias em camada delgada utilizou-se
papel de sílica gel 60 F254 marca Merck e sulfato cérico como revelador.
2.3. Ensaios de predação
Os ensaios antipredação por peixes foram realizados no costão
esquerdo da Enseada do Forno, Arraial do Cabo (Rio de Janeiro, Brasil). Ver
detalhes sobre o método no Capítulo 1, página 11.
Os ensaios foram feitos por pares para garantir as mesmas condições
abióticas de experimentos e possibilitar comparações.
3. Resultados
As cromatografias dos extratos brutos dessas espécies evidenciaram
que, de maneira geral, os pares analisados e estabelecidos para comparação
sobre variabilidade latitudinal na produção de defesa química antipredação
possuem substâncias majoritárias correspondentes (Figura 3).
96

Capítulo 4
______________________________________________________________________
Figura 3. Cromatografia em camada delgada dos extratos brutos das esponjas (1)
Polymastia janeirensis, (2) Polymastia robusta - AN, (3) Tedania ignis - AS, (4)
Tedania pilarriosae - AN, (5) Desmapsamma anchorata - AS, (6) Desmacidon
fructicosum - AN, (7) Amphimedon viridis - AS, (8) Haliclona oculata - AN, (9) Dysidea
avara AN, (10) Dysidea etheria - AS, (11) Aplysina fulva - AS, (12) Aplysina aerophoba
- MED, (13) Chondrosia reniformis - MED, (14) Chondrosia collectrix - AS. Solvente:
Acetato de Etila e Hexano 1:1, eluente: Diclorometano.
As concentrações naturais dos extratos de esponjas variaram, em
relação ao peso seco da esponja, de 0,27% em Tedania pilarriosae, a 4,95%
em Polymastia robusta, sendo ambas espécies coletadas no Atlântico Norte
(Tabela 2).
97

Capítulo 4
______________________________________________________________________
Tabela 2. Porcentagem de extrato em função do peso seco obtido das esponjas
estudadas.
Espécie % de extrato Local
Aplysina fulva 1,62 AS
Aplysina aerophoba 4,63 MED
Chondrosia collectrix 2,13 AS
Chondrosia reniformis 0,59 MED
Polymastia janeirensis 1,59 AS
Polymastia robusta 4,95 AN
Tedania ignis
1,83
AS
Tedania pilarriosae
0,27
AN
Desmapsamma anchorata 1,60 AS
Desmacidon fructicosum 2,11 AN
Amphimedon viridis 1,57 AS
Haliclona oculata
1,19
AN
Dysidea etheria
2,00
AS
Dysidea avara
1,53
AN
Nos dois pares de esponjas utilizados para comparação entre esponjas
do Atlântico Sul e do Mediterrâneo, apenas o extrato de Aplysina aerophoba
(do Mediterrâneo) inibiu o consumo por peixes (p= 0,017 – Figura 4). Os
extratos de Chondrosia não foram eficazes em inibir a predação (Figura 4).
98

Capítulo 4
______________________________________________________________________
Espécies
C. reniformis
MED
C. collectrix
AS
A. aerophoba
MED
A. fulva
AS
Atlântico Sul X Mediterrâneo
p=0,017
p=0,372
0 20 40 60 80 100 120
Consumo (%)
Tratamento
Controle
p=0,573
p=0,098
Figura 4. Média de consumo de alimentos controle e tratamento contendo extrato
bruto das esponjas do Atlântico Sul e Mediterrâneo. A barra em cada coluna
corresponde ao desvio padrão, o valor de p está ao lado de cada coluna e n = 20 em
todos os casos.
Dos cinco pares de esponjas utilizados para a comparação entre
esponjas do Atlântico Norte e do Atlântico Sul, foi constatado ação defensiva
em apenas dois casos: Haliclona oculata do Atlântico Norte e Desmapsamma
anchorata do Atlântico Sul (Figura 6). Os extratos de Dysidea, Tedania e
Polymastia não expressaram atividade inibitória ao consumo de peixes (Figura
5).
99

Capítulo 4
______________________________________________________________________
D. avara - AN
D. etheria - AS
A. viridis - AS
H. oculata - AN
D. fructisosum - AS
D. anchorata - AS
T. pilarriosae - AN
T. ignis - AS
P. robusta - AN
P. janeirensis - AS
Atlântico Norte X Atlântico Sul
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100110
Consumo (%)
Tratamento
Controle
p=0,7064
p=0,3332
p=0,9108
p=0,0089
p=0,6603
p=0,0055
p=0,7560
p=0,0690
p=0,5730
p=0,0980
Figura 5. Média de consumo de alimentos controle e tratamento contendo extrato
bruto das esponjas. A barra em cada coluna corresponde ao desvio padrão, o valor de
p está ao lado de cada coluna e N = 20 em todos os casos.
100

Capítulo 4
______________________________________________________________________
4. Discussão
Dos dois pares utilizados para comparações entre as esponjas do mar
Mediterrâneo e do Atlântico Norte, apenas uma espécie teve extrato repelente:
Aplysina aerophoba do Mediterrâneo. A porcentagem de extrato bruto obtido foi
quatro vezes maior na esponja do Mediterrâneo em relação a seu par do
Atlântico Sul. Porém, isso parece não estar diretamente relacionado a eficácia
como defesa química antipredação, pois no par formado pelo gênero
Chondrosia, a esponja com maior porcentagem de extrato foi tão palatável
quanto o seu par. As esponjas do gênero Aplysina são caracterizadas pela
grande quantidade de esteróides que dão origem a uma série de metabólitos
brominados (Thompson et al. 1983, Turon et al. 2000). Cinco espécies do
gênero Aplysina do Caribe tiveram extratos altamente ativos como defesa
química frente ao peixe Talassoma bifasciatum (Pawlik et al. 1995). O consumo
pelo peixe Blennius sphinx foi inibido em alimentos artificiais que continham o
extrato bruto de A. cavernicola e A. aerophoba, ambas coletadas no
Mediterrâneo (Thoms et al. 2003). A atividade repelente foi atribuída
principalmente às substâncias aerotianina, a aplysinamisina-1 e também ao
ácido carboxílico 3,4-di-hidroxiquinolina presentes em A. cavernicola, e a
aerophobina-2 e a isofistularina-3 encontradas em A. aerophoba (Thoms et al.
2003). A isofistularina-3, também foi testada em relação ao assentamento de
larvas do cirripédio Balanus improvisus, porém não teve nenhum efeito (Ortlepp
et al 2007). Deve-se considerar que metabolitos citados anteriormente são
mais polares, diferentes dos obtidos nesse estudo. O extrato bruto de A.
cauliformis e A. fistularis do Caribe também foi testado em relação ao consumo
101

Capítulo 4
______________________________________________________________________
por paguros Paguristes punticeps, mas exibiu ação defensiva variável (Wadell
& Pawlik 2000). É importante destacar que em A. fistularis da Califórnia
(Estados Unidos), exemplares coletados na faixa entre 5 e 15 m de
profundidade possuíam altas concentrações de homoaerotionina e aerothianina
(Thompson et al. 1985), enquanto que os espécimes coletados acima de 5 m
sequer apresentaram esses metabólitos. Seria muito importante realizar
comparações químicas detalhadas para um melhor entendimento dos
processos químico-evolutivos que podem estar influenciando na ecologia
dessas esponjas.
Geralmente, as esponjas do gênero Chondrosia possuem consistência
cartilaginosa e colonizam faces inferiores de pedras e tocas (Muricy & Hajdu
2006). Nenhum dos extratos das espécies testadas, C. collectrix e C.
reniformis, foi capaz de deter a predação por peixes. Thoms et al. (2003)
também não encontraram atividade defensiva presente em C. reniformis do
Mediterrâneo que a defendesse do consumo pelo peixe Blennius sphinx.
Extratos dessas duas espécies (C. collectrix e C. reniformis), do Caribe,
também não inibiram o consumo pelo peixe Thalassoma bifasciatum (Pawlik et
al. 1995), corroborando o resultado encontrado no presente estudo. A esponja
Chondrosia collectrix, quando transplantada para locais com alta predação, foi
altamente consumida por peixes (Pawlik 1998). Contrariando esses resultados,
na região do Atol das Rocas, C. collectrix não foi consumida pelo peixe-frade
(Batista 2006), o que estaria em acordo com a hipótese latitudinal. Mais de 57
substâncias de C. reniformis das Ilhas Canárias (Espanha) foram identificadas
(Nechev et al. 2002). Porém, até agora nenhuma atividade ecológica dessas
substâncias foi encontrada. É possível que a própria consistência cartilaginosa
102

Capítulo 4
______________________________________________________________________
dessas espécies, característica não reproduzida nos alimentos artificiais, seja
uma maneira de evitar qualquer dano ao seu tecido, p. ex. consumo por
predadores. Nessas esponjas analisadas, não houve tendências na defesas
que corroborem a hipótese latitudinal, como vimos nos resultados obtidos. No
caso de Aplysina, inclusive, foi constatada defesa apenas na espécie do
Mediterrâneo, o que seria o inverso do esperado pela citada hipótese.
Das esponjas utilizadas na comparação entre o Atlântico Sul e o
Atlântico Norte possuíam extratos brutos ativos como defesa química contra
peixes: Haliclona oculata do Atlântico Norte e Desmapsamma anchorata do
Atlântico Sul.
As esponjas Desmacidon fructicosum e Desmapsamma anchorata
pertencem à mesma ordem (Poeciosclerida) e possuem semelhanças em
termos de metabolitos majoritários (Figura 3 C). Desmapsamma anchorata do
Atlântico Sul possui extrato bruto ativo contra a predação por peixes, ao
contrário de Desmacidon fruticosum do Atlântico Norte, apesar das
semelhanças químicas. Esse resultado está de acordo com a hipótese
latitudinal de defesas, porém dos 7 pares testados nesse estudo, esse foi o
único que apresentou esse padrão. Desmapsamma anchorata apresenta
rápido crescimento (Wulff 2005) e muitas vezes é encontrada em associação a
corais na costa do Rio de Janeiro (observação pessoal), mas não existem
ainda estudos sobre interações alelopáticas nessa região. No Caribe, D.
anchorata causa a mortalidade do tecido da gorgônia Gorgonia ventalina
(McLean 2006). Por sua abundância é uma excelente espécie de esponja para
investigações químico-ecológicas, porém não existem mais dados na literatura
sobre abordagens desta natureza com esta espécie. Diversos metabólitos
103

Capítulo 4
______________________________________________________________________
foram identificados em D. anchorata (Quijano et al. 1994, Carballeira &
Maldonado 1988, Carballeira & Shalabi 1994, Compagnone et al. 1999).
Extratos das haploscleridas congenéricas Amphimedon compressa e A.
erina do Caribe inibiram o consumo do peixe Thalassoma bifasciatum (Pawlik
et al 1995). Amphimedon viridis é comumente predada pelo peixe P. paru ao
longo da costa brasileira, Atol das Rocas, Abrolhos e Arraial do Cabo (Batista
2006). Diversas substâncias foram isoladas de A. viridis, como por exemplo, a
halitoxina e a amphitoxina, ambas exibindo substâncias com potente atividade
antimicrobiana (Berlink et al 1996; Mitchell et al 1997, Kelman et al 2001).
Alguns esteróis de Haliclona oculata já são conhecidos, como por exemplo, o
oculatol (Fidlay & Patil 1985, Yu et al. 2006). A estrela do mar espongívora
Perknaster fuscus não apresentou retração das estruturas sensitivas ao entrar
em contato com extratos brutos hidrofílicos e lipofílicos de outra espécie
congenérica, a Haliclona sco tti (McClintock et al. 2000), o que evidencia a
ausência de propriedades defensivas contra esse predador.
Apesar da promissora atividade antibacteriana e antiviral de extratos
aquosos de P. janeirensis (Silva et al. 2006) nada se sabe em termos de
ecologia química. Esponjas do gênero Polymastia comumente habitam fundos
onde são cobertas por sedimentos e apenas suas papilas ficam expostas, e
esse hábito pode representar uma estratégia para estar menos exposta à
predação ou colonizar ambientes menos competitivos. Polymastia janeirensis é
conhecida por liberar substâncias de coloração amarela que possui atividade
antibacteriana e possivelmente ictiotóxica (Muricy & Hajdu 2006). No entanto,
não houve inibição da predação resultante da atividade de seu extrato bruto.
De fato, P. janeirensis é consumida pelo peixe Pomacanthus paru em Arraial
104

Capítulo 4
______________________________________________________________________
do Cabo (Batista 2006). Uma vez que a substância amarela liberada na água
quando sofre algum dano é hidrofílica, é possível que possua algum efeito local
e momentâneo contra predadores. No presente estudo não foi utilizado extratos
hidrofílicos, o que pode explicar os resultados obtidos. Outra espécie
congenérica, Polymastia croceus da Nova Zelândia, possui grande capacidade
de sobreviver a danos feitos em seu tecido (Duckworth, 2003). Se P.
janeirensis e P. robusta também possuem essa capacidade, pode ser que essa
característica seja suficiente para garantir a sobrevivência dessas espécies a
despeito de sua vulnerabilidade à predação por peixes. A estrela-do-mar
antártica Odontaster meridionalis possui hábitos alimentares que inclui
Polymastia invaginata, evidenciando a ausência de defesa química também
contra a predação por esse equinoderma nessa região (McClintock, 1994).
Esponjas do gênero Dysidea foram objeto de diversos estudos químicos,
diversas substâncias com atividade antipredação já são conhecidas.
Substâncias polibromadas em altas concentrações são comuns em espécies
desse gênero e essa produção é atribuida a bactérias simbiontes, assim como
ocorre com outros metabólitos já identificados (Unson & Falkner 1993, Falkner
2001). Substâncias de D. avara do mar Mediterrâneo foram eficazes contra
predação por ouriços (Uriz et al 1996). Em Dysidea sp., duas substâncias
foram capazes de inibir a predação por peixes (Duffy & Paul, 1992;Thaker et al.
1998). No entanto, Duffy & Paul (1992) evidenciaram a importância da
qualidade nutricional do alimento como atrativo para peixes, pois substâncias
de Dysidea sp. apenas reduziram significativamente a predação em alimentos
artificiais com baixa qualidade nutricional. Thaker et al. (1998) encontraram que
o extrato bruto de Dysidea sp. de Guam (Estados Unidos), assim como a
105

Capítulo 4
______________________________________________________________________
substância 7-desacetoxi-olepupuana são capazes de inibir o consumo de
Pomacanthus imperator em ensaios de laboratório. Dysidea etheria do Caribe
possui extrato bruto repelente ao peixe Thalassoma bifasciatum (Pawlik et al.
1995). Seria interessante conduzir avaliações químicas mais detalhadas no
intuito de identificar a composição química de D. etheria e D. avara e
possibilitar a comparação das concentrações dessas substâncias.
As esponjas Tedania ignis e T. pilarriosae não mostraram tendências
latitudinais de defesas na predação por peixes. Tedania ignis de regiões de
mangue do Caribe possui extratos repelentes ao consumo pelo peixe
Thalassoma bifasciatum (Pawlik et al. 1995). Extratos brutos de T. ignis da
costa brasileira são eficientes em inibir o consumo pelo paguro Calcinus tibicen
(observação pessoal), mas não evitaram o consumo por peixes generalistas
em Arraial do Cabo, inclusive existem registros que indicam a preferência
alimentar de P. paru no consumo de T. ignis (Batista 2006). Isso pode indicar
que os metabólitos secundários podem apresentar efeitos diferenciados frente
a distintos predadores.
Esponjas que não apresentam defesa química evidente contra a
predação certamente podem possuir outras estratégias que a favoreçam diante
desta ação. Walters & Pawlik (2005) constataram que esponjas que não são
eficientemente protegidas por meios químicos parecem ter mecanismos
celulares eficientes para reparar danos em seu tecido, ao contrário das
esponjas que possuem defesas químicas contra o consumo por peixes. Outro
fato interessante é que os metabólitos secundários são semelhantes em
esponjas antárticas, temperadas e tropicais (Amsler et al. 2001).
106

Capítulo 4
______________________________________________________________________
Nesse estudo, não foi constatado um padrão latitudinal de defesa. Em
esponjas marinhas, as defesas antipredação por peixes não seguem
tendências latitudinais, sendo mais um reflexo de fatores intrínsecos de cada
espécie. Neste estudo, foram encontradas tanto espécies do hemisfério norte,
como do hemisfério sul que possuíam defesas químicas. Nesse estudo, não
existiu um padrão de defesa. Deve-se também considerar que o universo
amostral foi bastante reduzido, o que não permite conclusões definitivas sobre
esse tema. Becerro et al. (2003) também não encontraram evidências de
gradientes latitudinais de defesas químicas em esponjas. A capacidade de
tolerar metabólitos secundários (no caso dos predadores) assim como de
produzi-los (no caso da esponja) é um processo intrínseco relacionado a
história evolutiva de cada espécie, provavelmente, por isso a literatura é tão
controversa sobre a hipótese latitudinal.
5. Conclusões
A capacidade defensiva contra o consumo por peixes generalistas não
segue nenhuma tendência latitudinal nas esponjas estudadas das regiões do
Atlântico Sul, do Atlântico Norte e do Mar Mediterrâneo. Nesses organismos,
a química evolutiva parece seguir características específicas, resultantes da
história evolutiva de cada uma das espécies e não tendências latitudinais
globais.
107

Conclusões gerais
______________________________________________________________________
Conclusões gerais
Esse estudo representa a primeira pesquisa dedicada exclusivamente a
ecologia química de esponjas marinhas na costa brasileira, da qual foram
extraídas as seguintes conclusões:
O perfil químico das espécies co-genéricas Tethya sp. e Tethya rubra é
bastante semelhante, especialmente no que diz respeito aos componentes
majoritários. Apesar disso, a ação defensiva dos extratos brutos destas
esponjas é bastante diferente. Isso evidenciou a importância dos metabólitos
minoritários como responsáveis por defesas antipredação em organismos
marinhos. Ao contrário das defesas químicas, as defesas provenientes de
componentes estruturais (defesas físicas) são geralmente vistas como menos
eficientes e com papel secundário na capacidade defensiva, porém, no caso da
esponja Tethya rubra, as espículas representaram maior eficácia que seu
extrato bruto. O efeito sinergístico que pode existir quando consideramos a
atuação das espículas em conjunto com as defesas químicas não foi detectada
em nenhuma das duas espécies estudadas, mas apenas o efeito de adição na
ação defensiva de espículas e extratos de ambas as esponjas, Tethya sp e T.
rubra.
A variação nas concentrações dos metabólitos secundários pode ocorrer
não apenas devido a fatores externos (biótico e abióticos), mas devem ser
considerados também fatores intrínsecos, uma vez que encontramos variação
intra-populacional na produção de metabólitos secundários em indivíduos de
Tethya sp.

Conclusões gerais
______________________________________________________________________
A possibilidade de defesa nos brotos de Tethya sp. pode ser uma
importante vantagem ecológica para essa espécie, uma vez que as taxas de
mortalidade de larvas (= estruturas de propagação) é apontada como um dos
fatores fundamentais no estabelecimento de populações marinhas bentônicas.
Por outro lado, constitui a primeira evidência de estrutura de propagação
vegetativa quimicamente defendida.
A esponja Hymeniacidon heliophila possui diferentes classes de
substâncias envolvidas na inibição do consumo por distintos predadores. Essa
característica pode representar uma importante vantagem para
estabelecimento em locais com variedade de predadores, o que comumente
ocorre em ambientes tropicais. Análises químicas mais detalhadas são
necessárias para elucidação das substâncias ativas como defesa nesta
esponja.
A capacidade defensiva contra o consumo por peixes generalistas, não
segue nenhuma tendência latitudinal nas esponjas estudadas das regiões do
Atlântico Sul, Atlântico Norte e Mediterrâneo. Nesses organismos a capacidade
defensiva química parece seguir características específicas, resultantes da
história evolutiva de cada uma das espécies e não tendências latitudinais
globais.
109

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