RICARDO GENARI CARACTERÍSTICAS DE ... - SBI-Café - UFV

As células resultantes do crescimento após 24 horas, a 25ºC em BOD
MA415 Marconi, sem agitação, em 1,0 L de meio MMP, contido em frascos
Erlenmeyer de 2,8 L, foram coletadas por centrifugação a 9.000 g por 10 min, a
25ºC, e ressuspendidas em 35 mL de tampão fosfato, contendo, em gramas por
litro: K2HPO4, 7; KH2PO4, 2 e MgSO4.7H2O, 1, pH 7,0. A suspensão de células foi
colocada no cilindro 40K FRENCH Pressure Cell Press, e submetida a uma
pressão de 8.619 kPa equivalente a 85 atm (pressão sobre as células de
137.895 kPa equivalente a 1.365 atm). Com a descompressão, foram obtidos os
lisados de células com mínima perda das enzimas, em banho de gelo
(STUTZENBERGER, 1987).
3.5. Ensaios Enzimáticos
As dosagens das pectinases, proteases e amilases foram realizadas no
sobrenadante da cultura, nas células íntegras e nas suspensões de células rompidas.
A atividade de pectina liase (PL) foi determinada pelo monitoramento do
aumento da absorvância a 235 nm, como descrito por ALBERSHEIM e KILLIAS
(1962) e por ALBERSHEIM (1966), em espectrofotômetro Hitachi modelo
U-1100. A mistura de reação foi constituída de 1,5 mL de pectina cítrica Sigma,
2,33% (p/v) em tampão K2HPO4/ Na2HPO4 80 mM, pH 6,8 e 0,5 mL da amostra
com a enzima, mantida à temperatura de análise. Alíquotas de 0,5 mL da mistura de
reação foram retiradas nos tempos 0 e 40 min de incubação e adicionadas em 4,5
mL de HCl 0,01 N, para interromper, assim, a reação. Uma unidade relativa de
atividade de PL (U) foi definida como micromoles de ∆ 4,5 galacturonídeo por
miligrama de proteína, por minuto, utilizada para o cálculo a absortividade molar
para o produto insaturado de 5.550 L/ cm ⋅ mol (ALBERSHEIM, 1966).
A atividade de pectato liase (PAL) foi determinada pelo monitoramento
espectrofotométrico da formação de produtos insaturados (p. i.), a partir de ácido
poligalacturônico (PGA), a 230 nm, em espectrofotômetro Hitachi modelo
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