Texto Completo - Apresentação - Unifra
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CENTRO UNIVERSITÁRIO FRANCISCANO<br />
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO<br />
ÁREA DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS<br />
Curso de Mestrado em Nanociências<br />
VALNIR DE PAULA<br />
BIODISTRIBUIÇÃO DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS<br />
UTILIZANDO CAMPO MAGNÉTICO EM RATOS<br />
Santa Maria, RS<br />
2011
VALNIR DE PAULA<br />
BIODISTRIBUIÇÃO DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS<br />
UTILIZANDO CAMPO MAGNÉTICO EM RATOS<br />
Dissertação de Mestrado, apresentada ao<br />
Programa de Pós-Graduação em Nanociências<br />
do Centro Universitário de Santa Maria, como<br />
requisito parcial para obtenção do título de<br />
Mestre em Nanociências.<br />
Orientadora: Prof a Drª SOLANGE BINOTTO FAGAN<br />
Co-orientadora: Prof a Drª SOLANGE C. S. M. HOELZEL<br />
Santa Maria, RS<br />
2011<br />
ii
P324b Paula, Valnir de<br />
Biodistribuição de nanopartículas magnéticas utilizando<br />
campo magnético em ratos / Valnir de Paula ; orientação<br />
Solange Binotto Fagan ; co-orientação Solange C. S. M.<br />
Hoelzel – Santa Maria : Centro Universitário Franciscano,<br />
2011.<br />
62 f. : il.<br />
Dissertação (Mestrado em Nanociências) – Centro<br />
Universitário Franciscano, 2011<br />
1. Ressonância magnética nuclear 2. Agentes de contraste<br />
3. Sistema fagocitário I. Fagan, Solange Binotto<br />
II. Hoelzel,Solange C. S. M. III. Título<br />
CDU 537.635:62-181.4<br />
iii
AGRADECIMENTOS<br />
Acima de tudo, agradeço fervorosamente a Deus, por me abençoar com saúde e<br />
permitir que eu esteja inserido em um meio científico, cercado por profissionais de alto grau<br />
de capacitação, dos quais me orgulho muito.<br />
À minha esposa Ana e aos meus filhos Isadora e Leonardo, que compreenderam e<br />
me apoiaram em todos os momentos, inclusive naqueles em que a minha presença junto a eles<br />
não era possível, pelo inevitável envolvimento com o trabalho.<br />
Ao Dr José Knoll Palma, médico radiologista do serviço de radiologia do Hospital<br />
de Caridade Dr Astrogildo de Azevedo, de Santa Maria que, ao incentivar o desenvolvimento<br />
deste trabalho, permitiu que o equipamento de ressonância magnética fosse utilizado e prestou<br />
inestimável auxílio ao participar da análise das imagens.<br />
À minha amiga e colega de mestrado, Francine Rodrigues Ianiski, que por inúmeras<br />
vezes emprestou-me a sua experiência com cobaias para auxiliar na manipulação das mesmas<br />
durante os experimentos.<br />
Ao meu colega e amigo José Carlos Gama, que participou diretamente de todas as<br />
etapas do experimento, prestando grande ajuda na obtenção das imagens durante muitas<br />
madrugadas, horário em que o equipamento estava disponível a este trabalho.<br />
Ao professor Sergio Roberto Mortari, pelo apoio e caracterização das amostras de<br />
nanopartículas na Universidade Federal de Santa Maria.<br />
Ao professor Luis Otávio de Souza Bulhões, pelo trabalho de caracterização das<br />
amostras de nanopartículas no Laboratório de Nanociências da <strong>Unifra</strong>.<br />
À professora Eliana Martins Lima, da Universidade Federal de Goiás, pela<br />
grandiosa contribuição, determinante para a viabilização do trabalho, fornecendo as<br />
nanopartículas magnéticas utilizadas.<br />
Á professora Solange Hoelzel, minha co-orientadora, pelo empenho despendido e<br />
importantes orientações prestadas do decorrer dos experimentos.<br />
Finalmente, agradeço à professora Solange Binotto Fagan, minha orientadora,<br />
primeiramente pela proposição do tema e pelas valiosas orientações, mas principalmente por<br />
sua constante motivação na busca pelo conhecimento e desenvolvimento científico, que<br />
transcende do seu perfil e afeta muito positivamente seus alunos.<br />
v
RESUMO<br />
A utilização de produtos de escala nanométrica nas mais diversas áreas, inclusive na<br />
medicina, é uma realidade crescente. As nanopartículas magnéticas (NPMs), por serem<br />
capazes de apresentar efeito expressivo de magnetização quando expostas a um campo<br />
magnético externo, têm sido foco de vários estudos e, entre as suas aplicações está o uso<br />
como agente de contraste em imagens de ressonância magnética nuclear. Esta técnica fornece<br />
imagens baseadas no comportamento nuclear dos átomos das estruturas anatômicas, as quais<br />
podem ser melhor destacadas pelo uso de agentes de contraste. As NPMs representam uma<br />
classe alternativa aos atuais agentes de contraste, paramagnéticos, com vantagens do ponto de<br />
vista físico, pois destacam ainda mais o comportamento magnético dos prótons de diferentes<br />
tecidos. Isto é mais evidente no fígado, baço e sistema linfático, cujas células de defesa<br />
endocitam estas NPMs, tornando o parênquima sadio escuro (hipossinal), de forma que<br />
eventuais lesões se sobressaeam nas imagens, facilitando a sua identificação.<br />
O objetivo deste trabalho foi avaliar o grau de contrastação dos órgãos do sistema<br />
fagocitário, injetando-se doses de NPMs que variaram de 0,46 a 7,2 mg/Kg em ratos, por via<br />
endovenosa caudal e submetendo-os a imageamento por ressonância magnética nuclear. As<br />
NPMs foram divididas em 2 grupos, ambos com núcleo de magnetita, variando-se o<br />
revestimento, que no grupo 1 foi de dextrana e o do grupo 2, de ácido oléico. O efeito<br />
desejado foi que os órgãos do sistema fagocitário apresentassem algum grau de perda de sinal<br />
nas imagens, indicando que as NPMs foram internalizadas pelas células desses órgãos. Com o<br />
agente de contraste usual, paramagnético, que não entra nas células, o efeito é de hiperssinal<br />
no sistema vascular e em órgãos hipervascularizados. Comparou-se as imagens obtidas de<br />
sequências T1 TSE e T2 TSE com as de controle, obtidas antes da injeção. Os resultados<br />
obtidos evidenciaram que, tanto as NPMs revestidas com dextrana, quanto às revestidas com<br />
ácido oléico causaram efeito de hipossinal nas imagens, que variaram de fraco a acentuado,<br />
dependendo da dose administrada, principalmente em sequências T2 TSE. As NPMs<br />
revestidas com dextrana apresentaram maior eficiência, considerando que os efeitos de<br />
hipossinal ocorreram com doses menores do que as revestidas com ácido oléico. Pode-se<br />
concluir, considerando o evidente efeito de hipossinal apresentado pelos órgãos do sistema<br />
fagocitário, que há potencial de aplicação destas NPMs como agente de contraste em estudos<br />
de ressonância magnética.<br />
Palavras chave: Ressonância magnética nuclear, agentes de contraste, sistema fagocitário<br />
vi
ABSTRACT<br />
The use of nanoscale products in several areas, including medicine, is a growing<br />
reality. The magnetic nanoparticles (MNPs) for being able to present a significant effect of<br />
magnetization when exposed to an external magnetic field, have been the focus of several<br />
studies, and among their applications is their use as contrast agent in magnetic resonance<br />
images. This technique provides images based on the nuclear behavior of the atoms of<br />
anatomical structures, which can be best highlighted by the use of contrast agents, usually<br />
paramagnetic.<br />
The MNPs represent an alternative to the current class of paramagnetic contrast agents<br />
for nuclear magnetic resonance, used for a long time, with advantages from a physical point<br />
of view, because they highlight even more the magnetic behavior of protons in different<br />
tissues, especially liver, spleen and lymphatic system, whose defense cells endocyte these<br />
MNPs, making healthy parenchyma dark (hyposignal), so that any injuries stand out in the<br />
images, facilitating their identification.<br />
This study has aimed to assess the contrast degree of the organs of the phagocyte<br />
system, injecting NPMs doses ranging from 0.46 to 7.2 mg/kg in rats, by caudal intravenous<br />
flow and subjecting them to nuclear magnetic resonance imaging. The MNPs was divided into<br />
two groups, both with a core of magnetite, varying the coating, which has been dextran in<br />
group 1, and oleic acid in group 2. The expected effect was that the organs of the phagocyte<br />
system would have some degree of signal loss in the images, indicating that the NPMs were<br />
internalized by the cells of these organs. With the usual contrast agent, paramagnetic, which<br />
does not enter cells, the effect is the hypersignal in the vascular system and in<br />
hypervascularized organs. We have compared the images obtained from T1 TSE and T2 TSE<br />
sequences with the control obtained before injection.<br />
The results have shown that both dextran coated MNPs and the ones coated with oleic<br />
acid have caused the hyposignal effect in the images, ranging from weak to strong, depending<br />
on the administered dose, especially in T2 TSE sequences. The dextran coated MNPs have<br />
shown higher efficiency, considering that the hyposignal effects have occurred with lowers<br />
doses, compared to the effects caused by NPMs coated with oleic acid. It can be concluded,<br />
given the evident hyposignal effect presented by the organs of the phagocyte system, the<br />
potential application of MNPs as a contrast agent in magnetic resonance studies.<br />
Keywords: Magnetic resonance imaging, contrast agents, phagocyte system<br />
vii
LISTA DE FIGURAS<br />
Figura 1 Magneto em barra mostrando os polos norte e sul e suas linhas de campo.<br />
Figura 2 Comportamento dos momentos magnéticos dos átomos em materiais diversos.<br />
Figura 3 Monodomínios magnéticos em um material ferromagnético.<br />
Figura 4 Gráfico demonstrativo da curva de histerese dos materiais ferromagnéticos e<br />
superparamagnéticos quando sujeitos a um campo externo H.<br />
Figura 5 Estrutura espinélio inversa de magnetita.<br />
Figura 6 Estrutura química da Dextrana.<br />
Figura 7 Diagrama qualitativo relacionando o tempo de residência no sangue com o<br />
tamanho da partícula.<br />
Figura 8 Geração de um dipolo magnético a partir do próton do hidrogênio.<br />
Figura 9 Magnetização resultante da aplicação de um campo magnético externo sobre<br />
uma população de núcleos de hidrogênio.<br />
Figura 10 Representação da curva de recuperação T1 e curva de declínio T2.<br />
Figura 11 Corte axial do abdômen ao nível hepático, de sequência ponderada em T1.<br />
Figura 12 Corte axial do abdômen ao nível hepático, de sequência ponderada em T2.<br />
Figura 13 Esquema representando a localização das bobinas de gradiente no interior do<br />
equipamento de RM.<br />
Figura 14 Utilização de bobinas receptoras em exames de RM.<br />
Figura 15 Imagens axiais comparativas, de seqüência T1 TSE, ao nível do fígado, antes e<br />
10 min pós injeção de 1,3mg/Kg de NPMs.<br />
Figura 16 Imagens axiais comparativas, ao nível do fígado, antes e 10 min após a injeção<br />
de 1,3 mg/Kg de NPMs.<br />
Figura 17 Imagens em seqüência T2 TSE no plano coronal, antes e após 10 min após a<br />
injeção de 1,3 mg/Kg de NPMs.<br />
Figura 18 Imagens axiais comparativas em seqüência T2, ao nível do fígado, antes e 10<br />
min após a injeção de 0,6 mg/Kg de NPMs.<br />
Figura 19 Imagens axiais comparativas, do mesmo experimento, ao nível do baço (setas).<br />
Figura 20 Imagens axiais comparativas, ao nível do fígado, 20 min após a injeção de 0,6<br />
mg/Kg de NPMs e 40 min após a injeção.<br />
Figura 21 Imagens axiais comparativas, ao nível do fígado, sem agente de contraste e 10<br />
min após a injeção de 0,3 mg/Kg de NPMs .<br />
viii
Figura 22 Imagens axiais comparativas em T2, ao nível do fígado, sem agente de<br />
contraste e 10 min após a injeção de 1,3 mg/Kg de NPMs .<br />
Figura 23 Imagens axiais comparativas em T2, ao nível do baço, sem agente de contraste<br />
e 10 min após a injeção de 1,3 mg/Kg de NPMs .<br />
Figura 24 Imagens comparativas em T2, no plano coronal, sem agente de contraste e 10<br />
min após a injeção de 1,3 mg/Kg de NPMs .<br />
Figura 25 Imagens axiais comparativas em T2, ao nível do fígado. A: sem agente de<br />
contraste e B: 10 min após a injeção de 2,6 mg/Kg de NPMs .<br />
Figura 26 Imagens axiais comparativas em T2, ao nível do baço, sem agente de contraste<br />
e 10 min após a injeção de 2,6 mg/Kg de NPMs<br />
Figura 27 Imagens axiais comparativas em T1, ao nível do fígado, sem agente de<br />
contraste e 10 min após a injeção de 2,6 mg/Kg de NPMs<br />
Figura 28 Imagens axiais comparativas em T1, ao nível do baço, sem agente de contraste<br />
e 10 min após a injeção de 2,6 mg/Kg de NPMs<br />
Figura 29 Imagens axiais comparativas em T2, ao nível do fígado, sem agente de<br />
contraste e 10 min após a injeção de 5,2 mg/Kg de NPMs<br />
Figura 30 Imagens axiais comparativas em T2, ao nível do baço, sem agente de contraste<br />
e 10 min após a injeção de 5,2 mg/Kg de NPMs<br />
Figura 31 Imagens axiais comparativas em T1, ao nível do fígado, sem agente de<br />
contraste e 10 min após a injeção de 5,2 mg/Kg de NPMs .<br />
Figura 32 Imagens axiais comparativas em T1, ao nível do baço, sem agente de contraste<br />
e 10 min após a injeção de 5,2 mg/Kg de NPMs .<br />
ix
LISTA DE ABREVIATURAS<br />
IRM Imagem por ressonância magnética<br />
NP Nanopartículas<br />
NPMs Nanopartículas magnéticas<br />
NPSPMs Nanopartículas superparamagnéticas<br />
PNS Stimulation of peripheral nerves<br />
RF Radiofrequência<br />
RMN Ressonância magnética nuclear<br />
SAR Specific absortion rate<br />
SMF Sistema mononuclear fagocitário<br />
SPIO Superparamagnetic Iron Oxide<br />
SER Sistema Reticuloendotelial<br />
Tc<br />
Temperatura de Curie<br />
TE Tempo de Eco<br />
TR Tempo de relaxação<br />
TSE Turbo spin eco<br />
USPIO Ultra small particle iron oxide<br />
VME Vetor de magnetização efetiva<br />
x
LISTA DE TABELAS<br />
Tabela 1 Classificação dos materiais quanto aos valores de susceptibilidade e<br />
permeabilidade magnéticas<br />
Tabela 2: Agentes de contraste baseados em NPMs, disponíveis no mercado americano ou<br />
em fase de estudo<br />
Tabela 3: Parâmetros de aquisição e reconstrução das sequências de imagens<br />
Tabela 4: Níveis de perda de sinal em fígado e baço em relação às doses injetadas de<br />
NPMs revestidas com dextrana<br />
Tabela 5: Níveis de perda de sinal em fígado e baço em relação às doses injetadas de<br />
NPMs revestidas com ácido oléico<br />
xi
SUMÁRIO<br />
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 1<br />
2 REFERENCIAL TEÓRICO....................................................................................... 4<br />
2.1 Fundamentos do magnetismo............................................................................ 4<br />
2.2 Nanopartículas Magnéticas (NPMs).................................................................. 10<br />
2.2.1 Técnicas de obtenção de NPMs................................................................ 11<br />
2.2.2 Revestimentos........................................................................................... 12<br />
2.2.3 Caracterização das NPMs......................................................................... 14<br />
2.2.4 Aplicações das NPMs na medicina........................................................... 15<br />
2.2.5 Mecanismos de interação biológica.......................................................... 16<br />
2.2.6 Toxicidade................................................................................................ 18<br />
2.2.7 Excreção celular........................................................................................ 19<br />
2.3 Princípios Físicos da Imagem por Ressonância Magnética............................... 19<br />
2.3.1 Relação do Hidrogênio com um campo magnético externo..................... 20<br />
2.3.2 Formação do contraste de imagem de RMN............................................ 21<br />
2.3.3 Localização espacial e recepção do sinal de RF....................................... 24<br />
2.3.4 Sequências de pulso e tempos de repetição e de eco................................ 25<br />
2.3.5 Fatores de segurança em RMN................................................................. 26<br />
2.4 Uso de Agentes de Contraste em Ressonância Magnética................................ 27<br />
2.4.1 Agentes de contraste paramagnéticos....................................................... 27<br />
2.4.2 Agentes de contraste superparamagnéticos.............................................. 28<br />
3 METODOLOGIA...................................................................................................... 30<br />
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES.............................................................................. 33<br />
4.1 Administração de NPMs revestidas com dextrana............................................ 33<br />
4.2 Administração de NPMs revestidas com ácido oléico...................................... 37<br />
5 CONCLUSÕES.......................................................................................................... 43<br />
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................... 44<br />
ANEXO A<br />
ANEXO B<br />
ANEXO C<br />
xii
1 INTRODUÇÃO<br />
O interesse por materiais em escala nanométrica cresce extraordinariamente, em<br />
decorrência do seu potencial de aplicação nas mais diversas áreas da ciência e tecnologia. Os<br />
pesquisadores têm adquirido a habilidade de trabalhar a nível molecular, de forma a criar<br />
estruturas complexas, com controle de sua organização (FAGAN et al, 2007).<br />
Na medicina, a aplicação desta tecnologia em sistemas de distribuição de fármacos,<br />
com base na utilização de nano e micropartículas, decorre de vantagens significativas, tais<br />
como a capacidade de segmentar locais específicos do corpo, a redução da quantidade de<br />
medicamento necessária para atingir uma determinada concentração na proximidade do alvo e<br />
a redução da concentração do fármaco nos locais onde a sua presença não é desejada,<br />
minimizando os efeitos colaterais. Todos esses benefícios justificam o crescimento<br />
exponencial do número de publicações relacionadas à entrega de fármacos utilizando<br />
nanopartículas (AMTENBRINK, RECHENBERG e HOFMANN, 2009).<br />
As propriedades das nanopartículas magnéticas (NPMs) permitem que elas sejam<br />
utilizadas em diversas aplicações na área médica, que podem ser classificadas em diferentes<br />
grupos. O primeiro grupo a ser considerado é o de agentes magnéticos de contraste em<br />
imagem por ressonância magnética. Um segundo grupo engloba agentes de hipertermia, onde<br />
as partículas magnéticas são aquecidas seletivamente através da aplicação de um campo<br />
magnético de alta freqüência, que podem agir realizando a ablação térmica de tumores. Um<br />
terceiro grupo abrange ainda vetores magnéticos, que podem ser dirigidos por meio de um<br />
gradiente de campo magnético externo para um determinado local, como no caso da entrega<br />
de fármacos em locais pré-estabelecidos do organismo (ARRUEBO et al, 2007).<br />
Entre o vasto leque de materiais em nanoescala sendo investigados para uso<br />
biomédico, as NPMs ganharam grande atenção devido às suas propriedades magnéticas<br />
intrínsecas, que permitem o acompanhamento através de imagem por ressonância magnética<br />
(IRM). Nesta classe de nanopartículas incluem-se o óxido de ferro metálico, bimetálico e<br />
nanopartículas superparamagnéticas (NPSPMs). Esta última classe possui como<br />
características o seu baixo perfil de toxicidade e superfície reativa, que pode ser facilmente<br />
modificada com revestimentos biocompatíveis (VEISEH et al, 2009).<br />
O controle da biocompatibilidade depende da manipulação das propriedades físicas,<br />
químicas e bioquímicas da superfície das nanopartículas (NPs), que constituem questões<br />
importantes nos projetos de dispositivos biomédicos.
O presente trabalho visou integrar a tecnologia existente de campos magnéticos<br />
potentes, utilizados no diagnóstico por imagem, à nanociência, ramo do conhecimento em<br />
ampla expansão, cujas aplicações aumentam a cada dia.<br />
A ressonância magnética nuclear, que é um método de imagem baseado no<br />
comportamento diferente da magnetização dos prótons de diferentes tecidos, tem assumido<br />
grande importância em relação a outras técnicas de obtenção de imagem. Esta técnica fornece<br />
imagens baseadas no comportamento das estruturas anatômicas, as quais podem ser melhor<br />
destacadas pelo uso de agentes de contraste, em geral paramagnéticos, que alteram o<br />
comportamento dos prótons, realçando estas estruturas. As NPMs, especialmente as menores<br />
que 10 nm, representam uma classe alternativa aos agentes de contraste paramagnéticos para<br />
ressonância magnética nuclear, com vantagens do ponto de vista físico, pois destacam ainda<br />
mais o comportamento magnético dos prótons de diferentes tecidos (BERRY e CURTIS,<br />
2003).<br />
Como os estudos ainda são incipientes nesta área, utilizou-se nanopartículas com<br />
propriedades superparamagnéticas, ou seja, aquelas cujas propriedades são potencializadas em<br />
função de seus diminutos sítios magnéticos. Com revestimento biocompatível adequado, elas<br />
foram utilizadas para estudar a sua eficiência no realce de estruturas anatômicas. Este objetivo<br />
foi alcançado através da administração de NPMs em ratos, com a posterior submissão destes<br />
à imageamento por ressonância magnética.<br />
Como características desejáveis, um agente de contraste endovascular deve<br />
apresentar um pequeno volume de distribuição e uma intensidade de sinal alto e estável no<br />
sistema vascular para a duração do procedimento de imagem. Após o diagnóstico, o agente<br />
deve deixar o corpo. Sua concentração no sangue deve diminuir ao longo do tempo,<br />
caracterizado por uma meia-vida curta (WEINMANN, 2002).<br />
Neste trabalho, optou-se pelo núcleo das NPMs de óxido de ferro, especificamente a<br />
magnetita (Fe3O4), tendo em vista a sua alta susceptibilidade magnética. A dextrana e o ácido<br />
oléico foram os materiais de escolha a serem utilizados como revestimento biocompatível das<br />
NPMs. A dextrana, por ser capaz de solubilizar-se em meio aquoso e ao mesmo tempo<br />
encapsular moléculas hidrofóbicas no seu interior (CUNHA e BARRETO, 2007).<br />
Considerando a disponibilidade também de NPMs com revestimento de ácido oléico, estas<br />
também foram utilizadas no trabalho, com o objetivo de comparar seus efeitos com as<br />
primeiras.<br />
Com isto, foi avaliado o comportamento das NPMs no organismo, identificando os<br />
seus sítios de fixação, através do realce nas imagens de RM, possibilitando a análise das suas<br />
2
potenciais aplicações em imagenologia, assim como na vetorização de fármacos, em função<br />
dos órgãos alvo identificados.<br />
Como forma de atingir este objetivo, as principais etapas realizadas no decorrer do<br />
trabalho foram: (i) administração das nanopartículas magnéticas nos ratos por via endovenosa<br />
caudal; (ii) submissão dos ratos, antes e após a administração das nanopartículas, a gradientes<br />
de campo magnético, por meio de ressonância magnética; (iii) avaliação da aplicação das<br />
NPMs como meio de contraste para a obtenção de imagens por ressonância magnética; (iv)<br />
avaliação das imagens obtidas dos ratos cujas nanopartículas foram administradas, por<br />
médicos radiologistas; (v) determinação dos órgãos-alvo das nanopartículas magnéticas para<br />
possíveis aplicações clínicas e (vi) a comparação dos resultados obtidos com os dados da<br />
literatura.<br />
A utilização de nanopartículas magnéticas como agentes de contraste para imagem<br />
por ressonância magnética ainda é incipiente e poucos trabalhos relatam este tipo de aplicação<br />
(ARRUEBO, 2007; BERRY, 2003; COROT, 2006; DI MARCO, 2007; OGHABIAN,<br />
2010). Essa linha de estudos merece atenção especial, considerando que a ênfase de<br />
contrastação dos tecidos é diferente daquela obtida pelos agentes de contraste tradicionais.<br />
O desenvolvimento deste projeto justifica-se, portanto, pela possibilidade de<br />
utilização da nanotecnologia na obtenção imagens diagnósticas mais elucidativas. Com o<br />
conhecimento das propriedades das nanopartículas magnéticas e do seu comportamento no<br />
meio biológico, podem surgir várias condições em que o seu uso, além das aplicações em<br />
imagem, torne os tratamentos mais independentes dos efeitos adversos, ocasionados pela<br />
forma tradicional de distribuição de fármacos no organismo.<br />
Considerando-se que o trabalho apresentado depende diretamente das propriedades<br />
magnéticas e físico-químicas, do comportamento decorrente da escala nanométrica das<br />
partículas utilizadas, assim como a sua interação com o meio biológico, fica evidente o caráter<br />
interdisciplinar das áreas do conhecimento envolvidas.<br />
Nos capítulos seguintes, abordaremos os tópicos diretamente relacionados com o<br />
desenvolvimento deste trabalho. No capítulo 2, abordaremos os princípios de campo<br />
magnético, nanopartículas magnéticas e imageamento por ressonância magnética. No capítulo<br />
3 estão descritos os recursos materiais e a metodologia utilizada. No capítulo 4 são<br />
apresentados os resultados e discussões e, no capítulo 5, as conclusões.<br />
3
2 REFERENCIAL TEÓRICO<br />
2.1 FUNDAMENTOS DO MAGNETISMO<br />
Os primeiros relatos de fenômenos magnéticos remontam da antiguidade. Em uma<br />
região da Ásia Menor, chamada Magnésia, pastores observaram que um tipo de rocha, hoje<br />
conhecida como magnetita (Fe3O4), atraía fragmentos de ferro. A primeira grande aplicação<br />
tecnológica do magnetismo foi a bússola, instrumento de orientação fundamental na época<br />
dos grandes descobrimentos (MACHADO, 2002). O primeiro tratado, De Magnete, datado de<br />
1600, foi escrito por Gilbert, considerado o pai do magnetismo. Ele foi o primeiro a dizer que<br />
a Terra era um grande magneto (NOVAK, 2000).<br />
O surgimento do método científico e a substituição da metafísica pela matemática,<br />
entre 1600 e 1700 (Galileu, Newton e outros), além do estabelecimento da teoria da<br />
Eletricidade (Coulomb, 1750), fez nascer a eletrodinâmica, com Oersted (~1800) e depois<br />
Biot, Savart, Arago, Weber e Ampere. Ampere introduziu a noção de campo magnético e<br />
sugeriu que o magnetismo era devido a correntes microscópicas. No final do século XIX,<br />
Faraday, um físico experimental, foi o primeiro a utilizar o termo campo magnético. Sua<br />
principal contribuição foi a sua lei da indução. Maxwell, que era um físico teórico, formulou<br />
matematicamente as observações de Faraday e forneceu toda a base da eletrodinâmica com<br />
suas equações (NOVAK, 2000).<br />
O campo magnético é produzido por cargas elétricas em movimento. O compor-<br />
tamento de um campo magnético gerado por uma carga em movimento está contido na lei de<br />
Biot-Savart, relacionada aos dois cientistas franceses, cujo estudo resultou na equação 1, que<br />
descreve essa lei:<br />
0<br />
qvsen<br />
B <br />
2<br />
4 r<br />
onde r é a distância à partir da carga, θ é o ângulo formado entre v e r e μ0 a constante de<br />
permeabilidade magnética, cujo valor é μ0 = 1,257x10 -6 N/A 2 .<br />
A unidade do campo magnético é o Tesla (T); o Sistema Internacional de Unidades<br />
define T como sendo a indução magnética uniforme que produz uma força constante de 1<br />
N/m 2 em um condutor retilíneo, situado no vácuo e percorrido por uma corrente elétrica<br />
invariável de 1 A, sendo perpendiculares entre si as direções da indução magnética, da força e<br />
da corrente.<br />
4<br />
(1)
Qualquer magneto constitui sempre um dipolo, ou seja, um de seus lados ou extremi-<br />
dades terá um comportamento magnético de atração ou de repulsão, chamados pólos norte e<br />
pólo sul (Figura 1). Mesmo que se divida o magneto ao meio, as extremidades resultantes<br />
passarão a conter também dois pólos. Por mais que continuemos a dividir cada fragmento<br />
restante em dois, os pólos norte e sul sempre estarão presentes. Este fato mostra que não<br />
existem monopolos magnéticos, assim como não existe uma carga magnética, como acontece<br />
na eletricidade. Esta afirmação é descrita matematicamente na equação 2, pela 3ª lei de<br />
Maxwell para o magnetismo.<br />
. B <br />
<br />
0<br />
, (2)<br />
cuja interpretação mostra que o divergente do campo magnético é nulo porque todas as linhas<br />
de campo que entram em uma superfície gaussiana também saem dela. Na forma integral,<br />
temos:<br />
<br />
B. nˆ<br />
da 0<br />
<br />
Figura 1: Magneto em barra mostrando os pólos norte e sul e suas linhas de campo (HEWITT,<br />
2002).<br />
Cargas elétricas em rotação também dão origem a campos magnéticos. A fonte mais<br />
simples de campo magnético é o chamado dipolo magnético. Se uma corrente I circula em<br />
torno de uma área A, gera-se um vetor, chamado momento magnético:<br />
IA <br />
<br />
5<br />
(3)<br />
(4)<br />
em que A é um vetor de módulo igual à área A, orientado perpendicularmente à superfície. O<br />
elétron possui, além da sua carga elétrica, um momento de dipolo magnético bem determina-
do, chamado de spin. O valor desse momento é chamado de magnéton de Bohr, que é a uni-<br />
dade fundamental de momento magnético e vale, em unidades do SI, μB=9,27.10 -24 Am 2 .<br />
A soma dos momentos magnéticos de dipolo em um volume V, dividida por esse<br />
volume, nos leva a outra importante grandeza, a magnetização:<br />
1<br />
M i<br />
V<br />
i<br />
A grandeza que caracteriza um material magnético segundo sua resposta a um campo<br />
magnético aplicado chama-se susceptibilidade magnética (χ). Muitas vezes, os materiais<br />
apresentam uma resposta não linear, de modo que deve-se tomar o limite nulo da excitação<br />
(campo aplicado). A susceptibilidade magnética depende da temperatura, do campo e da<br />
posição da amostra. De acordo com a susceptibilidade magnética e, em conseqüência, da<br />
resposta que os materiais apresentam ao serem expostos a um campo magnético, eles podem<br />
ser classificados em diamagnéticos, paramagnéticos, ferrimagnéticos, ferromagnéticos ou<br />
antiferromagnéticos, conforme demonstrado na Tabela 1.<br />
Nos materiais diamagnéticos, aqueles cujos átomos ou íons não possuem momento<br />
dipolar atômico, a ação de um campo magnético externo provoca uma alteração nas correntes<br />
eletrônicas, o que faz aparecer um pequeno momento magnético de polaridade contrária à do<br />
campo magnético aplicado, acabando por repelir as suas linhas de força. Quando a aplicação<br />
do campo cessa, o material deixa de possuir esse momento provisório (FEYNMAN,<br />
LEIGHTON e SANDS, 1963).<br />
Tabela 1: Classificação dos materiais quanto aos valores de susceptibilidade (χ),<br />
permeabilidade (μ) e momentos magnéticos ( )<br />
Material χ μ (Am 2 ) <br />
Diamagnético ˂ 0 (n) ˂ 1 opostos a B<br />
Paramagnético ˃ 0 (f) ˃ 1 aleatórios<br />
Ferromagnético ˃˃ 0 ˃˃ 1 paralelos<br />
Ferrimagnético ˃˃ 0 ˃˃ 1 antiparalelos<br />
Antiferromagnético ˃ 0 ˃1 antiparalelos<br />
Os materiais paramagnéticos, que possuem momentos magnéticos atômicos que não<br />
interagem entre si, são fracamente atraídos por campos magnéticos externos e tornam-se<br />
magnéticos apenas enquanto estiverem sob a ação desse campo. Alguns exemplos da tabela<br />
periódica são o magnésio, o molibdênio, o lítio e o tântalo.<br />
O ferrimagnetismo surge em alguns materiais cerâmicos em que os íons têm<br />
diferentes momentos magnéticos, de forma que surge um momento magnético resultante. Os<br />
6<br />
(5)
materiais ferrimagnéticos naturais são conhecidos genericamente por ferritas, sendo a<br />
magnetita, a mais conhecida, uma vez que é um mineral nativo em muitas regiões do planeta.<br />
Os materiais que são fortemente atraídos por um imã são classificados como<br />
ferromagnéticos, tais como ferro, cobalto e quase todos os tipos de aço. O ferromagnetismo é<br />
o mais evidente dos fenômenos magnéticos. Representa a orientação dos dipolos magnéticos<br />
(domínios magnéticos) em relação a um campo magnético externo, e mantém esta orientação<br />
mesmo quando o campo magnético é retirado. Por esta propriedade de reter orientação<br />
magnética, eles se tornam imantados e são muito usados para gravação de memória<br />
magnética, motores, fabricação de imãs permanentes, etc. Os sólidos ferromagnéticos<br />
apresentam susceptibilidade magnética muito superior a 1 (χ >>1). Contudo, as flutuações de<br />
origem térmica tendem a desalinhar aleatoriamente seus domínios magnéticos, enfraquecendo<br />
a sua interação e, desta forma, os materiais ferromagnéticos só o são abaixo de uma<br />
determinada temperatura crítica (KNIGHT, 2009).<br />
O antiferromagnetismo é o ordenamento magnético de todos os momentos<br />
magnéticos de um material na mesma direção mas, em sentido inverso. Para um material ser<br />
descrito como antiferromagnético, este efeito tem que percorrer todo o material. Existe uma<br />
propriedade semelhante a dos materiais ferromagnéticos no que diz respeito a altas<br />
temperaturas, relacionada ao ponto no qual o antiferromagnetismo perde suas propriedades e<br />
se torna paramagnético, que é chamada de temperatura de Néel. Ao submeter um material<br />
antiferromagnético a um campo magnético intenso, alguns de seus domínios se alinham<br />
paralelamente a ele, mas ao mesmo tempo que se alinham em paralelo com os domínios<br />
vizinhos. A Figura 2 mostra o esquema do comportamento dos momentos magnéticos de<br />
alguns destes materiais (KOROLEVA e KHAPAEVA, 2009).<br />
Figura 2: Comportamento dos momentos magnéticos dos átomos em materiais (A)<br />
diamagnéticos, (B) paramagnéticos, (C) anti-ferromagnéticos, (D) ferrimagnéticos e (E)<br />
ferromagnéticos.<br />
Geralmente é necessário um campo magnético muito intenso para alinhar o momento<br />
magnético em todo o material. Em alguns casos, pode até haver imantação devido a um<br />
7
campo magnético muito forte. Alguns exemplos de materiais antiferromagnéticos são o cromo<br />
e o manganês (REITZ, MILFORD E CHRISTY, 1982).<br />
Uma característica importante sobre os materiais magnéticos é que, acima de uma<br />
determinada temperatura, eles perdem suas propriedades magnéticas, pois o calor provoca um<br />
desordenamento na disposição das suas partículas. Esta temperatura, que é constante para<br />
cada substância, é denominada temperatura de Curie (Tc) ou ponto de Curie. Esta transição é<br />
reversível através do resfriamento do material. Quando T
magnetizada. Nesse estado de magnetização permanente, o momento magnético total é a<br />
soma vetorial de todos os momentos atômicos, resultando em um momento magnético gigante<br />
(EYRE, 2006).<br />
Pequenas partículas magnéticas exibem fenômenos únicos, tais como tunelamento<br />
quântico da magnetização, ocasionando o superparamagnetismo, que é um dos principais<br />
fenômenos observados na nanoescala. Quando um material ferromagnético é fragmentado até<br />
uma nanopartícula, a curva de histerese típica desaparece e o sistema entra em um regime<br />
pelo qual a magnetização é totalmente reversível (SOUZA FILHO e FAGAN, 2011).<br />
Quando o campo magnético aplicado em um material ferromagnético for aumentado<br />
até a saturação e em seguida for diminuído, a densidade de fluxo B (weber/m 2 ) não diminui<br />
tão rapidamente quanto o campo H (weber/m 2 ). Dessa forma, quando H chega a zero, ainda<br />
existe uma densidade de fluxo remanescente, Br. Para que B chegue a zero, é necessário<br />
aplicar um campo negativo, chamado de força coercitiva. Se H continuar aumentando no<br />
sentido negativo, o material é magnetizado com polaridade oposta. A redução do campo<br />
novamente a zero deixa uma densidade de fluxo remanescente, -Br, e, para reduzir B a zero,<br />
deve-se aplicar uma força coercitiva no sentido positivo. Aumentando-se mais ainda o campo,<br />
o material fica novamente saturado, com a polaridade inicial. Esse fenômeno que causa o<br />
atraso entre densidade de fluxo e campo magnético é chamado de histerese magnética,<br />
enquanto que o ciclo traçado pela curva de magnetização é chamado de ciclo de histerese<br />
(Figura 4). A histerese magnética não ocorre com materiais paramagnéticos. Nesse caso, ao<br />
retirar o campo externo aplicado, a magnetização retorna ao estado inicial. No caso de<br />
materiais superparamagnéticos, o comportamento da magnetização é semelhante, porém, com<br />
uma resposta de magnetização muito superior à dos materiais paramagnéticos.<br />
Figura 4: Curvas de histerese dos materiais ferromagnéticos e das respostas diferentes da<br />
magnetização (B) dos materiais para e superparamagnéticos quando sujeitos a um campo<br />
externo H. As unidades das duas grandezas é o Tesla.<br />
9
2.2 NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS (NPMS)<br />
A nanotecnologia, por definição, está relacionada à manipulação da matéria em<br />
uma escala em que os materiais revelam características exclusivas, ou seja, não encontradas<br />
quando o mesmo material é analisado em escala macroscópica. A origem das propriedades de<br />
induzida pelo tamanho em nanomateriais depende basicamente dos fenômenos de superfície<br />
e efeitos de confinamento quântico. A razão superfície vs volume aumenta rapidamente<br />
quando o tamanho das partículas diminui. Quando um determinado material tem pelo menos<br />
uma dimensão reduzida a nanoescala, os vetores de onda eletrônica tornam-se quantizados e<br />
o sistema apresenta seu níveis de energia discretos (SOUZA FILHO e FAGAN, 2011).<br />
Tais mudanças traduzem-se pela apresentação de tolerância à temperatura, variedade<br />
de cores, alterações da reatividade química, da condutividade elétrica, ou por exibir<br />
interações de intensidade extraordinária. Em geral, tais peculiaridades ocorrem quando as<br />
dimensões das partículas não ultrapassam os 100 nanometros. Estas características justificam<br />
o interesse tecnológico em relação aos nanomateriais, que já são fabricados em escala<br />
comercial para emprego em vários produtos como cosméticos, tintas, revestimentos, tecidos,<br />
catalisadores ou para proporcionar mais resistência aos materiais (AMTENBRINK,<br />
HOFMANN e MONTET, 2010).<br />
As NPMs apresentam características que as tornam um importante recurso em<br />
potencial na área médica. Primeiro, elas possuem tamanhos controláveis, que variam de<br />
alguns nanometros até dezenas de nanometros, o que as coloca em dimensões que são<br />
menores ou comparáveis a uma célula (10 a 100 μm), um vírus (20 a 450 nm), uma proteína<br />
(5-50 nm) ou um gene (2 nm de largura 1-100 nm de comprimento). Isto significa que elas se<br />
equivalem em tamanho a uma entidade biológica de interesse. Na verdade, elas podem ser<br />
revestidas com moléculas biológicas para que possam interagir com ou se vincular a uma<br />
entidade biológica e assim fornecer um meio controlado de marcá-lo ou abordá-lo<br />
(PANKHURST, CONNOLLY e JONE 2003).<br />
Com revestimento de superfície adequado, as NPMs podem permanecer dispersas<br />
em solventes apropriados, formando suspensões homogêneas, chamado fluidos magnéticos.<br />
Fluidos magnéticos podem ser submetidos a um campo magnético externo, possibilitando a<br />
aquisição de imagens por ressonância magnética para o diagnóstico médico (LIU, 2011).<br />
A magnetita, que é o material constituinte do núcleo das NPMs utilizada no presente<br />
trabalho, tem a particularidade de conter tanto íons Fe 2+ quanto Fe 3+ , dentro de uma estrutura<br />
espinélio inversa. Trinta e dois ânions de oxigênio formam uma célula unitária cúbica,<br />
centrada na face, com um comprimento da aresta de 0,839 nm. Nesta célula unitária, íons de<br />
10
ferro estão localizados em 8 sítios tetraédricos, cercados por 4 íons de oxigênio, e 16 sítios<br />
octaédricos, rodeados por 8 íons de oxigênio. Os sítios tetraédricos são ocupados<br />
exclusivamente por íons Fe 3+ , enquanto íons Fe 2+ e Fe 3+ ocupam alternadamente posições<br />
octaédricas (Figura 5).<br />
Figura 5: Estrutura espinélio inversa de magnetita. (a) Ilustração da parte frontal de uma<br />
célula unitária cúbica. (b) Organização ferrimagnética da magnetita (Extraído de GOSSUIN,<br />
2009).<br />
Esta organização é, por vezes, expressa na fórmula para magnetita Fe 3+ [Fe 2+ Fe 3+ ]O4<br />
e maghemita Fe 3+ [(Fe 3+ )5/3 V1/3]O4, onde V representa uma vacância de cátion (GOSSUIN,<br />
2009). No tópico seguinte são discutidas as técnicas de síntese das nanopartículas.<br />
2.2.1 Técnicas de Obtenção de NPMs<br />
A produção das NPMs ocorre a partir de metais de ferro e cobalto puro e ligas de<br />
CoPt3, FePt, FeZn, e de óxidos de ferro, incluindo a magnetita (Fe3O4) e maghemita (γ-<br />
Fe2O3). Os óxidos de ferro também podem ser dopados para aumentar suas propriedades<br />
magnéticas para formar MFe2O4, onde M é um cátion bivalente, tais como íons de Mn 2+ ,<br />
Fe 2+ , Co 2+ ou Ni 2+ (VEISEH et al, 2009). Quando o núcleo destas nanoestruturas possui<br />
dimensão menor que 25 nm, a NPM adquire característica superparamagnética, estado em que<br />
ela somente apresenta magnetização quando submetida a um campo magnético externo.<br />
Vários métodos de síntese de nanopartículas magnéticas têm sido relatados. A<br />
metodologia mais utilizada envolve a co-precipitação alcalina de íons ferrosos e férricos em<br />
solução aquosa, na presença de um agente estabilizador (como dextrana, por exemplo). Uma<br />
boa estabilização da magnetização também pode ser atingida após a síntese através da<br />
11
adsorção única na superfície destes agentes. No entanto, em se tratando de síntese química,<br />
ainda é um desafio obter partículas magnéticas com uma população monodispersa em grande<br />
escala para usos clínicos (DI MARCO, 2007).<br />
A síntese de nanopartículas superparamagnéticas é um processo complexo, devido à<br />
sua natureza coloidal. O primeiro desafio na obtenção do produto químico principal consiste<br />
na definição de condições experimentais, levando a uma população monodispersa de grãos<br />
magnéticos de tamanho adequado. O segundo ponto crítico é a escolha de um processo<br />
reprodutível, podendo ser industrializado, sem qualquer processo complexo de purificação.<br />
Vários processos foram adaptadas para a produção de nanopartículas magnéticas a partir de<br />
técnicas de solução ou de aerossol ou em fase de vapor (COROT et al, 2006)<br />
Novos processos também devem fornecer o óxido de ferro caracterizado por um<br />
elevado grau de cristalinidade e, conseqüentemente, uma alta magnetização de saturação. O<br />
revestimento precisa ser otimizado para simplificar o processo e prevenir de forma eficaz a<br />
qualquer agregação e sedimentação das nanopartículas superparamagnéticas para fornecer<br />
uma solução estável para injecção ou um pó liofilizado que é fácil de reconstituir.<br />
A decomposição de ferro (III) acetilacetonato em éter dibenzil na presença de ácido<br />
oléico tem sido usada para sintetizar nanopartículas de óxido de ferro monodispersas.<br />
(GUARDIA et al, 2009).<br />
2.2.2 Revestimentos<br />
O uso in vivo das nanopartículas exige que elas sejam revestidas, para minimizar os<br />
efeitos indesejados com o meio biológico (LACAVA e MORAIS, 2004). Estes revestimentos<br />
de superfície, geralmente compostos por pequenas moléculas orgânicas e polímeros, servem<br />
para evitar aglomeração de óxido de ferro dos núcleos, possibilitar a manipulação química<br />
para viabilizar vetorização de fármacos e limitar a interação de células não-específicas. Para<br />
atender a essas funções de revestimento, um grupo diversificado de polímeros têm sido<br />
investigados, incluindo polietilenoglicol (PEG), dextrana, ciclodextrina, quitosana<br />
(polissacarídeo catiônico), polietilenoimina (PEI) e outros (VEISEH et al, 2009).<br />
As dextranas são formadas a partir da sacarose, através do crescimento de bactérias<br />
pertencentes aos gêneros Leuconostoc, Streptococcus e Lactobacillus. No entanto, a maioria<br />
das dextranas é sintetizada pela bactéria da espécie Leuconostoc mesenteroides. Assim como<br />
a maioria dos polímeros solúveis em água, as moléculas administradas com baixo peso<br />
molecular (menor que 10 kDa) são eliminados do organismo por filtração glomerular. Para as<br />
dextranas com massas molares superiores a 40 kDa, a sua metabolização ocorre pela ação da<br />
12
enzima dextranase (dextrano 1,6-glucosidase, presente em órgãos como o fígado, baço, rins e<br />
cólons) que os degrada em glicose (BELDER, 2003).<br />
As dextranas, cuja estrutura molecular está apresentada na Figura 6, são muito<br />
utilizadas em aplicações biomédicas devido à sua biocompatibilidade, baixo custo e<br />
facilidade na sua modificação. Dentro destas aplicações destacam-se o desenvolvimento de<br />
agentes de contraste para imaginologia médica, sobretudo com o objetivo de aumentar o<br />
tempo de retenção destes compostos na circulação. Estudos sobre a estabilidade química de<br />
dextranas clínicas em pH 4,5 a 7, quando armazenado por vários anos em temperaturas entre<br />
4° a 40 °C, revelou que a dextrana tem excelente estabilidade (BELDER, 2003).<br />
Figura 6: Estrutura química da dextrana (adaptado de BELDER, 2003).<br />
Outra substância, a ciclodextrina (CD) constitui uma classe de excipientes<br />
farmacêuticos compostos por unidades de D-glucopiranose, que unidas originam estruturas<br />
cíclicas troncocônicas. A estrutura espacial cônica e a orientação dos grupos hidroxílicos para<br />
o exterior conferem a estes açúcares cíclicos propriedades físico-químicas únicas, sendo<br />
capazes de solubilizar-se em meio aquoso e ao mesmo tempo encapsular no interior da sua<br />
cavidade moléculas hidrofóbicas. Na área farmacêutica, este excipiente tem sido explorado<br />
principalmente no incremento da solubilidade, estabilidade e biodisponibilidade de<br />
medicamentos (HILDEBRAND et al, 2006 e MESSNER et al, 2010).<br />
O mecanismo de fixação de superfície do revestimento polimérico ou monomérico<br />
deve ser investigado através de técnicas de caracterização de superfície para descrever a<br />
natureza e a força da superfície vinculativa (hidrogênio, pseudo-covalentes, iônicas). As<br />
propriedades físico-químicas de superfície das NPMs muito pequenas (diâmetros menores que<br />
15 nm, ou USPIOs, do inglês, ultra small superparamagnetic iron oxide) interferem<br />
fortemente na sua capacidade de ser internalizadas pelos macrófagos e outras células<br />
fagocíticas após a administração intravenosa. Portanto, a presença do revestimento é<br />
13
fundamental para modular o destino das USPIOs, controlando suas propriedades elétricas de<br />
superfície (ARIAS et al, 2006).<br />
Em geral, os agentes de revestimento que são adsorvidos fisicamente (por interações<br />
eletrostáticas ou delimitação pelo hidrogênio) mostram estabilidade limitada em comparação<br />
com os agentes de revestimento que são adsorvidos quimicamente. A estabilidade do<br />
revestimento também depende da quantidade de interações químicas que cada molécula<br />
individual ou macromolécula pode estabelecer com a superfície das nanopartículas. Como<br />
resultado, cada interação entre o revestimento e a superfície de óxido de metal tem que ser<br />
analisada e discutida em uma base individual (DI MARCO et al, 2007).<br />
2.2.3. Caracterização de NPMs<br />
A metodologia mais importante de caracterização da estrutura das nanopartículas é a<br />
difração de raios X, com as duas fontes de radiação: síncrotron e convencional. A análise<br />
térmica, Mossbauer e espectroscopia de infravermelho fornecem informações adicionais úteis<br />
(DI MARCO et al, 2007).<br />
A maioria destas técnicas requer a secagem das amostras que, para aplicações<br />
biológicas, precisam estar dispersas em um líquido. A secagem da amostra ou a sua<br />
colocação em uma superfície úmida pode induzir mudanças significativas sobre as<br />
características físico-químicas das USPIOs, como a ocorrência de agregação irreversível das<br />
partículas. Assim, os resultados obtidos podem não refletir com precisão a natureza das<br />
espécies na dispersão do líquido. As nanopartículas podem ser caracterizadas como uma<br />
suspensão líquida, principalmente por pequenos ângulos de espalhamento de raios X ou de<br />
nêutrons (DI MARCO et al, 2007).<br />
O potencial zeta desempenha um papel importante na caracterização eletrocinética<br />
das interfaces sólido-líquido, sendo definido como o potencial elétrico no plano de<br />
cisalhamento, também conhecido como plano de escorregamento. O potencial zeta também<br />
pode ser descrito como uma função da densidade superficial de carga, no plano local de<br />
cisalhamento, e a estrutura de superfície e é um parâmetro muito importante no que diz<br />
respeito a muitas características de materiais dispersos.<br />
Uma propriedade fundamental das superfícies de óxido de metal é a sua tendência<br />
para construir uma carga de superfície quando em contato com a água. Isso vai induzir efeitos<br />
eletrostáticos nas vizinhanças da partícula carregada. Em solução, a presença de uma carga<br />
líquida sobre uma partícula afeta a distribuição de íons circundantes, resultando em um<br />
aumento na concentração de contra-íons (íons de carga oposta à partícula) nas proximidades<br />
14
da partícula. Isto implica que a dupla camada é determinada pela força iônica da solução.<br />
Assim, há dificuldade para diferenciar a mudança no plano de corte de medidas de potencial<br />
zeta em diferentes condições de concentração de eletrólitos. Como conseqüência, potencial<br />
zeta (ζ) não pode ser medido diretamente, e sim calculado a partir de técnicas experimentais<br />
(fluxo atual ou potencial, mobilidade eletroforética e a condutividade elétrica) com a ajuda de<br />
abordagens teóricas. Existe um método alternativo baseado no ultra-som que está rapidamente<br />
se tornando importante. O método de ultra-som tem uma grande vantagem sobre as técnicas<br />
tradicionais baseadas na luz, porque é capaz de caracterizar os sistemas concentrados, sem<br />
diluição. Na verdade, os métodos baseados em luz exigem, em geral, as suspensões de<br />
diluição extrema, a fim de tornar a amostra suficientemente transparente para a medição.<br />
2.2.4 Aplicações das NPMs na Medicina<br />
As nanopartículas magnéticas obedecem às leis de Maxwell e podem ser<br />
manipuladas por um gradiente de campo magnético externo. Esta ação à distância, combinada<br />
com a intrínseca penetrabilidade de campos magnéticos em tecidos humanos, abre muitas<br />
aplicações que envolvem o transporte e/ou imobilização de nanopartículas magnéticas, ou de<br />
marcar magneticamente entidades biológicas. Dessa forma, isto pode ser feito para entregar<br />
um pacote, como um fármaco anticâncer ou um grupo de átomos de radionuclídeos, em uma<br />
região-alvo do corpo, como um tumor.<br />
As NPMs podem também ser usadas para responder a um campo magnético variável<br />
no tempo, com resultados relacionados a transferência de energia do campo de excitação.<br />
Neste caso, a partícula pode ser usada para aquecer, o que leva à sua utilização como agentes<br />
de hipertermia, fornecendo quantidades tóxicas de energia térmica para quimioterapia aos<br />
órgãos-alvo, tais como tumores, ou como radioterapia e agentes de reforço, onde um<br />
moderado grau de aquecimento dos tecidos resulta na destruição mais eficaz das células<br />
malignas (PANKHURST, CONNOLLY e JONE, 2003).<br />
Outra aplicação ainda incipiente de NPMs está relacionada à sua utilização como<br />
agente de contraste de imagem no método de ressonância magnética. As NPMs têm em<br />
comum a sua absorção específica do sistema fagocitário e, se elas não são inteiramente<br />
capturadas pelo fígado e baço, podem ser amplamente avaliadas como marcadores de<br />
ressonância magnética para o diagnóstico de doenças inflamatórias e degenerativas associadas<br />
à alta atividade fagocítica dos macrófagos (COROT et al, 2006).<br />
Estas e muitas outras aplicações potenciais estão disponíveis na biomedicina, como<br />
resultado das propriedades físicas especiais das NPMs.<br />
15
2.2.5 Mecanismos de interação biológica<br />
A farmacocinética e a captação celular in vivo das NPMs, incluindo a sua<br />
capacidade de interagir com as barreiras biológicas, estão em grande parte relacionados com<br />
as suas propriedades físico-químicas, incluindo a morfologia, tamanho, hidrofobicidade, carga<br />
e outras propriedades de superfície. Essas propriedades são determinadas pelos tipos,<br />
estruturas e orientações dos materiais que as compõem (VEISEH et al, 2009).<br />
Uma vez que uma NP entra na corrente sanguínea, processos opositores ativam o<br />
sistema mononuclear fagocitário (SMF) de resposta. Dependendo da biodegradabilidade e<br />
tamanho, algumas das NPs presentes nas vesículas lisossômicas em células de Kupffer, no<br />
fígado, podem ser incorporadas à bile e removidas nas fezes. Outras NPs serão filtradas pelos<br />
rins e eliminadas na urina. Em geral, as NPs menores estão sujeitas a rápida eliminação renal,<br />
ao passo que as maiores mostram captação pelo fígado, baço, e medula óssea (Figura 7 ).<br />
Partículas grandes são removidas pelas células capazes de fagocitose, ou seja, macrófagos ou<br />
células dendríticas, enquanto pequenas partículas podem ser removidas por células capazes de<br />
endocitose (Linfócitos B e T). Se as NPs magnéticas são biodegradáveis, os produtos de<br />
decomposição podem ser tomados por qualquer célula por meio de pinocitose (ARRUEBO et<br />
al, 2007).<br />
Partículas magnéticas menores do que 4 nm são removidas pelas células do SMF,<br />
principalmente no fígado (60-90%) e baço (3-10%). Partículas maiores que 200 nm são<br />
geralmente filtradas pelo baço, cujo ponto de corte se estende até 250 nm, enquanto que as<br />
partículas maiores que 100 nm são fagocitadas por células principalmente do fígado.<br />
Em geral, quanto maiores as partículas, mais curta é a sua meia vida no plasma. Este<br />
clearance de partículas pelas células de Kupffer podem ser, por outro lado, útil para o<br />
tratamento de doenças do fígado, como câncer ou leishmania, tuberculose, listeriose,<br />
hanseníase, etc, embora seja importante considerar que, simultaneamente, implica na<br />
destruição de um número significativo de células de defesa do paciente (KIM et al, 2007).<br />
16
Figura 7: Diagrama qualitativo relacionando o tempo de residência no sangue com o tamanho<br />
da partícula (adaptado de ARRUEBO et al, 2007).<br />
Para nanopartículas de óxido de ferro, sua meia-vida no sangue é dose-dependente.<br />
Essa característica já foi demonstrada por vários sistemas de nanopartículas e está relacionada<br />
a uma saturação progressiva do consumo de macrófagos no fígado ou outros órgãos ricos em<br />
macrófagos, como o baço e a medula óssea. No entanto, o ligeiro aumento da meia-vida<br />
encontrada no intervalo de doses clínicas não causa impacto relevante em termos de imagens<br />
clínicas em função do perfil global da farmacocinética dos compostos. A meia-vida das<br />
USPIO no sangue é geralmente maior nos seres humanos do que em animais. Por exemplo,<br />
em doses de 30 ou 45 μmol Fe/kg, a meia-vida no sangue de ferumoxtran-10 é de 2 a 3 horas<br />
em ratos e de 24 a 36 horas em seres humanos. Uma vez que o acesso das USPIOs aos órgãos<br />
é facilitado por um tempo prolongado de permanência no sangue, experimentos com imagens<br />
de animais, geralmente são feitos usando altas doses de USPIO (200-1000 μmol Fe / kg) em<br />
comparação com a dose clínica humana de 45 μmol Fe / kg (COROT et al, 2006).<br />
A principal indicação clínica para as nanopartículas de óxido de ferro foi de imagem<br />
hepática. Depois da injeção intravenosa, SPIOs são rapidamente fagocitadas por macrófagos<br />
hepáticos especializados, as células de Kupffer, resultando em uma queda na intensidade do<br />
sinal de ressonância magnética e, portanto, gerando imagens com sinal hipointenso,<br />
principalmente por causa de um efeito de susceptibilidade. A magnitude da diminuição da<br />
17
intensidade do sinal é determinada por uma variedade de parâmetros, incluindo a dose<br />
administrada e a seqüência de pulso (COROT et al, 2006).<br />
Como as células de Kupffer estão exclusivamente no parênquima hepático saudável,<br />
as SPIOs aumentam o contraste entre tecidos saudáveis e doentes, desprovidos destas células.<br />
Portanto, tumores não demonstram uma redução permanente da intensidade do sinal após a<br />
administração de óxido de ferro, pois estão desprovidas de macrófagos. As diferenças em<br />
contraste também pode ser devido à atividade suprimida de células de Kupffer como<br />
resultado do crescimento do tumor. Tumores de fígado ou metástases muito pequenas, da<br />
ordem de 2 a 3 mm podem ser detectadas (SEMELKA, 2001)<br />
2.2.6 Toxicidade<br />
Para administração endovenosa de NPMs, a regra geral é que elas sejam não<br />
tóxicas, não imunogênicas e de um tamanho que evita a embolização dos ductos capilares.<br />
Embora a mudança no foco do desenvolvimento de partículas de micro a nanoescala seja<br />
essencial para os avanços na biologia moderna, medicina e produção industrial,<br />
ele carrega um potencial nocivo sobre os organismos e o ambiente (KIM et al, 2006). A falta<br />
de informação sobre a toxicidade de nanopartículas pode resultar em sérios problemas. Por<br />
isso, é necessário que especialistas e pesquisadores em toxicologia, química e outros campos<br />
estejam conscientes da importância de analisar os aspectos positivos dos nanomateriais,<br />
evitando seus potenciais efeitos tóxicos (OBERDORSTER, G., OBERDORSTER, E. e<br />
OBERDORSTER, J., 2005). Várias técnicas de encapsulamento de partículas magnéticas<br />
estão em desenvolvimento, de forma que os sistemas obtidos tornem-se efetivos carreadores<br />
de drogas, com especificidade tumoral para a liberação controlada de agentes. Além de apre-<br />
sentar baixos níveis de toxicidade, as nanopartículas devem também possuir um elevado<br />
momento de saturação, que permita minimizar as doses requeridas (CASTRO et al, 2010).<br />
Até o momento, a importante ligação entre a concentração intracelular de<br />
nanopartículas e os efeitos citotóxicos não foi completamente analisada, e esses são muitas<br />
vezes expressos em termos da quantidade de nanomaterial presente no meio de incubação.<br />
Para a maioria das aplicações biomédicas, a concentração intracelular de nanopartículas é de<br />
importância primordial.<br />
Os efeitos tóxicos das nanopartículas devem ser medidos em momentos nos quais as<br />
células contêm partículas intactas, partículas parcialmente degradadas e completamente<br />
degradadas. Também é importante relatar que quando nanopartículas interagem com as<br />
células, sítios de ligação polivalentes na sua superfície podem provocar ligações cruzadas das<br />
18
proteínas da superfície celular e, assim, interferir com os processos biológicos normais. Os<br />
locais polivalentes de ligação também pode resultar em um aumento da afinidade de ligação<br />
(avidez) para receptores da superfície celular. Assim, as interações multivalentes devido à<br />
ligação de ligantes a nanopartículas podem aumentar a avidez em até 4 vezes (IVERSEN,<br />
SKOTLAND e SANDVIG, 2011).<br />
2.2.7 Excreção celular<br />
Todos os trabalhos que envolvem a excreção de nanopartículas pelas células<br />
concluem que a sua exocitose é muito mais lenta do que endocitose. Considerando que a taxa<br />
de endocitose parece ser mais rápida para as partículas de 20-50 nm, a taxa de exocitose<br />
diminui com o aumento de tamanho de partículas (IVERSEN, SKOTLAND e SANDVIG,<br />
2011). A fração de nanopartículas endocitadas varia para diferentes linhagens celulares. O<br />
percentual de nanopartículas celulares sendo exocitadas em de 1 h em células HeLa foi de<br />
aproximadamente 35, 10 e 5% para as nanopartículas de 14, 50 e 74 nm, respectivamente<br />
(CHITHRANI e CHAN, 2006). Uma questão em aberto é também o que acontece com as<br />
nanopartículas liberadas a partir de células que foram mortas, por exemplo, aquelas que<br />
sofreram interação com nanopartículas contendo fármacos (IVERSEN, SKOTLAND e<br />
SANDVIG, 2011).<br />
2.3 PRINCÍPIOS FÍSICOS DA IMAGEM POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA (IRM)<br />
Compreender os princípios físicos envolvidos na formação da imagem por<br />
ressonância magnética implica na abordagem de fenômenos que ocorrem em escala<br />
subatômica. Um átomo com número de massa ímpar, ou seja, número de prótons diferente do<br />
número de nêutrons, apresenta um movimento de giro do seu núcleo em torno do próprio<br />
eixo. As leis do eletromagnetismo determinam a relação entre a carga elétrica em movimento<br />
e a indução de um campo magnético (Figura 8). Pode-se assim associar ao momento<br />
magnético um vetor de magnetização efetiva (VME), possibilitando um tratamento<br />
matemático apropriado (WESTBROOK e KAUT, 2000).<br />
19
Figura 8. Representação da geração de um dipolo magnético a partir do próton do hidrogênio,<br />
que é carregado positivamente e gira em torno de seu próprio eixo, com um momento<br />
magnético associado (adaptado de MAZZOLA, 2009).<br />
Embora o embasamento físico da RMN já tenha sido descrito em 1946, apenas à<br />
partir da década de 70 é que o desenvolvimento tecnológico permitiu a sua aplicação na área<br />
médica. O método de imagem por ressonância magnética (IRM) surgiu em 1973, utilizando-<br />
se algoritmos de reconstrução de imagens desenvolvidos para a tomografia computadorizada<br />
por raios X. Em 1975, são estabelecidas as bases da RMN, empregadas por métodos de<br />
codificação de fase e freqüência em conjunto com a Transformada de Fourier.<br />
2.3.1 Relação do hidrogênio com um campo magnético externo<br />
A IRM é o resultado da interação do forte campo magnético produzido pelo<br />
equipamento com os prótons de hidrogênio do tecido humano, criando uma condição para que<br />
possamos enviar um pulso de radiofreqüência (RF) e, após, coletar a RF modificada, através<br />
de uma bobina ou antena receptora. Este sinal coletado é processado e convertido numa<br />
imagem ou informação. Os principais átomos que compõem o tecido humano são: hidrogênio,<br />
oxigênio, carbono, fósforo, cálcio, flúor, sódio, potássio e nitrogênio. Estes átomos, exceto o<br />
hidrogênio, possuem no núcleo atômico prótons e nêutrons. Apesar de outros núcleos<br />
possuírem propriedades que permitam a utilização em IRM, o hidrogênio é o escolhido por<br />
três importantes motivos: (i) é o mais abundante no corpo humano, (ii) as características de<br />
ressonância magnética nuclear se diferem bastante entre o hidrogênio presente no tecido<br />
normal e no tecido patológico e (iii) o próton do hidrogênio possui o maior momento mag-<br />
nético e, portanto, a maior sensibilidade a RMN (MAZZOLA, 2009 e CABAL et al, 2009).<br />
As propriedades de ressonância magnética têm origem na interação entre um átomo e<br />
um campo magnético externo. É um fenômeno em que partículas contendo momento angular<br />
e momento magnético exibem um movimento de precessão quando estão sob ação de um<br />
20
campo magnético (B0). A influência do campo magnético externo B0 faz com que apareça<br />
uma oscilação adicional em torno do eixo de rotação do próton, denominado como<br />
movimento de precessão, o que faz com que os momentos magnéticos descrevam um<br />
movimento circular em torno do eixo de B0. O percurso de oscilação é chamado trajetória de<br />
precessão e a velocidade com que o VME oscila em torno de B0 é definida como freqüência<br />
de precessão. O valor da freqüência de precessão é descrito pela equação de Larmor:<br />
ω = B0 . γ (6)<br />
onde B0 é a potência do campo magnético em Tesla e γ é a razão giromagnética, que por sua<br />
vez expressa a relação entre o momento angular e o momento magnético de cada núcleo ativo<br />
em RM (WESTBROOK e KAUT, 2000).<br />
A energia necessária para causar movimento de precessão no próton de hidrogênio<br />
corresponde à faixa de radiofreqüência (RF) do espectro eletromagnético. Para que ocorra a<br />
ressonância, é necessário que seja aplicado um pulso de energia RF exatamente com a<br />
freqüência de Larmor do VME do hidrogênio (Figura 9B). A energia da onda de<br />
radiofreqüência aos núcleos traduz-se por uma oscilação da magnetização total M em relação<br />
à sua posição inicial. O valor do ângulo de oscilação é uma função da amplitude e da duração<br />
do pulso de excitação. Chamamos de pulso de 30°, 90° ou 180° uma onda de radiofreqüência<br />
de intensidade e duração tais que, imediatamente após o pulso, a magnetização M forme um<br />
ângulo de 30°, 90° ou 180°com o campo B0. Outros núcleos ativos não entram em RM por<br />
não possuírem a mesma freqüência de precessão do hidrogênio (DOYON e CABANIS,<br />
2000).<br />
A B<br />
Figura 9: Em A está está representada a magnetização resultante da aplicação de uma campo<br />
magnético externo sobre uma população de núcleos de hidrogênio. Em B, com a aplicação<br />
adicional de um pulso de RF, o eixo de precessão é forçado a se distanciar do alinhamento<br />
original.<br />
21
2.3.2 Formação do contraste da imagem de RMN<br />
Quando o pulso de RF é removido, os núcleos de hidrogênio "relaxam" de volta ao<br />
seu estado original. Este processo pode ser medido por sua relaxação longitudinal (T1) ou<br />
relaxação transversal (T2), ambas podendo gerar uma imagem de RM. A variação do<br />
relaxamento corresponde às taxas de contraste da imagem, permitindo a discriminação entre<br />
os tipos de tecido (VEISEH, 2009).<br />
Durante o relaxamento, o VME libera a energia de RF absorvida e retorna o seu<br />
alinhamento com B0. O relaxamento leva a recuperação da magnetização no plano<br />
longitudinal e ao declínio da magnetização no plano transverso (xy).<br />
O contraste das imagens de RMN é, portanto, conseqüência principalmente dos<br />
mecanismos de recuperação T1 e declínio T2. No tecido adiposo, por exemplo, os momentos<br />
magnéticos dos núcleos lipídicos relaxam e recuperam rapidamente sua magnetização<br />
longitudinal. Desta forma, o tempo T1 do tecido adiposo é curto e sua imagem característica é<br />
hiperintensa em T1. Ao contrário, na água os momentos magnéticos demoram mais para<br />
relaxar e recuperar a magnetização longitudinal e, portanto, o tempo T1 da água é longo e sua<br />
característica é de imagem hipointensa em T1. Da mesma forma, o declínio T2 do tecido<br />
adiposo é curto, e o tempo T2 da água é longo, mostrando imagens hipointensas e<br />
hiperintensas, respectivamente.<br />
Figura 10: Representação da curva de recuperação T1 (A) e curva de declínio T2 (B).<br />
A recuperação T1 é causada pela liberação da energia dos núcleos em suas<br />
vizinhanças. Com a energia liberada, os núcleos recuperam a sua magnetização longitudinal.<br />
A razão de recuperação é um processo exponencial. T1 é o tempo necessário para a<br />
recuperação de 63% da magnetização longitudinal do tecido (Figura 10A). O declínio T2 é<br />
causado pela troca de energia entre os núcleos vizinhos, devido à interação dos campos<br />
magnéticos dos núcleos entre si. É também denominada relaxamento spin-spin e acarreta o<br />
declínio da magnetização no plano transverso, cuja razão também é um processo exponencial.<br />
22
T2 é o tempo necessário para a perda de 63% da magnetização transversa (Figura 10B)<br />
(WESTBROOK e KAUT, 2000).<br />
Resumindo, o tecido adiposo tem um tempo T1 e T2 curtos e a água tem tempos T1<br />
e T2 longos. Para se obter imagens com sinais intensos, deve haver um grande componente de<br />
magnetização transversal, para que este possa induzir um forte sinal na bobina receptora. Um<br />
componente de magnetização transversal pequeno produz um sinal fraco na bobina receptora;<br />
as imagens ponderadas em T1 apresentam tecido adiposo hiperintenso (brilhante) e a água<br />
hipointensa (escura); as imagens ponderadas em T2 mostram tecido adiposo hipointenso<br />
(escuro) e a água hiperintensa (brilhante). Os tecidos de sinais intermediários devem ficar<br />
com T1 ou T2 entre os sinais do tecido adiposo e da água. Uma imagem ponderada em T1<br />
(Figura 11) é aquela em que o contraste depende predominantemente das diferenças entre os<br />
tempos T1 do tecido gorduroso e da água, enquanto que uma imagem ponderada em T2<br />
(Figura 12) é aquela em que o contraste depende predominantemente das diferenças entre os<br />
tempos T2 do tecido adiposo e da água (WESTBROOK e KAUT, 2000).<br />
Figura 11: Corte axial do abdômen ao nível hepático, de sequência ponderada em T1 (cortesia<br />
de DIX, Diagnóstico por Imagem, Santa Maria - RS).<br />
Figura 12: Corte axial do abdômen ao nível hepático, de sequência ponderada em T2 (cortesia<br />
de DIX, Diagnóstico por Imagem, Santa Maria - RS).<br />
23
2.3.3 Localização espacial e recepção do sinal de RF<br />
A localização espacial de um elemento de volume da imagem de RM é feita por meio<br />
de gradientes de campo magnético aplicados por bobinas localizadas nos três eixos<br />
cartesianos, em composição com o campo magnético principal. Há três deles no scanner,<br />
chamados de magnetos de gradiente X, Y e Z (Figura 13), cada um orientado ao longo de um<br />
plano diferente. Estes magnetos são bem menos potentes do que o magneto principal, mas são<br />
responsáveis pela precisão das imagens da região anatômica estudada, que são geradas em<br />
cortes. Eles modificam o campo magnético em pontos muito específicos e trabalham em<br />
conjunto com os pulsos de RF, produzindo as imagens através da codificação da distribuição<br />
espacial dos prótons da água. Os planos de corte, de acordo com o magneto gradiente que<br />
estiver ativado, poderão ser axiais (transversais ao corpo) coronais (que dividem o corpo em<br />
regiões anterior e posterior) ou sagitais (que dividem o corpo em regiões direita e esquerda).<br />
Também é possível, através da combinação entre os magnetos de gradiente, gerar as fatias de<br />
imagem em qualquer plano, o que é um dos pontos fortes da RM como ferramenta<br />
diagnóstica (HAAGA et al, 1996).<br />
Figura 13: Esquema representando a localização das bobinas de gradiente no interior do<br />
equipamento de RM (adaptado de http://www.magnet.fsu.edu/education/tutorials/ magneta<br />
cademy/mri/fullarticle.html).<br />
Na avaliação visual das imagens por RM, os sinais observados vão de muito intensos<br />
(branco) até a ausência de sinal (preto), passando por uma gama de sinais intermediários (tons<br />
de cinza). Estes sinais, de tonalidades que variam do branco ao preto, representam diferentes<br />
tipos de tecidos, por exemplo, tecido adiposo, músculo, tecido nervoso, etc. que possuem<br />
24
VME individuais. Um determinado tecido tem um sinal muito forte, caso possua um grande<br />
componente transverso de magnetização, capaz de gerar um grande sinal na bobina receptora.<br />
A detecção da magnetização nuclear é efetuada ao colocarmos no plano<br />
perpendicular a B0, chamado plano de medida, uma bobina de detecção ou antena. O<br />
movimento de rotação da magnetização transversal dá origem, na antena, a uma corrente<br />
elétrica induzida, que podemos medir após amplificação e que constitui o sinal da RM.<br />
Um tecido envia um sinal fraco à bobina receptora quando ele possui um<br />
componente transverso de magnetização de pequena amplitude. Já a densidade de spin de<br />
hidrogênio (H) é um parâmetro que descreve a quantidade relativa de hidrogênio detectável<br />
em cada elemento de volume. As densidades de spin de hidrogênio de fluidos, tais como<br />
líquido cefalorraquidiano e urina, são mais elevados, seguidos das densidades de spin de H<br />
nos tecidos moles, que são 60 a 90% daquela verificada nos fluidos. As densidades de spin de<br />
osso cortical e do ar são praticamente zero.<br />
Em geral, a região anatômica em estudo fica envolvida ou muito próxima de uma<br />
bobina de recepção (Figura 14), cujo papel principal é melhorar a captação do sinal de RF<br />
emitido pelos núcleos de hidrogênio (DOYON e CABANIS, 2000).<br />
A B<br />
Figura 14: Utilização de bobinas receptoras em exames de RM. A: Exame de RM de joelho,<br />
B: Exame de crânio (retirado de documentação publicitária de Philips Medical Systems)<br />
2.3.4 Sequências de pulso e tempos de repetição e de eco<br />
Um evento físico importante para a coleta do sinal que gera a imagem de RM é a<br />
formação de ecos. Este fenômeno é a base para as sequências de pulso. Se os prótons forem<br />
excitados com um pulso de RF inicial e, após um determinado tempo t, for enviado um<br />
25
segundo pulso, além do surgimento de sinal na bobina após o primeiro pulso, haverá o<br />
surgimento de um segundo sinal. Este segundo sinal é um eco do primeiro e aparece na<br />
bobina num tempo igual a 2 t. O surgimento do eco é um processo natural e ocorre devido a<br />
refasagem dos momentos magnéticos, induzida pelo segundo pulso de RF. O momento em<br />
que o eco irá surgir pode ser controlado através dos tempos e de aplicação dos pulsos, porém<br />
a defasagem e refasagem será dependente dos tipos de tecido em questão (MAZZOLA, 2009).<br />
A seqüência de pulso mais comumente usada em exames clínicos de RM é a de<br />
spin-eco. A seqüência spin-eco forma um sinal mensurável pela aplicação de um pulso de<br />
180º a meio caminho entre o pulso inicial de 90º e o centro de medição de sinal (o spin eco).<br />
Este pulso elmina os efeitos de não homogeneidade do campo magnético em cada voxel,<br />
tornando a defasagem transversal entre excitação e medição de sinal dependente apenas do<br />
declínio T2 (HENDRICK, 1994).<br />
Sendo o intervalo de tempo t entre a aplicação de dois pulsos irá determinar o<br />
surgimento do eco em 2 t. O tempo de eco (TE) é o intervalo de tempo entre a aplicação do<br />
pulso inicial de RF de 90º e o pico do eco. O tempo entre sucessivos pulsos de RF de 90º é<br />
chamado de TR, ou tempo de repetição. Enquanto o TE determina o quanto de relaxação no<br />
plano longitudinal estará presente no eco, o TR estabelece o quanto de magnetização longitu-<br />
dinal se recuperou entre sucessivos pulsos de 90º (MAZZOLA, 2009).<br />
Para coletar dados suficientes para formar uma imagem planar, a seqüência de pulso<br />
spin-eco deve ser repetida muitas vezes, cada uma com uma quantidade diferente de<br />
codificação de fase. O número mínimo de repetições é determinado pelo número de voxels<br />
distintos na direção desejada da codificação de fase. Uma característica a destacar é como a<br />
recuperação T1 afeta o sinal medido em spin-eco de imagem (HENDRICK, 1994).<br />
2.3.5 Fatores de segurança em RMN<br />
O uso de comutação rápida e gradientes elevados pode levar à estimulação de nervos<br />
periféricos (PNS) durante o escaneamento. A posição e a natureza do PNS difere para cada<br />
indivíduo e pode causar uma sensação de formigamento ou de contração superficial. O nível<br />
de PNS esperado é exibido como um dos parâmetros do protocolo de cada exame e é expresso<br />
como uma porcentagem do nível de limiar médio para a sua ocorrência, calculado pelo<br />
sistema para a seqüência preparada para o paciente (PHILIPS, 2007).<br />
Os procedimentos de RM sempre envolvem a emissão de energia de radiofreqüência<br />
(RF) e isso pode aquecer o paciente, o que implica em respeitar um nível seguro para a<br />
imposição da chamada taxa de absorção específica (SAR). SAR é a energia de RF absorvida<br />
26
pelo paciente por unidade de massa, expressa em watts por kg (W/kg). Recomenda-se usar<br />
níveis elevados de SAR (acima de 2,5 W/kg) somente se for absolutamente necessário. No<br />
painel do equipamento, é exibida uma porcentagem que se refere ao quanto do limiar para o<br />
início de sintomas de aquecimento do paciente para um determinado protocolo de<br />
escaneamento.<br />
2.4 USO DE AGENTES DE CONTRASTE EM RESSONÂNCIA MAGNÉTICA<br />
Assim como na radiologia convencional e na tomografia computadorizada, o método<br />
de imagem por RM utiliza, dependendo do estudo que estiver sendo realizado, um agente<br />
adicional de contrastação das estruturas anatômicas de interesse, administrado por via<br />
endovenosa. A grande diferença entre os meios de contraste utilizados em métodos de<br />
imagem que utilizam radiação ionizante (raios-x) e a IRM é que os primeiros possuem a<br />
função de aumentar a densidade física do sangue, enquanto que no segundo caso, o agente de<br />
contraste interfere na magnetização das moléculas localizadas em determinados tipos de<br />
tecido. O uso de agentes de contraste tem constituído uma parte importante da prática clínica<br />
estabelecida há mais de 20 anos (SEMELKA e HELMBERGER, 2001).<br />
2.4.1 Agentes de contraste paramagnéticos<br />
Os agentes de contraste para ressonância magnética atualmente em uso são os<br />
quelatos paramagnéticos (átomos de gadolínio quelatado). A interação localizada desses<br />
agentes com os prótons das moléculas de água potencializa o contraste da imagem, reduzindo<br />
os tempos de relaxação T1 ou T2. Em geral, estes agentes são substâncias que alteram as<br />
propriedades magnéticas de tecidos vizinhos, células ou moléculas. Os agentes exógenos de<br />
contraste mais usados são o gadolínio-dietileno ácido triamina pentaacetic e gadolínio-1,<br />
4,7,10 tetraazaciclododecano ácido 1,4,7,0 triacetic (Gd (DTPA) e Gd (DOTA),<br />
respectivamente). A utilidade do uso de agente de contraste exógeno está na necessidade de<br />
alcançar uma alta concentração na área de interesse, mantendo a concentração mais baixa<br />
possível, em áreas não relacionadas. Os ligantes coordenados com o íon paramagnético reduz<br />
sua toxicidade e aumenta a sua meia-vida no sangue, aumentando significativamente o<br />
contraste. A conjugação destes ligantes de baixo peso molecular de polímeros biocompatíveis,<br />
tais como poliamidas, polissacarídeos e albuminas geralmente melhoram as suas<br />
características biofísicas e farmacológicas (KIM et al, 2007).<br />
O gadolínio (Gd-DTPA) é considerado um agente paramagnético e diminui o tempo<br />
de relaxamento T1 e T2. Em geral, o Gd-DTPA acelera a velocidade com que os prótons da<br />
27
água se alinham ao campo magnético principal. Isso resulta em um maior sinal de RM e maior<br />
contraste, principalmente em áreas onde o gadolínio atravessa a barreira hematoencefálica<br />
(BHC). O agente de contraste permanece confinado ao meio intravascular por um período de<br />
tempo, exceto se a BHC tiver sido lesada por processos patológicos. O Gd-DTPA geralmente<br />
é usado com seqüências de pulso ponderadas em T1 (HAAGA, 1996). Normalmente o meio<br />
de contraste paramagnético é administrado por via intravenosa, freqüentemente em ―bolus‖ e<br />
seguido ou não por injeção de solução salina. A dose administrada varia entre 0,1 mmol/kg e<br />
0,2 mmol/kg (LEOPOLDINO et al, 2005)<br />
O gadolínio tem comportamento farmacológico semelhante ao meio de contraste<br />
iodado, utilizado em tomografia, ou seja, atua como um agente extracelular, difundindo-se<br />
rapidamente do compartimento intravascular para o espaço intersticial. Cerca de 80% da dose<br />
deixa o compartimento vascular nos cinco primeiros minutos após a injeção. Por esse motivo,<br />
a aquisição das imagens de RM contrastada deve ser rápida, quando o objetivo do estudo é<br />
vascular. O gadolínio não entra nas células nem é metabolizado pelo organismo, sendo<br />
excretado por filtração glomerular, com meia-vida biológica de aproximadamente 90 minutos<br />
(CALDANA et al, 2004).<br />
2.4.2 Agentes de contraste superparamagnéticos<br />
NPSPMs são tipicamente mais eficazes ao diminuir o tempo de relaxamento T2 e<br />
não T1. Esta técnica pode oferecer uma resolução espacial de 10-100 μm, sem limitações de<br />
imagens de profundidade (FRULLANO e MEADE, 2007).<br />
Os agentes de contraste constituídos de partículas de óxido de ferro são<br />
seletivamente absorvidos pelas células sistema retículo-endotelial (SRE) no fígado, baço e<br />
medula óssea e resulta em perda de sinal em sequências de imagem T2, devido aos efeitos de<br />
susceptibilidade do ferro. Esta classe de agente de contraste é também denominado óxido de<br />
ferro superparamagnético. Lesões que contêm um número insignificante de células do SRE<br />
permanecem em grande parte sem ser afetadas pelo agente, enquanto o fígado normal<br />
apresenta baixo sinal em T2. Isto proporciona um aumento da detecção de lesões, em<br />
comparação com imagens sem o uso do agente (SEMELKA e HELMBERGER, 2001).<br />
O estudo de NPMs para uso em ambiente clínico é estudado há um longo tempo. O<br />
produto Feridex, produzido pela empresa Bayer HealthCare Pharmaceuticals Inc., que é<br />
constituído de NPMs de primeira geração, foi aprovado pelo FDA para a detecção de doenças<br />
de fígado em 1993. Estudos relatam ter usado estas NPMs com diâmetro entre 100 e 250 nm,<br />
para detecção de doenças hepáticas (TANIMOTO, MUKAI e KURIBAYASHI, 2006).<br />
28
Uma nova geração de NPMs oferece vantagens significativamente maiores do que<br />
seus antecessores, como o fato delas possuirem revestimentos de polímero complexo e<br />
permanecerem monodispersas em solução. Além disso, elas possuem uma meia-vida longa na<br />
corrente sanguínea, distribuição de tamanho uniforme, de 30 a 50 nm e maior relaxatividade<br />
(OGHABIAN e FARAHBAKHSH, 2010).<br />
Segundo a empresa Bayer HealthCare Pharmaceuticals Inc, que produz o agente de<br />
contraste Feridex, estudos de imagem em ratos mostraram uma importante redução da<br />
intensidade do sinal de RM do fígado, nas primeiras 24 horas após a administração, seguido<br />
por um retorno gradual ao normal ao longo de 7 dias. Estes estudos também mostraram que o<br />
ferro contido no fluido tornou-se parte do ferro contido no organismo. Estudos histológicos<br />
nos ratos mostraram que o ferro estava no SRE, tendo desaparecido entre 7 a 14 dias. Em<br />
estudos clínicos humanos, não houve diferença na perda de intensidade de sinal em imagens<br />
obtidas entre 0 e 3,5 horas após a infusão. O retorno do sinal de intensidade normal ocorreu<br />
entre 1 e 2 dias (BAYER, 2007). Na Tabela 2 estão apresentados alguns exemplos de agentes<br />
de contraste, relacionando a sua situação de uso comercial e o respectivo tamanho das NPMs.<br />
Tabela 2: Agentes de contraste baseados em NPMs, disponíveis no mercado americano ou em<br />
fase de estudo (adaptado de OGHABIAN e FARAHBAKHSH, 2010).<br />
Nome Situação Tamanho da partícula<br />
Lumirem, Gastromark, Ferumoxsil Aprovado > 300 nm<br />
Feridex, Endoren, Ferumoxide Aprovado 80 – 150 nm<br />
Resovist (Ferrixan) Fase III 62 nm<br />
Sinerem, Combidex, Ferumoxtran Fase III 20 – 40 nm<br />
Clariscan Descontinuado na fase II 20 nm<br />
Outro agente de contraste, o Resovist, foi concebido para ser utilizado para a<br />
detecção de lesões focais em imagens de ressonância magnética. Este composto possui núcleo<br />
de ferro, com uma concentração de 0,5 mmol/ml. O diâmetro hidrodinâmico das partículas<br />
revestidas, estão na faixa entre 45 e 60 nm. Os ingredientes ativos são partículas de óxido de<br />
ferro superparamagnéticas, revestidas com carboxidextrana. Um estudo feito na Alemanha<br />
comparou a eficiência de internalização celular do Resovist com outras NPMs, combinados<br />
com diferentes revestimentos (SCHLORF et al, 2011). Este agente de contraste apresentou<br />
forte absorção, comparado aos demais produtos estudados.<br />
29
3 METODOLOGIA<br />
A execução das etapas experimentais do trabalho envolveu o uso de cobaias, que<br />
foram anestesiadas e submetidas a imageamento em um equipamento de ressonância<br />
magnética, antes e após a injeção venosa de diferentes doses de NPMs. As imagens obtidas<br />
foram analisadas com o objetivo de avaliar o nível de contrastação para cada dose.<br />
As cobaias utilizadas foram ratos machos adultos, da linhagem Wistar, com peso<br />
variando de 350 a 500g, obtidos no biotério do curso de medicina veterinária da Universidade<br />
Federal de Santa Maria. Os animais foram mantidos em uma sala separada, em ciclo de<br />
claro/escuro de 12 h, a uma temperatura ambiente de 22(±2) ºC, umidade relativa do ar entre<br />
30 e 50%, com livre acesso a comida e água. Estes animais foram usados de acordo com a lei<br />
no 11.794, de 8 de outubro de 2008, que regulamenta o inciso vii do § 1o do art. 225 da<br />
constituição federal, estabelecendo procedimentos para o uso científico de animais (BRASIL,<br />
2008).<br />
Foram utilizadas, como agente de contraste de imagem, NPMs, obtidas junto<br />
Laboratório de Nanotecnologia Farmacêutica e Sistemas de Liberação de Fármacos<br />
da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Goiás (ANEXO C). Estas NPMs<br />
possuem núcleo de magnetita (Fe3O4) e foram divididas em dois lotes. Um dos lotes possui<br />
revestimento de dextrana, cujo diâmetro médio, medido no Laboratório do Centro<br />
Universitário Franciscano, é de 76,1 nm. O outro lote possui revestimento de dupla camada de<br />
ácido oléico e um diâmetro polimodal de 48 nm (40,7%), 98,2 nm (34,8%) e 607,7 nm<br />
(24,5%) (Anexo A). A concentração de ferro no fluido magnético foi medida no laboratório<br />
de química da Universidade Federal de Santa Maria, através da técnica de espectrometria de<br />
emissão óptica com plasma indutivamente acoplado (ICP OES, Spectro Ciros CCD, Spectro<br />
Analytical Instruments), utilizando a linha 259,941 nm. A concentração medida de magnetita<br />
da amostra revestida com dextrana foi de 9,02 g/L, enquanto que para a amostra revestida<br />
com ácido oléico, a concentração medida foi de 9,03g/L (Anexo B).<br />
O equipamento de ressonância magnética utilizado, cedido pelo serviço de<br />
radiodiagnóstico do Hospital de Caridade Dr. Astrogildo de Azevedo, Santa Maria, marca<br />
Philips, modelo Achieva, com campo de 1,5 T (Tesla), versão 2.5. A bobina receptora de<br />
sinais utilizada para o estudo é uma Sense wrist 4, normalmente utilizada para realização de<br />
exames de punho de seres humanos.<br />
Numa primeira etapa, executou-se seqüências de imagens experimentais de<br />
ressonância magnética de um rato, para fins de ajuste dos parâmetros técnicos do<br />
equipamento, objetivando a otimização destas imagens. O rato foi anestesiado com uma<br />
30
solução composta por 1mL de cloridrato de cetamina a 10% e 1 mL de cloridrato de xilazina a<br />
2%, diluídos em 8 mL de solução fisiológica. A dose aplicada foi de 5,3 mL da solução por<br />
quilograma, por via intraperitoneal. Após várias séries de imagens adquiridas, foram<br />
otimizadas as sequências em T1 TSE e T2 TSE. Foi estudada a região do abdômen, com<br />
interesse especial para fígado e baço. Para cada protocolo, as imagens foram adquiridas nos<br />
planos de corte axial e coronal.<br />
A etapa seguinte envolveu a administração das NPMs nos ratos, por via endovenosa<br />
intracaudal, e submissão dos mesmos à aquisição das respectivas imagens. Para isso os ratos<br />
foram divididos em 6 grupos, sendo cada grupo composto por de 3 animais. Desta forma,<br />
doses de 0,46 mg/Kg, 0,92 mg/Kg e 1,82 mg/Kg de NPMs revestidas com dextrana foram<br />
administradas em cada grupo de 3 ratos. Essas doses corresponderam a 0,05; 0,1 e 0,2 mL/Kg<br />
respectivamente.<br />
Considerando que a contrastação dos órgãos foi menor quando as NPMs revestidas<br />
com acido oléico, as doses para este lote foram maiores: 1,82 mg/Kg, 3,6 mg/Kg e 7,2<br />
mg/Kg. O número total de ratos utilizados nos experimentos válidos foram de 18 animais.<br />
Para cada rato foram realizadas as seqüências de imagens já descritas, antes e após<br />
10, 20, 30 e 40 minutos após a administração das NPMs. Os principais parâmetros de<br />
protocolo de imagem para as aquisições axiais, ajustados para o objetivo do estudo, são<br />
apresentados na Tabela 3.<br />
Tabela 3: Parâmetros de aquisição e reconstrução das sequências de imagens<br />
Parâmetro Sequência T1 TSE Sequência T2 TSE<br />
Tempo de scan 6:06 min 06:59<br />
Matriz de resolução 236x190 232x189<br />
Campo de visão 70 mm 70 mm<br />
Voxel de reconstrução 0,16/0,16/2 mm 0,2/0,2/2 mm<br />
Tempo de eco (TE) 22 ms 80ms<br />
Tempo de repetição (TR) 473 ms 1.871 ms<br />
Porcentagem de scan 80,7% 81,5%<br />
Espessura de corte 2 mm 2 mm<br />
SAR 1,6W/Kg 3W/Kg<br />
PNS 59% 52%<br />
31
A etapa seguinte do trabalho envolveu a análise das imagens, com a participação de<br />
um médico radiologista com larga experiência em imagem por ressonância magnética,<br />
verificando-se principalmente o grau de contrastação dos órgãos, especialmente fígado e baço.<br />
Nesta etapa, utilizou-se o programa de visualização de imagens médicas Clear Canvas<br />
Workstation, versão 2.0, de propriedade de Clearcanvas Inc. Toronto, Canadá.<br />
32
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES<br />
Apresentamos aqui os resultados obtidos através da análise comparativa das<br />
seqüências de imagens adquiridas antes e após a administração de diferentes doses de NPMs<br />
nos dois grupos de ratos: o que recebeu NPMs revestidas com dextrana e outro, que recebeu<br />
NPMs revestidas com ácido oléico.<br />
Buscou-se eleger a seqüência que resultasse num grau de perda de sinal<br />
(escurecimento) adequado à detecção de eventuais focos patológicos. Esta forma de análise<br />
baseia-se no fato de que lesões tumorais são desprovidas de células fagocitárias, o que<br />
siginifica que os tumores não são afetados pelas NPMs e portanto ficariam evidenciados em<br />
relação ao parênquima sadio do fígado e baço.<br />
4.1 ADMINISTRAÇÃO DE NPMs REVESTIDAS COM DEXTRANA<br />
Para a realização de imagens em seqüências T1 TSE, não houve qualquer diferença<br />
na contrastação hepática na aquisição após a injeção de NPMs em relação a seqüência sem a<br />
injeção. Isto pode ser constatado nas imagens comparativas mostradas na Figura 15. Este<br />
resultado não mudou para nenhuma das concentrações de NPMs injetadas. Isto demonstra que<br />
as NPMs não alteraram o tempo de relaxação em T1.<br />
Figura 15: Imagens axiais comparativas, de sequência T1 TSE, ao nível do fígado, antes (A) e<br />
10 min pós injeção de 1,82 mg/Kg de NPMs (B).<br />
As imagens obtidas 10 minutos após a injeção de 1,82 mg/Kg de NPMs<br />
apresentaram acentuado hipossinal em sequência T2 TSE para fígado e baço (Figura 16).<br />
Aparentemente esta dosagem foi excessiva, considerando que o parênquima hepático<br />
praticamente desapareceu. Também verificou-se que os tecidos da parede abdominal,<br />
constituídos basicamente por músculos e gordura, também apresentaram hipointensidade<br />
33
Figura 16: Imagens axiais comparativas, ao nível do fígado, antes (A) e 10 min pós injeção<br />
de 1,82 mg/Kg de NPMs (B). O fígado (seta maior), o músculo (seta menor) e a gordura<br />
(seta pontilhada) apresentaram hipossinal evidenciado na imagem B.<br />
O acentuado efeito de hipossinal para essa dose, também em seqüência T2 TSE,<br />
novamente fica evidente nas imagens obtidas no plano coronal. Pode-se comparar, na Figura<br />
17, que o fígado (setas maiores) e o baço (setas menores) sofreram drástica redução de sinal.<br />
Figura 17: Imagens em seqüência T2 TSE no plano coronal, antes (A) e após 10 min após a<br />
injeção de 1,82 mg/Kg de NPMs (B).<br />
Com a injeção de uma dose de 0,92 mg/Kg, parece ter havido um efeito moderado,<br />
ou seja, hipossinal controlado em fígado e baço, sem saturação. Nas imagens mostradas na<br />
Figura 18, de cortes axiais adquiridos em seqüência T2, observa-se que o fígado apresentou<br />
hipossinal na imagem B em relação à imagem de pré-injeção, mostrada em A.<br />
34
Figura 18: Imagens axiais comparativas em seqüência T2, ao nível do fígado, antes (A) e 10<br />
min pós injeção de 0,92 mg/Kg de NPMs (B).<br />
O efeito de hipossinal para a dose de 0,92 mg/Kg também ocorreu no baço, conforme<br />
pode ser observado na imagem B da Figura 19. Este resultado também era esperado, uma vez<br />
que, assim como o fígado, o baço possui células do sistema de defesa que endocitam as<br />
NPMs.<br />
Figura 19: Imagens axiais comparativas, do mesmo experimento, ao nível do baço (setas).<br />
As seqüências de imagens executadas tardiamente à injeção das NPMs demons-<br />
traram que a meia vida biológica do fluido é longa. Na Figura 20 estão apresentadas as<br />
imagens adquiridas com 20 minutos (imagem A) e 40 minutos (imagem B) após a injeção das<br />
NPMs. Observa-se que praticamente não há variação da aparência do parênquima hepático se<br />
comparadas as seqüências adquiridas nos três tempos pós-injeção (10, 20 e 40 minutos).<br />
35
Figura 20:. Imagens axiais comparativas, ao nível do fígado. A: 20 min após a injeção de<br />
0,92 mg/Kg de NPMs e B: 40 min após a injeção.<br />
Para a dose de 0,46 mg/Kg, o tecido hepático apresentou regiões com moderado<br />
hipossinal em seqüência T2 TSE, executada 10 minutos após a injeção das NPMs,<br />
permanecendo outras regiões sem esse efeito, como pode ser visto na Figura 21. Esta<br />
característica manteve-se nas seqüências tardias de 20, 30 e 40 minutos.<br />
Figura 21:. Imagens axiais comparativas, ao nível do fígado. A: Sem agente de contraste e B:<br />
10 min após a injeção de 0,46 mg/Kg de NPMs .<br />
As ponderações sobre o aspecto e o grau de contrastação das imagens foi endossado<br />
pelo médico radiologista. Os resultados encontrados são indicativos de que o efeito esperado<br />
das NPMs no sistema fagocitário ocorreu.<br />
O fato de ter havido efeito de hipossinal também em músculos e gordura da parede<br />
abdominal ainda deve ser investigado, já que esse efeito ocorre basicamente pela endocitose<br />
das NPMs pelas células de defesa.<br />
36
4.1 ADMINISTRAÇÃO DE NPMs REVESTIDAS COM ÁCIDO OLÉICO<br />
Nas Figuras 22 a 24 estão apresentadas as imagens de seqüências obtidas antes e<br />
após a injeção de 1,82 mg/Kg de NPM revestidas com ácido oléico. Percebe-se que houve<br />
perda de sinal no fígado, após a injeção. Como a perda de sinal não muito acentuada, algumas<br />
estruturas vasculares ainda podem ser identificadas. Entretanto, o baço parece não ter sofrido<br />
o mesmo efeito, ou seja, não apresentou diferença de sinal em relação à seqüência de controle<br />
para essa dosagem.<br />
Figura 22:. Imagens axiais comparativas em T2, ao nível do fígado. A: sem agente de<br />
contraste e B: 10 min após a injeção de 1,82 mg/Kg de NPMs .<br />
Figura 23. Imagens axiais comparativas em T2, ao nível do baço (setas). A: sem agente de<br />
contraste e B: 10 min após a injeção de 1,82 mg/Kg de NPMs .<br />
37
Figura 24. Imagens comparativas em T2, no plano coronal. As setas cheias marcam a<br />
imagem do fígado e as setas pontilhadas, a imagem do baço. A: sem agente de contraste e B:<br />
10 min após a injeção de 1,82 mg/Kg de NPMs .<br />
O efeito de perda de sinal do fígado ficou mais acentuado para a dose de 3,6 mg/Kg,<br />
conforme mostrado na Figura 25. Já o baço apresentou efeito moderado de perda de sinal,<br />
nitidamente de forma menos intensa que o tecido hepático (Figura 26).<br />
Figura 25. Imagens axiais comparativas em T2, ao nível do fígado. A: sem agente de<br />
contraste e B: 10 min após a injeção de 3,6 mg/Kg de NPMs .<br />
Todas as imagens comparativas estão com as janelas de visualização (nível de brilho<br />
e contraste) semelhantes, de forma a não haver comprometimento da análise em decorrência<br />
deste fator.<br />
38
Figura 26. Imagens axiais comparativas em T2, ao nível do baço (setas). A: sem agente de<br />
contraste e B: 10 min após a injeção de 3,6 mg/Kg de NPMs .<br />
Para a aquisição de imagens em seqüência T1, a dose de 3,6 mg/Kg apresentou o<br />
efeito de realce negativo do fígado (Figura 27). Entretanto, o baço foi apenas levemente<br />
realçado (Figura 28).<br />
Figura 27. Imagens axiais comparativas em T1, ao nível do fígado (setas). A: sem agente de<br />
contraste e B: 10 min após a injeção de 3,6 mg/Kg de NPMs.<br />
Figura 28. Imagens axiais comparativas em T1, ao nível do baço (setas). A: Sem agente de<br />
contraste e B: 10 min após a injeção de 3,6 mg/Kg de NPMs.<br />
39
Para a dose de 7,2 mg/Kg, o efeito de perda de sinal tanto hepático quanto esplênico<br />
foram acentuados. O parênquima destes órgãos praticamente desaparece, conforme verificado<br />
nas Figuras 29 (fígado) e 30 (baço).<br />
Figura 29. Imagens axiais comparativas em T2, ao nível do fígado. A: Sem agente de<br />
contraste e B: 10 min após a injeção de 7,2 mg/Kg de NPMs.<br />
Figura 30. Imagens axiais comparativas em T2, ao nível do baço (setas). A: Sem agente de<br />
contraste e B: 10 min após a injeção de 7,2 mg/Kg de NPMs.<br />
Para a seqüência de imagens adquiridas em T1 TSE, a dose de 5,2 mg/Kg resultou<br />
também na contrastação de fígado e baço, embora de forma menos acentuada que na<br />
seqüência em T2 TSE. A Figura 31 mostra a comparação ao nível hepático para esta<br />
seqüência enquanto que o efeito sobre o baço está evidenciado na Figura 32.<br />
40
Figura 31. Imagens axiais comparativas em T1, ao nível do fígado. A: Sem agente de<br />
contraste e B: 10 min após a injeção de 7,2 mg/Kg de NPMs .<br />
Figura 32. Imagens axiais comparativas em T1, ao nível do baço (setas). A: Sem agente de<br />
contraste e B: 10 min após a injeção de 7,2 mg/Kg de NPMs.<br />
Conforme observado nas imagens obtidas, as NPMs revestidas com dextrana<br />
resultaram em efeitos de hipossinal nas imagens hepáticas e esplênicas com menor dose<br />
injetada, se estas imagens forem comparadas com o lote revestido com ácido oléico. Um dos<br />
parâmetros que podem ter influenciado nos resultados é que as NPs revestidas com dextrana<br />
são de natureza hidrofílica, enquanto que as NPs revestidas com ácido oléico são<br />
hidrofóbicas. Considerando também que várias características físico-químicas variaram entre<br />
os dois lotes, como PH, diâmetro médio e potencial zeta, é difícil determinar qual ou quais<br />
fatores foram determinantes para as diferenças verificadas.<br />
Os resultados da análise das imagens, realizada em conjunto com um médico<br />
radiologista, com grande experiência em ressonância magnética, está resumido nas Tabelas 4<br />
e 5, apresentadas a seguir.<br />
41
Tabela 4: Níveis de perda de sinal em fígado e baço em relação às doses injetadas de NPMs<br />
revestidas com dextrana<br />
Seqüência de<br />
Dose<br />
Fígado Baço<br />
Imagem<br />
0,46 mg/Kg<br />
0,92 mg/Kg<br />
1,82 mg/Kg<br />
T1 TSE desprezível desprezível<br />
T2 TSE moderado moderado<br />
T1 TSE moderado moderado<br />
T2 TSE acentuado fraco<br />
T1 TSE fraco fraco<br />
T2 TSE acentuado acentuado<br />
Tabela 5: Níveis de perda de sinal em fígado e baço em relação às doses injetadas de NPMs<br />
revestidas com ácido oléico<br />
Dose Seqüência de Imagem Fígado Baço<br />
1,82 mg/Kg<br />
3,6 mg/Kg<br />
7,2 mg/Kg<br />
T1 TSE fraco desprezível<br />
T2 TSE moderado fraco<br />
T1 TSE acentuado fraco<br />
T2 TSE acentuado moderado<br />
T1 TSE acentuado fraco<br />
T2 TSE acentuado acentuado<br />
Não houve uma eleição sobre qual o melhor nível diagnóstico de hipossinal, tendo<br />
em vista que o presente trabalho não envolveu a aplicação de NPMs em animais com lesões a<br />
serem diagnosticadas. Entretanto, as imagens que apresentaram um padrão entre moderado e<br />
acentuado de perda de sinal certamente possuem melhores condições de evidenciá-las.<br />
Em face aos efeitos observados, com evidente eficácia da aplicação de NPMs como<br />
agente de contraste em imagens de ressonância magnética, fica claro que há espaço para que<br />
outros trabalhos possam complementar os resultados deste, explorando aspectos que não<br />
tenham sido contemplados.<br />
42
5 CONCLUSÕES<br />
No decorrer deste trabalho foram avaliados, através de imageamento por ressonância<br />
magnética, os efeitos de perda de sinal de radiofreqüência das imagens dos órgãos do sistema<br />
fagocitário de ratos, após a injeção de NPMs, comparativamente com as imagens obtidas<br />
antes da injeção.<br />
Fígado e baço apresentaram evidente efeito de contraste negativo (hipossinal),<br />
principalmente em sequências T2 TSE, após a administração endovenosa de NPMs. Este<br />
resultado implica que, em havendo lesões tumorais nesses órgãos, estas, por estarem<br />
desprovidas de células fagocitárias, tornar-se-ão mais visíveis nas imagens de ressonância<br />
magnética, facilitando a sua localização e, portanto, o diagnóstico.<br />
Como o lote de NPMs revestido com dextrana apresentou melhor eficiência, ou seja,<br />
produziu o efeito desejado com menor dose injetada, esta opção de revestimento mostra-se<br />
mais favorável às aplicações em imagenologia ou, com as devidas funcionalizações, pode<br />
servir a propósitos terapêuticos, carreando fármacos para os órgãos-alvo citados.<br />
Portanto, ao comprovar a eficácia da aplicação diagnóstica de NPMs, sintetizadas e<br />
caracterizadas em laboratórios nacionais, o presente trabalho evidencia o potencial que as<br />
instituições brasileiras possuem de produzir soluções que hoje são do domínio apenas de<br />
grandes laboratórios de empresas estrangeiras.<br />
Os estudos toxicológicos e a administração das NPMs em ratos após a indução e<br />
tumores hepáticos é um caminho natural a seguir em trabalhos futuros. Se tais estudos<br />
apontarem que as NPMs do tipo que foram utilizadas neste trabalho possam ser aplicadas<br />
também em seres humanos, a criação de um produto comercial poderia ser vislumbrada.<br />
43
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46
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47
ANEXO A<br />
Caracterizações das NPMs efetuadas no laboratório de nanociências do<br />
Centro Universitário Franciscano –UNIFRA.<br />
PARTE 1: NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS REVESTIDAS COM DEXTRANA<br />
1.1. Potencial Zeta : -8,95 mV (Desvio padrão: 11 mV)<br />
Figura A.1: Gráfico dos valores de potencial zeta<br />
1.2. Índice de polidispersão (PDI): 0,27<br />
1.3. PH: 6,6<br />
1.4. O diâmetro médio, obtido após 3 medidas com 19 amostragens cada, foi de 76,12 nm<br />
48
PARTE 2: NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS REVESTIDAS COM ÁCIDO OLÉICO<br />
2.1. Potencial zeta: -23,7 mV, com desvio padrão de 15,5 mV<br />
1.5. Índice de polidispersão (PDI): 0,52<br />
1.6. PH: 8,9<br />
1.7. O diâmetro médio, obtido após 3 medidas com 19 amostragens cada, foi polimodal,<br />
apresentando 3 picos com medidas de 48,6 nm, 98,2 nm e 607,7 nm. Essas medidas<br />
corresponderam a 40,7%, 34,8% e 24,5%, respectivamente.<br />
Equipamentos utilizados:<br />
1) PHmetro, marca Digimed, modelo DM-22, fabricado por Digicron Analytical<br />
2) Zetasizer, modelo Nano 2S, fabricado por Malvern Instruments<br />
49
Magnetita com Dextrana:<br />
ANEXO B<br />
Caracterizações das NPMs efetuadas no laboratório de Química da<br />
Universidade Federal de Santa Maria.<br />
Fe = 6.537,4 mg L -1 ou 6,537 g L -1<br />
Magnetita com Ácido Oleico<br />
Fe = 6.461,4 mg L -1 ou 6,461 g L -1<br />
Praticamente a mesma concentração de ferro nos dois.<br />
PROCEDIMENTO:<br />
As amostras foram preparadas da seguinte forma: em tubo de polietileno (Sarsted, 15<br />
mL) foram adicionados 0,05 mL da amostra juntamente com 3 mL de HNO3 com<br />
concentração 5 mol L -1 (MERCK, bidestilado) e aquecido em forno de microondas (5 vezes<br />
de 10 segundos cada, com intervalo de 30 segundos para esfriar). Após as soluções foram<br />
aferidas a 5 mL com água purificada em sistema Milli-Q ® .<br />
A técnica utilizada para a determinação do ferro foi espectrometria de emissão óptica com<br />
plasma indutivamente acoplado (ICP OES, Spectro Ciros CCD, Spectro Analytical<br />
Instruments), utilizando a linha 259,941 nm. A operação do equipamento foi conforme<br />
instruções do fabricante.<br />
50
ANEXO C<br />
Caracterizações das NPMs efetuadas no laboratório de Química da<br />
Universidade Federal Goiás.<br />
- Difratograma de Raio X da PM do FMAO-AO ( antes do revestimento)<br />
Intensity<br />
250 (311)<br />
(Fe O )<br />
2 4<br />
200<br />
150<br />
100<br />
50<br />
0<br />
(220)<br />
(400)<br />
(422)<br />
(511) (440)<br />
20 30 40 50 60 70<br />
(2 ) Degree<br />
- Curva de magnetização do FMAO-AO (Amostras já revestidas feitas em triplicata)<br />
- Espectro de Infra vermelho do FMAO-AO<br />
51