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VOLTAR AO SUMÁRIO<br />
UTILIzAÇãO DA RegIãO eSPAÇADORA INTeRgÊNIcA 16S-23S<br />
RDNA PARA DeTecÇãO De mYCobACTerium TuberCulosis<br />
Natália Machado Nunes 1 , Mirela Verza 2 , Raquel M<strong>as</strong>chmann 3 ,<br />
Alessandra Borchardt 4 , Rúbia Ruppenthal 5 , Maria Lucia Rosa Rossetti 6 .<br />
Introdução: Segundo a Organização Mundial de Saúde estima-se que ocorram nove milhões<br />
de novos c<strong>as</strong>os de tuberculose (TB) anualmente no mundo, sendo que cerca de dois milhões<br />
destes resultam em mortes. Os métodos tradicionais de diagnóstico possuem limitações como<br />
baixa sensibilidade e detecção lenta do bacilo, e devido a isto novos métodos de diagnóstico,<br />
estão sendo propostos. Técnic<strong>as</strong> b<strong>as</strong>ead<strong>as</strong> em biologia molecular têm sido uma alternativa para<br />
o auxílio no diagnóstico da TB devido a sua especificidade e rapidez. Objetivo: Padronizar um<br />
protocolo para detecção colorimétrica em microplac<strong>as</strong> para identificação de DNA que codifica<br />
a região espaçadora intergênica (ITS) 16S-23S rRNA do complexo M. tuberculosis (M. tb).<br />
Esta região é b<strong>as</strong>tante estudada por ser muito conservada e estar presente como cópia única<br />
no genoma do complexo M. tb. Metodologia: Neste trabalho experimental, onze amostr<strong>as</strong> de<br />
DNA foram analisad<strong>as</strong> de um total de 40. Est<strong>as</strong> são, provenientes de um banco de DNAs de<br />
cultura de M. tb do CDCT. Os DNAs foram amplificados através da PCR utilizando primers<br />
biotinilados Sp1 e Sp2 descrito por Xiong et al, 2006, originando um fragmento de 220 pb.<br />
Os produtos foram hibridizados em microplac<strong>as</strong> contendo uma sonda aminada, específica do<br />
complexo M. tb, complementar a região interna do 16S-23S rDNA, juntamente com um controle<br />
negativo (água) e um controle positivo (H37Rv). Para detecção dos produtos foi utilizado um<br />
conjugado estreptavidina-peroxid<strong>as</strong>e e substrato TMB, que desenvolvem uma coloração azul<br />
quando a reação é positva. A intensidade da cor foi medida em espectrofotômetro (450nm).<br />
conclusão: Foram considerados positivos os valores de absorbância acima de 0,119, média<br />
obtida dos controles negativos. D<strong>as</strong> 11 amostr<strong>as</strong> analisad<strong>as</strong>, 73% foram positiv<strong>as</strong>, concordando<br />
com o resultado visualizado no gel de agarose e 27% foram negativ<strong>as</strong>. Portanto, novos testes<br />
serão realizados para o aumento da sensibilidade da técnica, modificando parâmetros como:<br />
tempo e temperatura de hibridização, quantidade de material amplificado e concentração da<br />
sonda. Após a padronização, será determinada a sensibilidade e a especificidade analítica da<br />
técnica. Para análise estatística será utilizado o teste Qui-quadrado.<br />
Palavr<strong>as</strong>-chave: Hibridização; Mycobacterium tuberculosis; região intergênica 16S-23S<br />
rRNA.<br />
Natália Machado Nunes- Aluna de Biomedicina do Centro Universitário Metodista IPA<br />
Mirela Verza- Centro de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico- CDCT/FEPPS<br />
Raquel M<strong>as</strong>chmann- Doutoranda do Centro de Biotecnologia da UFRGS<br />
Alessandra Borchardt- Aluna de Biomedicina da ULBRA<br />
Rúbia D. Ruppenthal – Docente do Centro Universitário Metodista IPA<br />
Maria Lucia Rosa Rossetti - Centro de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico- CDCT/FEPPS e docente da ULBRA<br />
II Congresso Internacional de Bioanálises<br />
V Congresso Sul-Br<strong>as</strong>ileiro & IX Semana Gaúcha de Biomedicina<br />
Ano 2 | Volume 2 | Agosto de 2009<br />
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