Diagnóstico molecular das infecções por Chlamydia trachomatis e ...

DNA polimerase durante a PCR, induzida por possíveis substâncias inibidoras
presentes nas amostras (Mahony et al. 1998).
4.5.2 Amplificação dos DNAs alvos de C. trachomatis e N. gonorrhoeae
Do sobrenadante das amostras processadas, foi retirada uma alíquota de 50
L e adicionada a 50 L de Master Mix de trabalho que contém as seqüências de
primers biotiniladas CP24 e CP27 para a C. trachomatis e para o CI e SS01 e SS02
para N. gonorrhoeae, a enzima Taq DNA polimerase, os deoxinucleosídeos trifosfato
livres (dUTP, dATP, dGTP e dCTP) e a enzima AmpErase. Além do CI, foram
usados um controle positivo e um negativo para C. trachomatis e N. gonorrhoeae em
cada amplificação.
Os primers usados no ensaio amplificam uma seqüência de aproximadamente
208 nucleotídeos dentro do plasmídio críptico comum a todas as sorovariedades de
C. trachomatis e uma seqüência de 201 nucleotídeos do gene da enzima
metiltransferase do DNA, uma região conservada entre as cepas de N. gonorrhoeae.
A enzima AmpErase permite a amplificação seletiva do DNA alvo, impedindo
que haja contaminação das amostras com seqüências amplificadas de outras
reações. Essa enzima degrada as fitas de DNA contendo deoxiuridina, que é
adicionada ao teste, mas não é encontrada no material genético a ser amplificado.
Em temperaturas acima de 55ºC, a AmpErase é inativada. Assim, após o início do
ciclo de amplificação, ocorre a inativação da enzima, impedindo que o DNA recém-
amplificado seja destruído.
A amplificação foi realizada em termociclador GeneAmp PCR System 2400
(Perkin-Elmer Cetus, Norwalk Conn.) no qual as amostras passam por um ciclo
contendo as fases de desnaturação da fita dupla de DNA, anelamento dos primers e
extensão das fitas que estão sendo copiadas. Ao final de 35 ciclos, a temperatura é
mantida a 72ºC e a adição de uma solução desnaturante promove a perda de função
de qualquer resíduo enzimático na solução e transforma as fitas duplas de DNA em
fita simples. Estes procedimentos foram realizados na sala de amplificação.
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