efeitos da inibição do sistema renina-angiotensina-aldosterona e do ...

4.3.9 Análise dos anticorpos anti-receptores (antiβ1-ARAb) adrenérgico β1 e anti-
receptores muscarínicos M2 (antiM2RAb)
As amostras de soro foram obtidas por punção venosa convencional,
centrifugadas e estocadas a -80 o C até que os ensaios (ELISA) para antiβ1-ARAb e
antiM2RAb pudessem ser feitos. O método Elisa foi realizado pelo revestimento de placas
de microlitro (High binding, Corning Inc., Corning, NY, USA) com 2μg de peptídeo
sintético (Sigma-Genosys, The Woodlands, TX, USA) correspondente ao receptor de
acetilcolina M2 humano e12 (168V-R-T-V-E-D-G-E-C-Y-I-Q-F-F-S-N-A-A-V-T-F-G-T-A-
I192) ou ao receptor adrenérgico β1 humano (197H-W-W-R-A-E-S-D-E-A-R-R-C-Y-N-D-P-
K-C-C-D-F-V-T-N221) em tampão carbonato-bicarbonato (50 mmol/l, pH 9,6) e incubados
durante a noite a 4 °C. Posteriormente, os poços foram saturados com PBS + 5% (v/v) de
soro fetal bovino (FBS) e + 0,1% (v/v) solução Tween 20 (PBS–FBS–T) por duas horas à
temperatura ambiente.
Diluíram-se as amostras de soro para 1:800 em solução de PBS + FBS – T
incubando-as por duas horas a 37°C. Os anticorpos humanos IgG antiIgG (H + L) (1:5000
em PBS–FBS–T) foram posteriormente colocados para reagir por uma hora a 37 °C. Os
anticorpos ligados foram detectados com um conjugado de solução de 1μg/ml de
peroxidase (Streptavidin-Horseradish) em PBS-T-FBS (1:5000) e incubados sob proteção
da luz à temperatura ambiente por 30 minutos. A TMB (3,3′,5,5-tetrametil benzidina) foi
usada como substrato para a peroxidase. O desenvolvimento de cor foi medido como
absorbância a 450nm. Todos os reagentes usados no método ELISA foram adquiridos a
partir de Zymed (San Francisco, CA, USA). Os anticorpos antiβ1-ARAb e antiM2RAb
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