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ENSAIO MOLECULAR DE HIBRIDIzAÇÃO EM MICROPLACAS
PARA DETECÇÃO E GENOTIPAGEM DO VÍRUS DA HEPATITE C (HCV).
Nicole Nascimento Da Fré 1,2 , Cintia Costi 3 , Tarciana Grandi 3,4 ,
Cláudia M. Dornelles da Silva 3,5 , Arnaldo Zaha 6 , e Maria Lucia da Rosa Rossetti 3,5
Introdução: O diagnóstico laboratorial do vírus da hepatite C (HCV) envolve uma etapa de
triagem, realizada através de análises sorológicas, e uma etapa confirmatória, baseada no emprego
de métodos moleculares qualitativos para a detecção do RNA viral. O teste molecular qualitativo
é utilizado para confirmação diagnóstica e tem sido considerado padrão-ouro por ser capaz de
discriminar pacientes com infecção crônica, daqueles com infecção resolvida. A genotipagem do
HCV é outro método importante utilizado para o manejo terapêutico do paciente. Apesar de alguns
testes comerciais estarem disponíveis no mercado, estes apresentam alto custo e não têm validação no
país. Objetivo: O presente estudo teve como objetivo, o desenvolvimento de um método molecular
colorimétrico de hibridização em microplacas para detecção qualitativa e genotipagem do HCV.
Metodologia: Este é um estudo experimental. A extração do RNA viral baseou-se no protocolo
descrito por Boom et al. (1990) com algumas modificações. A técnica de RT-PCR teve como alvo a
região 5’NCR do HCV e foi realizada utilizando o kit SuperScript TM One-Step RT-PCR com primers
biotinilados. Para a detecção qualitativa e genotipagem do HCV, os produtos de PCR biotinilados
foram hibridizados com sondas específicas, previamente fixadas em microplacas. Um conjugado
enzimático de estreptavidina-peroxidase foi utilizado juntamente com o substrato TMB. O resultado
positivo pode ser observado com a formação de cor, após hibridização do produto amplificado com
uma ou mais sondas, e quantificado em espectrofotômetro. Para avaliar a eficiência do método
colorimétrico de hibridização reversa (MCHR) proposto, os resultados foram comparados com os
métodos de referência para detecção qualitativa e genotipagem do HCV. Resultados: Das 85 amostras
de plasma analisadas, a sensibilidade e a especificidade do MCHR para detecção do RNA viral, quando
comparado com Cobas Amplicor HCV Assay v2.0, foram de 100% e de 97,2%, respectivamente. Para
genotipagem das amostras positivas, pôde-se observar 97,22% (35/36) de concordância entre o
MCHR e o sequenciamento de DNA. conclusão: O MCHR proposto apresentou bons resultados
de sensibilidade e de especificidade, com alto grau de concordância entre os métodos de referência,
evidenciando o seu potencial para ser utilizado no diagnóstico do HCV.
Palavras-chave: HCV; testes moleculares; hibridização colorimétrica.
1 Discente do Curso de Biomedicina – Centro Universitário Metodista IPA – Porto Alegre – RS – Brasil.
2 Bolsista de Iniciação Científica Centro de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – Fundação Estadual de Produção e
Pesquisa em Saúde – Porto Alegre – RS – Brasil.
3 Profissionais vinculados ao Centro de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – Fundação Estadual de Produção e Pesquisa
em Saúde – Porto Alegre – RS – Brasil.
4 Discente do Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular – Universidade Federal do Rio Grande do Sul –
Porto Alegre – RS – Brasil.
5 Docentes da Universidade Luterana do Brasil – Canoas – RS – Brasil.
6 Docente do Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular – Universidade Federal do Rio Grande do Sul –
Porto Alegre – RS – Brasil.
II Congresso Internacional de Bioanálises
V Congresso Sul-Brasileiro & IX Semana Gaúcha de Biomedicina
Ano 2 | Volume 2 | Agosto de 2009
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