RICARDO GENARI CARACTERÍSTICAS DE ... - SBI-Café - UFV

A coleta de amostras foi feita por sucção, usando-se agulha e seringa, após
breve agitação. As determinações de células viáveis foram feitas a cada três horas,
no decorrer de 30 horas, em triplicata. A avaliação do crescimento foi feita pela
contagem do número de colônias, em Placas de Petri, após a incubação a 25ºC por
24 horas. O inóculo utilizado foi obtido nas mesmas condições previamente
descritas.
3.3.8. Análise do crescimento em diferentes fontes de carbono
A K. oxytoca foi cultivada em meio mineral, acrescido de diferentes
substratos tais como caseína Sigma, polpa de celulose, amido Mallinckrodt (após
ultrafiltração por membrana de 100.000 Da), galacturonato Sigma, glicose Sigma,
pectina Sigma e poligalacturonato Sigma, nas concentrações finais de 0,3%
(p/ v). O estudo foi realizado com a utilização de 1,0 L de meio contido em frascos
Erlenmeyer de 2,8 L e a cultura incubada em BOD MA415 Marconi à temperatura
de 25ºC, sem agitação. Após o cultivo, por 24 horas, foi feita uma avaliação de suas
enzimas despolimerizantes detectadas, extra, ou intracelularmente, quando
existentes.
3.4. Métodos analíticos
3.4.1. Obtenção do periplasma
A separação do esferoplasto foi feita com a utilização do método descrito
por COOPER (1992). As células contidas em 1,0 L de cultura foram separadas por
centrifugação a 9.000 g, por 10 min, a 4ºC e ressuspendidas, a 0ºC, em
10 mL de tampão Tris/ HCl 50 mM, pH 8,0, contendo 20% (p/ v) de sacarose. A
seguir, 2,0 mL de solução de lisozima (10 mg/ mL) foram adicionados sob
agitação mínima e a suspensão foi incubada a 0ºC, por 10 min. Após a adição, com
agitação lenta, de 5,0 mL de EDTA 42 mM, pH 8,0, a suspensão foi diluída pela
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