Alergenos recombinantes: pontos fortes em 2006 - Portugal

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Na ITSL, a estratégia baseia-se na utilização de alergenos recombinantes numa conformação nativa, afim de facilitar o seu reconhecimento e a captura pelas células dendríticas do tipo Langerhans existentes na mucosa da boca. 8 DOSSIER CIENTiFICO ` termo “selvagem” é utilizado por oposição ao termo “hipoalergénico”, que caracteriza os alergenos modificados, por mutagénese dirigida ou alteração da estrutura tridimensional, afim de reduzir a sua capacidade de ligação às IgE. Teoricamente, as formas hipoalergénicas deveriam levar à produção de vacinas subcutâneas mais seguras, embora o seu interesse na imunoterapia sublingual (ITSL) se mantenha mal definido. De facto, a apresentação dos alergenos recombinantes na sua configuração natural parece preferível, na medida em que, por um lado, existem poucos mastócitos ao nível da mucosa sublingual e, por outro, o reconhecimento pelas IgE permite atingir as células dendríticas do tipo Langerhans FcεRI+, capazes de produzir TGF-ß e IL-10 [3]. Métodos de produção A partir de uma fonte de alergenos, o ARN mensageiro (ARNm) é isolado e utilizado como matriz para a síntese do ADN complementar (ADNc) (Figura 1). A etapa seguinte é a ampliação através da técnica da reacção da cadeia de polimerase PCR (polymerase chain reaction) do gene codificado para o alergeno identificado (lista disponível em www.allergome.org). O gene que interessa é depois inserido num vector adequado, geralmente um plasmídeo, afim de facilitar a sua expressão num organismo hospedeiro. Os diversos sistemas hospedeiros Os sistemas de expressão procariota, como as bactérias (Escherichia coli) produzem proteínas recombinantes, sem qualquer modificação pós-traducional. É assim possível obter, na maioria dos casos, alergenos cuja reactividade é comparável à da forma nativa, de um modo pouco dispendioso, simples e rápido. No entanto, quando é necessária uma determinada conformação espacial ou modificações pós-traducionais – como é o caso da glicosilação – pode ser utilizado um sistema de expressão eucariota, como as leveduras (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae), os Baculovirus de insectos, e diversas espécies vegetais, como o tabaco Nicotiana tabacum ou a cevada. Todavia, estes sistemas não induzem necessariamente uma glicosilação idêntica à da glicoproteína nativa. A escolha do sistema de expressão depende portanto da natureza da proteína a exprimir e da sua utilização posterior. Purificação No final do processo de fermentação e indução da expressão do gene, a proteína recombinante é purificada através da aplicação de métodos cromatográficos adequados. Os níveis de caracterização e standardização obtidos com os alergenos recombinantes serão, teoricamente, muito mais elevados do que aqueles que podem ser obtidos com extractos alergénicos: homologia, pureza, concentração alergénica, actividade e potenciais níveis de contaminação. Adjuvantes e galénicos As proteínas altamente purificadas ou recombinantes são pouco imunogénicas, razão porque é necessário um adjuvante para induzir a resposta imune adequada através de um co-sinal que é enviado às células imunes [1, 4]. Em latim, 'adjuvare' significa “ajudar”; assim, um adjuvante pode ser definido como qualquer molécula biológica ou sintética que contribui para modular a resposta imune, quando combinada com um antigene. O interesse dos adjuvantes O uso de adjuvantes tem diversos objectivos: - aumentar a eficácia da vacina; - permitir a redução das doses com manutenção da eficácia; - simplificar a administração. Qual o adjuvante a escolher? O papel das células T reguladoras e das citoquinas imunosupressoras (IL-10 e TGF-ß), como mediadoras da ITE e da resposta imune normal aos alergenos, está bem estabelecido [5]. É por isso que os adjuvantes capazes de induzir células dendríticas tolerogénicas e/ou linfócitos T reguladores poderiam ser bons candidatos [1, 4]. Os modelos humanos (cocultura de células dendríticas derivadas de monócitos e de linfócitos T) e os modelos animais (ratinhos Balb/C sensibilizados com albumina do ovo) foram preparados para a selecção de candidatos adjuvantes (Figura 2). Os resultados do nosso trabalho sugerem que a combinação de 1α,25-di-hidroxivitamina D3 e dexametasona ou bactérias lácticas, como a Lactobacillus plantarum, pode induzir uma forte produção de IL-10 pelas células T humanas e aumentar a eficácia da ITSL nos ratinhos sensibilizados, após a administração de albumina do ovo.
Formas galénicas As formas galénicas inovadoras, como comprimidos, biopelículas ou pós mucoadesivos podem também ser utilizadas para aumentar o tempo de contacto com a mucosa sublingual e tornar mais fácil atingir as células dendríticas locais [1, 4]. O nosso trabalho demonstrou que a forma mucoadesiva da albumina do ovo aumenta a eficácia da ITSL nos ratinhos sensibilizados com esta substância. Conclusão Dr. L. Van Overtvelt Antony (França) A produção de alergenos recombinantes abre o caminho ao desenvolvimento de testes de diagnóstico e a novas terapêuticas de dessensibilização. Os alergenos recombinantes estão já disponíveis in vitro para a realização de testes diagnósticos e são uma boa ajuda para os pacientes que necessitam de várias sensibilizações, ao mesmo tempo que permitem uma melhor identificação das alergias cruzadas e uma orientação mais correcta da ITE. Podem ainda ser utilizados futuramente para testes de diagnóstico in vivo: cutâneos e de provocação. Os tratamentos com base nos alergenos recombinantes irão certamente constituir um passo em frente no tratamento das doenças alérgicas nos anos mais próximos. 1- Moingeon P. Sublingual immunotherapy: from biological extracts to recombinant allergens. Allergy 2006; 61 (Suppl. 81): 15-9. 2- Pauli G, Mallin H, Rak S et al. Clinical efficacy of subcutaneous immunotherapy in birch pollen allergic patients: a randomized, double-blind, placebo-controlled study with recombinant Bet v 1 versus natural Bet v 1 or standardized birch extract. XXVe EAACI, Vienna, 10-14 junho 2006 [Abstract 83]. 3- Novak N. Targeting dendritic cells in allergen immunotherapy. Immunol Allergy Clin North Am 2006; 26: 307-19. 4- Mascarell L, Van Overtvelt L, Moingeon P. Novel ways for immune intervention in immunotherapy: Mucosal allergy vaccines. Immunol Allergy Clin North Am 2006; 26: 283- 306. 5- Moingeon P, Batard T, Fadel R, Frati F, Sieber J, Van Overtvelt L. Immune mechanisms of allergen-specific sublingual immunotherapy. Allergy 2006; 61: 151-65. Figura 1: Principais fases da produção de alergenos recombinantes Modelo humano in vitro iDC DC CD4+ + Th0 naif 24 h 7 días DC imaturo Adjuvantes Modelo de murino in vivo Sensibilização Fontes de alergenos Purificação de ARNm Transcrição reversa de ADNc Sonda = iniciador de oligo-nucleótido Amplificação do gene de interesse por PCR Vectores E. coli DC modulado Análise do fenotipo e da produção de citoquinas Inserção no vector (clonagem) Vectores de recombinante Transformação do hospedeiro Produção, selecção e purificação dos transformantes Proteína de interesse do recombinante IL-12R CD4+ Th1 ICOS CD4+ Treg Tbet IFN-γ GATA 3 IL-4 Foxp3 TGFβ IL-10 Análise de expressão de genes 0 14 2122232425 28 88 93 i.p. Aerosol Terapêutica sublingual Sacrifício OVA+Alum OVA 2 x semana durante 2 meses OVA +/- adjuvante ou formulação Dessensibilização P. pastoris Figure 2: Selecção de candidatos a adjuvantes CD4+ Th2 Análise da função respiratória, da resposta humoral e celular e da inflamação 9
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