RICARDO GENARI CARACTERÍSTICAS DE ... - SBI-Café - UFV

progressiva adição de 10 mL de tampão Tris/ HCl, pH 8,0, contendo 9% (p/v) de
sacarose e 22 mL de tampão Tris/ HCl 50 mM, pH 8,0, com sacarose 9% (p/v) e
MgCl2 15 mM. A solução do periplasma de aproximadamente 50 mL foi obtida
após a centrifugação a 9.000 g a 4ºC, por 10 min, para a sedimentação dos
esferoplastos.
3.4.2. Dosagem de nitrogênio total
A porcentagem de nitrogênio total da pectina Sigma (6,9% de umidade) foi
obtida, adotando-se o procedimento modificado do método de Kjeldahl
(BREMNER e MULVANEY, 1982). O ensaio foi realizado em triplicata. A pectina
(massas de 0,3669 g, 0,3453 g, 0,3501 g) foi colocada em um frasco de digestão
semimicro-Kjeldahl. Em seguida, foram adicionados 1,1 g de mistura digestora
(100 g de K2SO4, 10 g de CuSO4.5H2O, e 1 g de Se) e 5 mL de H2SO4 concentrado.
A digestão ocorreu durante duas horas, seguida da destilação e da titulação dos
cerca de 35 mL do destilado recolhido em frasco Erlenmeyer de
250 mL, contendo 5 mL de solução indicadora de ácido bórico. A concentração de
NH4 + foi determinada no destilado, pela titulação com HCl 0,02 N. O volume
branco foi obtido com a titulação de água destilada.
3.4.3. Dosagem de proteínas solúveis
As proteínas solúveis do sobrenadante da cultura, das células íntegras e das
células rompidas, foram determinadas pelo método proposto por BRADFORD
(1976), com a utilização de BSA (Albumina de Soro Bovino) como padrão e o kit
da BioRad.
3.4.4. Coleta e rompimento das células
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