RICARDO GENARI CARACTERÍSTICAS DE ... - SBI-Café - UFV

A constante Km foi determinada por meio da dosagem da atividade de PAL
da suspensão das células rompidas em concentrações finais de substrato, variando
de 0 até 2,0% (p/ v). As análises enzimáticas seguiram o método padrão de análise,
com alteração apenas na concentração do substrato nas misturas de reação. Os
valores de Km e da velocidade máxima de reação (Vmax) foram obtidos pela
utilização do programa SAS - Statistical, pela análise de regressão não-linear (SAS
INSTITUTE, INC., 1985), pelo método do duplo recíproco, com análise de
regressão linear (LEHNINGER et al., 1995) e também segundo o método de
CORNISH – BOWDEN e EISENTHAL, 1978, que elimina o erro do tipo Bias.
3.8.7. Análise do efeito de EDTA e de íons bivalentes na atividade de PAL
O efeito do ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) nas medidas de
atividade de PAL das células rompidas foi verificado pela sua adição na mistura de
reação e análise posterior das taxas de produtos formados. A cada tubo de ensaio
contendo uma mistura de reação, foram tomadas alíquotas de 0,5 mL a cada cinco
minutos, como rotineiramente realizado pelo método padrão de dosagem, até o
tempo de 14 min de reação, quando foi adicionado o EDTA a uma concentração de
20 mM. Essas alíquotas de 0,5 mL, necessárias para a dosagem dos produtos
formados, continuaram a ser tomadas até o tempo de 29 minutos, quando MgSO4 e
CaCl2 foram adicionados, separadamente, em concentração superior à do EDTA, de
40 mM, para análise do efeito de indução da atividade de PAL por dois diferentes
íons bivalentes. O ensaio enzimático foi realizado por um tempo total de 50
minutos de reação.
3.9. Fracionamento da pectina e indução de pectinases
A pectina cítrica Sigma foi submetida a fracionamento, por diferentes
métodos, e as frações obtidas foram utilizadas como única fonte de carbono, em
meio mineral, para o crescimento de Klebsiella oxytoca.
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