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VOLTAR AO SUMÁRIO COMPARAÇÃO DE PRODUTOS COMERCIAIS PARA EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO RÁPIDA DE MATERIAL GENÔMICO DE VÍRUS Raquel Beiersdorf Frezza 1 , Joseane Vanessa dos Santos da Silva 2 , Juliana Comerlato 1 , Bianca Bergamaschi 1 , Manoela Tressoldi Rodrigues 1 , II Congresso Internacional de Bioanálises V Congresso Sul-Brasileiro & IX Semana Gaúcha de Biomedicina Ano 2 | Volume 2 | Agosto de 2009 Lucas Kessler de Oliveira 2 , Andréia Dalla Vecchia 3 , Gabriela Schalemberger 4 e Fernando Rosado Spilki 5 Introdução: Para a obtenção e purificação de ácidos nucléicos em qualidade e quantidade adequadas de vírus, diferentes protocolos e kits comerciais estão disponíveis. Tais produtos normalmente apresentam preço mais elevado que os protocolos convencionais; todavia, permitem uma extração menos trabalhosa e mais rápida, mais padronizada entre as amostras e normalmente mais eficiente no caso de vírus. Objetivo: Testar a eficácia de dois kits disponíveis no mercado. Metodologia: Neste estudo experimental, os testes foram realizados com amostras padrão de Adenovírus (DNA) e Enterovírus (RNA). O produto denominado A foi adquirido a um preço de 10 dólares por amostra, enquanto o kit B teve um custo de 18 dólares por amostra. O isolamento do material genético foi realizado seguindo-se as instruções dos fabricantes. Ambos têm como características comuns a simplicidade de realização, no entanto diferem entre eles a necessidade de manter os reagentes sob refrigeração, o tempo de incubação das amostras, as temperaturas de incubação. Acompanham o produto A, 7 reagentes. Alguns necessitam ser armazenados à temperatura de -20ºC. A amostra é misturada com um buffer em um tubo e mantida a 72ºC por 10 minutos. Em seguida, esta é transferida para um filtro e obtém-se o material genômico de interesse (DNA ou RNA) após 6 centrifugações, o que perfaz em média 50 minutos de trabalho. O kit B possui 4 reagentes e todos já vem prontos, não necessitando refrigeração. Um deles necessita pré-aquecimento da solução de eluição final a 80°C. As amostras são mantidas a 65ºC por 15 minutos e após a 95ºC por mais 10 minutos. A grande variação de temperaturas pode resultar em dificuldades e atraso no tempo de realização. Após, cada amostra é transferida para um filtro e são realizados procedimentos semelhantes ao kit A, sendo 5 centrifugações. Nesse kit o tempo de extração é de aproximadamente 90 minutos. Resultados: Ao final da análise, ambos os produtos mostraram igual eficácia para extração tanto de DNA quanto RNA, mesmo em quantidades iniciais da ordem de 1 dose infectante viral por 50 uL, quando os resultados foram analisados por PCR. conclusão: São variáveis entre os produtos o tempo de preparo de cada amostra e o custo de cada reação como variáveis relevantes, não sendo observáveis diferenças na eficácia dos mesmos. Palavras-chave: extração; produtos comerciais; custos. 1 Alunas do curso de Biomedicina – Centro Universitário Feevale 2 Aluna do curso de Enfermagem – Centro Universitário Feevale 3 Alunos do Programa de Pós-Graduação em Qualidade Ambiental – Centro Universitário Feevale 4 Bolsista Júnior – Aluna do Ensino Médio da Escola de Educação Básica Feevale - Escola de Aplicação 5 Docente do Instituto de Ciências da Saúde e do Programa de Pós-Graduação em Qualidade Ambiental – Centro Universitário Feevale 20
VOLTAR AO SUMÁRIO ENSAIO MOLECULAR DE HIBRIDIzAÇÃO EM MICROPLACAS PARA DETECÇÃO E GENOTIPAGEM DO VÍRUS DA HEPATITE C (HCV). Nicole Nascimento Da Fré 1,2 , Cintia Costi 3 , Tarciana Grandi 3,4 , Cláudia M. Dornelles da Silva 3,5 , Arnaldo Zaha 6 , e Maria Lucia da Rosa Rossetti 3,5 Introdução: O diagnóstico laboratorial do vírus da hepatite C (HCV) envolve uma etapa de triagem, realizada através de análises sorológicas, e uma etapa confirmatória, baseada no emprego de métodos moleculares qualitativos para a detecção do RNA viral. O teste molecular qualitativo é utilizado para confirmação diagnóstica e tem sido considerado padrão-ouro por ser capaz de discriminar pacientes com infecção crônica, daqueles com infecção resolvida. A genotipagem do HCV é outro método importante utilizado para o manejo terapêutico do paciente. Apesar de alguns testes comerciais estarem disponíveis no mercado, estes apresentam alto custo e não têm validação no país. Objetivo: O presente estudo teve como objetivo, o desenvolvimento de um método molecular colorimétrico de hibridização em microplacas para detecção qualitativa e genotipagem do HCV. Metodologia: Este é um estudo experimental. A extração do RNA viral baseou-se no protocolo descrito por Boom et al. (1990) com algumas modificações. A técnica de RT-PCR teve como alvo a região 5’NCR do HCV e foi realizada utilizando o kit SuperScript TM One-Step RT-PCR com primers biotinilados. Para a detecção qualitativa e genotipagem do HCV, os produtos de PCR biotinilados foram hibridizados com sondas específicas, previamente fixadas em microplacas. Um conjugado enzimático de estreptavidina-peroxidase foi utilizado juntamente com o substrato TMB. O resultado positivo pode ser observado com a formação de cor, após hibridização do produto amplificado com uma ou mais sondas, e quantificado em espectrofotômetro. Para avaliar a eficiência do método colorimétrico de hibridização reversa (MCHR) proposto, os resultados foram comparados com os métodos de referência para detecção qualitativa e genotipagem do HCV. Resultados: Das 85 amostras de plasma analisadas, a sensibilidade e a especificidade do MCHR para detecção do RNA viral, quando comparado com Cobas Amplicor HCV Assay v2.0, foram de 100% e de 97,2%, respectivamente. Para genotipagem das amostras positivas, pôde-se observar 97,22% (35/36) de concordância entre o MCHR e o sequenciamento de DNA. conclusão: O MCHR proposto apresentou bons resultados de sensibilidade e de especificidade, com alto grau de concordância entre os métodos de referência, evidenciando o seu potencial para ser utilizado no diagnóstico do HCV. Palavras-chave: HCV; testes moleculares; hibridização colorimétrica. 1 Discente do Curso de Biomedicina – Centro Universitário Metodista IPA – Porto Alegre – RS – Brasil. 2 Bolsista de Iniciação Científica Centro de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde – Porto Alegre – RS – Brasil. 3 Profissionais vinculados ao Centro de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde – Porto Alegre – RS – Brasil. 4 Discente do Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular – Universidade Federal do Rio Grande do Sul – Porto Alegre – RS – Brasil. 5 Docentes da Universidade Luterana do Brasil – Canoas – RS – Brasil. 6 Docente do Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular – Universidade Federal do Rio Grande do Sul – Porto Alegre – RS – Brasil. II Congresso Internacional de Bioanálises V Congresso Sul-Brasileiro & IX Semana Gaúcha de Biomedicina Ano 2 | Volume 2 | Agosto de 2009 21
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