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VOLTAR AO SUMÁRIO UTILIzAÇãO DA RegIãO eSPAÇADORA INTeRgÊNIcA 16S-23S RDNA PARA DeTecÇãO De mYCobACTerium TuberCulosis Natália Machado Nunes 1 , Mirela Verza 2 , Raquel Maschmann 3 , Alessandra Borchardt 4 , Rúbia Ruppenthal 5 , Maria Lucia Rosa Rossetti 6 . Introdução: Segundo a Organização Mundial de Saúde estima-se que ocorram nove milhões de novos casos de tuberculose (TB) anualmente no mundo, sendo que cerca de dois milhões destes resultam em mortes. Os métodos tradicionais de diagnóstico possuem limitações como baixa sensibilidade e detecção lenta do bacilo, e devido a isto novos métodos de diagnóstico, estão sendo propostos. Técnicas baseadas em biologia molecular têm sido uma alternativa para o auxílio no diagnóstico da TB devido a sua especificidade e rapidez. Objetivo: Padronizar um protocolo para detecção colorimétrica em microplacas para identificação de DNA que codifica a região espaçadora intergênica (ITS) 16S-23S rRNA do complexo M. tuberculosis (M. tb). Esta região é bastante estudada por ser muito conservada e estar presente como cópia única no genoma do complexo M. tb. Metodologia: Neste trabalho experimental, onze amostras de DNA foram analisadas de um total de 40. Estas são, provenientes de um banco de DNAs de cultura de M. tb do CDCT. Os DNAs foram amplificados através da PCR utilizando primers biotinilados Sp1 e Sp2 descrito por Xiong et al, 2006, originando um fragmento de 220 pb. Os produtos foram hibridizados em microplacas contendo uma sonda aminada, específica do complexo M. tb, complementar a região interna do 16S-23S rDNA, juntamente com um controle negativo (água) e um controle positivo (H37Rv). Para detecção dos produtos foi utilizado um conjugado estreptavidina-peroxidase e substrato TMB, que desenvolvem uma coloração azul quando a reação é positva. A intensidade da cor foi medida em espectrofotômetro (450nm). conclusão: Foram considerados positivos os valores de absorbância acima de 0,119, média obtida dos controles negativos. Das 11 amostras analisadas, 73% foram positivas, concordando com o resultado visualizado no gel de agarose e 27% foram negativas. Portanto, novos testes serão realizados para o aumento da sensibilidade da técnica, modificando parâmetros como: tempo e temperatura de hibridização, quantidade de material amplificado e concentração da sonda. Após a padronização, será determinada a sensibilidade e a especificidade analítica da técnica. Para análise estatística será utilizado o teste Qui-quadrado. Palavras-chave: Hibridização; Mycobacterium tuberculosis; região intergênica 16S-23S rRNA. Natália Machado Nunes- Aluna de Biomedicina do Centro Universitário Metodista IPA Mirela Verza- Centro de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico- CDCT/FEPPS Raquel Maschmann- Doutoranda do Centro de Biotecnologia da UFRGS Alessandra Borchardt- Aluna de Biomedicina da ULBRA Rúbia D. Ruppenthal – Docente do Centro Universitário Metodista IPA Maria Lucia Rosa Rossetti - Centro de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico- CDCT/FEPPS e docente da ULBRA II Congresso Internacional de Bioanálises V Congresso Sul-Brasileiro & IX Semana Gaúcha de Biomedicina Ano 2 | Volume 2 | Agosto de 2009 30
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