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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA ESCOLA DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL NOS TRÓPICOS VICTOR DIOGENES AMARAL DA SILVA CARACTERIZAÇÃO, ATRAVÉS DE MÉTODOS BIOQUÍMICOS E BIOFÍSICOS, DE DANOS MITOCONDRIAIS E VACUOLIZAÇÃO AUTOFÁGICA INDUZIDOS POR ALCALOIDES DA PROSOPIS JULIFLORA EM CÉLULAS DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL SALVADOR 2012
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA<br />
ESCOLA DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA<br />
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA<br />
ANIMAL NOS TRÓPICOS<br />
VICTOR DIOGENES AMARAL DA SILVA<br />
CARACTERIZAÇÃO, ATRAVÉS DE MÉTODOS<br />
BIOQUÍMICOS E BIOFÍSICOS, DE DANOS MITOCONDRIAIS<br />
E VACUOLIZAÇÃO AUTOFÁGICA INDUZIDOS POR<br />
ALCALOIDES DA PROSOPIS JULIFLORA EM CÉLULAS DO<br />
SISTEMA NERVOSO CENTRAL<br />
SALVADOR<br />
2012
VICTOR DIOGENES AMARAL DA SILVA<br />
CARACTERIZAÇÃO, ATRAVÉS DE MÉTODOS BIOQUÍMICOS E BIOFÍSICOS,<br />
DE DANOS MITOCONDRIAIS E VACUOLIZAÇÃO AUTOFÁGICA INDUZIDOS<br />
POR ALCALOIDES DA PROSOPIS JULIFLORA EM CÉLULAS DO SISTEMA<br />
NERVOSO CENTRAL<br />
Orientadora: Profª. Dra. Silvia Lima Costa<br />
Co-orientador: Profº. Dr. Juan Segura-Aguilar<br />
SALVADOR<br />
2012<br />
Tese apresenta<strong>da</strong> à Escola de<br />
Medicina Veterinária e Zootecnia<br />
<strong>da</strong> Universi<strong>da</strong>de Federal <strong>da</strong> Bahia,<br />
como requisito para a obtenção do<br />
título de Doutor <strong>em</strong> <strong>Ciência</strong><br />
<strong>Animal</strong> <strong>nos</strong> Trópicos.<br />
ii
FICHA CATALOGRÁFICA<br />
SILVA, Victor Diogenes Amaral <strong>da</strong><br />
Caracterização, através de métodos bioquímicos e biofísicos,<br />
de <strong>da</strong><strong>nos</strong> mitocondriais e vacuolização autofágica induzidos por<br />
alcaloides <strong>da</strong> Prosopis juliflora <strong>em</strong> células do sist<strong>em</strong>a nervoso<br />
central/ Victor Diogenes Amaral <strong>da</strong> Silva<br />
Salvador. 2012.<br />
(91)p.<br />
Orientador: Prof a . Dr a . Silvia Lima Costa.<br />
Tese (doutorado) – Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia,<br />
Universi<strong>da</strong>de Federal <strong>da</strong> Bahia, 2012.<br />
1. Prosopis juliflora. 2. Alcaloides piperidínicos. 3. Neurônios. 4.<br />
Células gliais. 5. Mitocôndria. 6. Vacúolos Autofágicos I. Costa,<br />
Silvia Lima. II. Universi<strong>da</strong>de Federal <strong>da</strong> Bahia. Escola de Medicina<br />
Veterinária e Zootecnia. III. Título<br />
iii
VICTOR DIOGENES AMARAL DA SILVA<br />
Tese defendi<strong>da</strong> e aprova<strong>da</strong> para obtenção do grau de Doutor <strong>em</strong> <strong>Ciência</strong> <strong>Animal</strong> <strong>nos</strong> Trópicos<br />
Salvador, 01 de nov<strong>em</strong>bro de 2012.<br />
Comissão examinadora:<br />
CARACTERIZAÇÃO, ATRAVÉS DE MÉTODOS<br />
BIOQUÍMICOS E BIOFÍSICOS, DE DANOS MITOCONDRIAIS<br />
E VACUOLIZAÇÃO AUTOFÁGICA INDUZIDOS POR<br />
ALCALOIDES DA PROSOPIS JULIFLORA EM CÉLULAS DO<br />
Prof. Dr. José Antonio Menezes Filho<br />
Profa. Dra. Maria José Moreira Batatinha<br />
SISTEMA NERVOSO CENTRAL<br />
Profa. Dra. Silvia Lima Costa<br />
Profa. Dra. Camila Alexandrina Viana<br />
de Figueredo<br />
Prof. Dr. Juan Segura-Aguilar<br />
iv
A Fidelina Maria <strong>da</strong> Silva, minha avó<br />
faleci<strong>da</strong> <strong>em</strong> 12 de outubro de 1992,<br />
analfabeta, como milhões de brasileiros<br />
ain<strong>da</strong> são, que com seis filhos e ain<strong>da</strong><br />
dificul<strong>da</strong>des financeiras, não hesitava<br />
<strong>em</strong> acolher familiares e amigos do<br />
interior <strong>da</strong> Bahia, objetivando o<br />
crescimento educacional <strong>da</strong> família.<br />
v
AGRADECIMENTOS<br />
A Deus por ter me munido de assessores para que este trabalho fosse concluído.<br />
A Silvia Lima Costa, pelo estímulo incessante para que eu me tronasse um<br />
pesquisador. A nove a<strong>nos</strong> atrás foi a responsável por minha inserção na pesquisa, e<br />
ain<strong>da</strong> é um modelo ex<strong>em</strong>plar de pesquisadora a ser seguido. As maiores lições que<br />
aprendi com a minha orientadora foram a leal<strong>da</strong>de, corag<strong>em</strong> e perseverança, que s<strong>em</strong><br />
dúvi<strong>da</strong>s faz<strong>em</strong> muita diferença para aqueles que são pesquisadores. Não poderia deixar<br />
também de agradecê-la pelo fato dela ser uma excelente amiga, irmã e mãe, com<br />
características marcantes de leonina, o que a torna muito especial na forma de educar e<br />
proteger suas ¨crias¨.<br />
Coincidência ou não, sou filho de uma leonina, Dalva de Jesus do Amaral <strong>da</strong> Silva, que<br />
devo agradecer a bravura com que dedicou sua vi<strong>da</strong> com muito amor e ain<strong>da</strong> hoje, junto<br />
a Nilo <strong>da</strong> Silva, meu querido pai contribui muito para ca<strong>da</strong> conquista minha.<br />
A minha queri<strong>da</strong> irmã, Daniela Amaral <strong>da</strong> Silva e seu noivo Jailton Andrade, que me<br />
auxiliaram <strong>em</strong> muitos momentos a solucionar probl<strong>em</strong>as que surgiram durante o<br />
período de desenvolvimento deste trabalho. Ain<strong>da</strong>, ao suporte para equilíbrio <strong>em</strong>ocional<br />
que Daniela me dá, diante de qualquer dificul<strong>da</strong>de.<br />
A terceira Leonina de grande importância para minha vi<strong>da</strong> e esta <strong>tese</strong>, Cátia Suze<br />
Ribeiro, pelo amor e confiança, que geram s<strong>em</strong>pre palavras de muito incentivo que me<br />
encorajaram nas toma<strong>da</strong>s de decisões durante o desenvolvimento deste trabalho.<br />
A Aroldo José Borges Carneiro, pelo auxilio na coleta de folhas <strong>da</strong> Prosopis juliflora, <strong>nos</strong><br />
períodos iniciais dos estudos apresentados nesta Tese.<br />
Aos amigos, Bruno Pitanga e Gustavo Rodrigues, pelo apoio <strong>nos</strong> primeiros a<strong>nos</strong> de<br />
construção desta <strong>tese</strong>.<br />
Ao Professor Eudes <strong>da</strong> Silva Velozo e a queri<strong>da</strong> equipe do LAPEM, <strong>em</strong> especial a<br />
Rail<strong>da</strong>, que me deu suporte técnico para extração dos alcaloides de folhas <strong>da</strong> Prosopis<br />
juliflora.<br />
Aos Professores Fátima Dias Costa e Ramon dos Santos El-Bachá, pela disposição a<br />
auxilio e incentivo a pesquisa no Laboratório de Neuroquímica e Biologia Celular.<br />
Aos queridos colegas e m<strong>em</strong>bros do Laboratório de Neuroquímica e Biologia Celular,<br />
<strong>em</strong> especial a Ravena Pereira do nascimento e Luã Tainã Costa Reis, aos quais eu<br />
confiei à posse <strong>da</strong>s alícotas de alcaloides e continuaram as ativi<strong>da</strong>des no Brasil<br />
enquanto estive no Chile. E aos d<strong>em</strong>ais pelo companheirismo e amizade.<br />
Ao Professor Juan Segura-Aguilar, pelo convite, orientação e suporte <strong>em</strong> Doutorado<br />
Sanduíche no Laboratório de Neurofarmacologia Celular y Molecular, <strong>da</strong> Universi<strong>da</strong>de<br />
do Chile.<br />
vi
Aos colegas do Laboratório de Neurofarmacologia Celular y Molecular, <strong>da</strong> Universi<strong>da</strong>de<br />
do Chile, <strong>em</strong> especial a Carlos Cuevas, Patricia Munoz, Monica Villa, Ulises Ahuma<strong>da</strong> e<br />
Veronica Toro que me auxiliaram diretamente <strong>nos</strong> experimentos realizados durante<br />
estadia neste laboratório. E aos d<strong>em</strong>ais pelo companheirismo e amizade.<br />
Por fim aos familiares e amigos que me deram apoio durante todo o período de<br />
doutoramente, <strong>em</strong> especial aqueles que contribuíram para a minha estabili<strong>da</strong>de<br />
<strong>em</strong>ocional durante estadia no exterior: Dulcinea Augusta de Jesus, Patrícia Silva<br />
Santos, Moises Vasconcelos Costa, Luciano Pereira, Ilana Coutinho de Alencar, Jean<br />
Cardozo, Till Hauswald, May-Lin Tay Morán, Pablo Seura, Lisis Hansen e to<strong>da</strong> a equipe<br />
do Centro de Estudios Espírita Buena Nueva.<br />
vii
“"Deus <strong>nos</strong> concede, a ca<strong>da</strong> dia, uma página de vi<strong>da</strong> nova no livro do t<strong>em</strong>po. Aquilo que<br />
colocarmos nela, corre por <strong>nos</strong>sa conta”.<br />
(Chico Xavier)<br />
viii
SUMÁRIO<br />
LISTA DE ABREVIATÚRAS x<br />
LISTA DE FIGURAS xii<br />
RESUMO xiv<br />
SUMMARY xv<br />
1. INTRODUÇÃO 1<br />
2. REVISÃO DE LITERATURA 2<br />
2.1. As plantas do gênero Prosopis 2<br />
2.1.1. Prosopis juliflora 3<br />
2.1.1.1 Introdução no Brasil 3<br />
2.1.1.2. Uso <strong>da</strong> espécie e compostos bioativos 3<br />
2.1.1.3. Intoxicações pelo consumo <strong>da</strong> Prosopis juliflora 6<br />
2.2. Aspectos estruturais e funcionais dos principais<br />
componentes celulares do SNC<br />
8<br />
2.3. A ação de alcaloides <strong>da</strong> Prosopis juliflora no SNC 12<br />
3. ARTIGO CIENTÍFICO I:<br />
Alcaloides piperidínicos <strong>da</strong> Prosopis juliflora induz<strong>em</strong> <strong>da</strong>no<br />
mitocondrial e vacuolização citoplasmática.<br />
14<br />
3.1. Introdução 16<br />
3.2. Materiais e Métodos 17<br />
3.3. Resultados 23<br />
3.4. Discussão 26<br />
3.5 Agradecimentos 31<br />
3.6 Referencias 32<br />
4. ARTIGO CIENTÍFICO II:<br />
Autofagia protege contra a morte celular induzi<strong>da</strong> por alcaloides <strong>da</strong><br />
Prosopis juliflora <strong>em</strong> co-cultura de neurônios/células <strong>da</strong> gliais.<br />
48<br />
4.1. Introdução 50<br />
4.2. Materiais e Métodos 51<br />
4.3. Resultados 55<br />
4.4. Discussão 57<br />
4.5 Agradecimentos 59<br />
4.6 Referencias 60<br />
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS 72<br />
6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 73<br />
7. PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA 92<br />
8. ANEXOS<br />
94<br />
ix
LISTA DE ABREVIATURAS<br />
ATP – Ade<strong>nos</strong>ina Trifosfato<br />
DL50- Dose letal cinquenta (mata 50% dos indivíduos <strong>em</strong> teste de toxici<strong>da</strong>de).<br />
DMEM – Meio de Eagle modificado por Dulbecco.<br />
DMSO – Dimetilsulfóxido<br />
EC50– Efeito citotóxico cinquenta (mata 50% <strong>da</strong>s células conti<strong>da</strong>s na amostra).<br />
EDTA - Ácido etileno diamino tetracético<br />
ETA - Extrato alcaloi<strong>da</strong>l de folhas <strong>da</strong> P. juliflora<br />
F29/30 - União <strong>da</strong> vigésima nona e trigésima fração alcaloi<strong>da</strong>l, oriun<strong>da</strong>s do ETA<br />
F31/33 - União <strong>da</strong> trigésima primeira e trigésima terceira fração alcaloi<strong>da</strong>l, oriun<strong>da</strong><br />
do ETA<br />
F32 - Trigésima segun<strong>da</strong> fração alcaloi<strong>da</strong>l, oriun<strong>da</strong> do ETA<br />
F34/35 - União <strong>da</strong> trigésima quarta e trigésima quinta fração alcaloi<strong>da</strong>l, oriun<strong>da</strong> do<br />
ETA<br />
GFAP – Proteína áci<strong>da</strong> fibrilar glial<br />
GL-15 – Linhag<strong>em</strong> de células origina<strong>da</strong> de glioblastoma multifo<strong>em</strong>e humano.<br />
IFN - Interferon<br />
LDH – Lactato desidrogenase.<br />
MHC – Complexo maior de histocompatibili<strong>da</strong>de<br />
MTT - Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio<br />
x
NO - Óxido Nitrico<br />
PBS – Tampão fosfato salino<br />
RMN – Resonância magnética nuclear<br />
SFB – Soro fetal Bovino<br />
SNC – Sist<strong>em</strong>a nervoso central<br />
TGF – Fator de crescimento tumoral<br />
xi
LISTA DE FIGURAS<br />
ARTIGO CIENTÍFICO I<br />
Figura 1 – Estrutura química dos alcaloides piperidínicos juliprosina e<br />
juliprosopina, presentes na fração F32.<br />
Figura 2 – Análise do efeito dos alcaloides de P. julifora sobre<br />
viabili<strong>da</strong>de dos neurônios e células gliais através do teste do MTT.<br />
Figura 3 - Análise do efeito dos alcaloides de P. juliflora na morfologia<br />
celular e indução de vacuolização de astrócitos <strong>em</strong> co-culturas de<br />
neurônios/células gliais através <strong>da</strong> coloração com o agente pancrônico<br />
de Rosenfeld.<br />
Figura 4 - Análise do efeito dos alcaloides de P. juliflora na morfologia<br />
de astrócitos e expressão GFAP <strong>em</strong> co-culturas de neurônios/células<br />
gliais.<br />
Figura 5 – Análise do efeito dos alcaloides de P. juliflora na morfologia<br />
de neurônios e expressão β-III-tubulina <strong>em</strong> co-culturas de<br />
neurônios/células gliais.<br />
Figura 6 – Análise do efeito dos alcaloides de P. juliflora na ativação<br />
<strong>da</strong> microglia <strong>em</strong> co-culturas de neurônios/células gliais após marcação<br />
imunocitoquímica <strong>da</strong> proteína OX-42 e coloração com Rosenfeld.<br />
Figura 7 – Medi<strong>da</strong> <strong>da</strong> produção de nitrito (NaNO2) no meio de cultura<br />
<strong>em</strong> condições de controle e após 24 h de tratamento com 1,5 - 3 µg/ml<br />
de ETA ou F32.<br />
Figura 8 – Análise por microscopia eletrônica de transmissão de<br />
modificações ultraestruturais induzi<strong>da</strong>s por alcaloides de P. juliflora <strong>em</strong><br />
co-culturas de neurônios/células gliais.<br />
ARTIGO CIENTÍFICO II<br />
Figura 1 - – Níveis de ATP por luminescência <strong>em</strong> condições controle<br />
(0.1% DMSO) ou na presença de 30 µg/mL ETA ou 7,5 µg/mL F32, for<br />
12 h. *p
Figura 2 – Análise de alterações no potencial de m<strong>em</strong>brana<br />
mitocondrial por coloração com JC-1 <strong>em</strong> co-cultura de<br />
neurônio/células gliais visualiza<strong>da</strong> por microscopia confocal.<br />
Figura 3 - Ativação de caspase-3 <strong>em</strong> co-culturas de neurônios/células<br />
gliais <strong>em</strong> condições controle (0.1% DMSO) ou trata<strong>da</strong>s durante 16 h<br />
com 30 µg/mL de ETA ou 7,5µg/mL de F32 foi determina<strong>da</strong> por<br />
análises de western blotting (A).<br />
Figura 4 - Determinação de vesículas de autofagossomos <strong>em</strong> coculturas<br />
de neurônios/células gliais transfecta<strong>da</strong>s com GFP-LC3.<br />
Figura 5 – O efeito <strong>da</strong> inibição ou indução de autofagia <strong>em</strong> células<br />
expostas a 30 µg/mL de ETA (A) ou 7,5 µg/mL de F32 (B) por 24 h.<br />
Figura 6 – Efeitos <strong>da</strong> inibição ou indução de autofagia na morfologia<br />
de neurônios e células gliais co-cultivados expostos a 30 µg/mL de<br />
ETA, 7,5 µg/mL de F32 ou condições controle durante 24h.<br />
67<br />
68<br />
69<br />
70<br />
71<br />
xiii
SILVA, Victor Diogenes Amaral <strong>da</strong>. Caracterização, através de métodos<br />
bioquímicos e biofísicos, de <strong>da</strong><strong>nos</strong> mitocondriais e vacuolização autofágica<br />
induzidos por alcaloides <strong>da</strong> Prosopis juliflora <strong>em</strong> células do sist<strong>em</strong>a nervoso<br />
central.. 2012. (91)p.Tese (Doutorado <strong>em</strong> <strong>Ciência</strong> <strong>Animal</strong> <strong>nos</strong> trópicos) - Escola de<br />
Medicina Veterinária e Zootecnia, Universi<strong>da</strong>de Federal <strong>da</strong> Bahia, Salvador, 2012.<br />
RESUMO<br />
As vagens <strong>da</strong> Prosopis juliflora são muito utiliza<strong>da</strong>s para consumo animal e humano.<br />
No entanto, a sua ingestão como base alimentar induz intoxicação <strong>em</strong> animais, que<br />
se caracteriza por alterações neuromusculares cujos mecanismos ain<strong>da</strong> não são<br />
b<strong>em</strong> esclarecidos. Nesta Tese são apresentados os resultados obtidos <strong>em</strong> estudos<br />
sobre a caracterização in vitro de lesões celulares e ultraestruturais antes vistas <strong>em</strong><br />
animais intoxicados pelo consumo <strong>da</strong> P. juliflora e a investigação dos mecanismos<br />
de neurotoxici<strong>da</strong>de de alcaloides piperidínicos desta planta <strong>em</strong> modelo de<br />
co-culturas de neurônios/células gliais deriva<strong>da</strong>s do córtex de ratos. Nos dois<br />
capítulos apresentados, as células gliais e neurônios foram expostos a alcaloides<br />
extraídos de folhas <strong>da</strong> P. juliflora testados na forma de extrato alcaloi<strong>da</strong>l (ETA) e<br />
uma fração de alcaloide (F32). No primeiro estudo a F32 foi caracteriza<strong>da</strong> por RMN<br />
como uma mistura dos alcaloides juliprosopina e juliprosina. ETA e F32<br />
apresentaram ativi<strong>da</strong>de citotóxica e os valores de EC50 foram 31,07 µg/ml e 7,36<br />
µg/ml, respectivamente. A exposição <strong>da</strong>s células à concentrações subtóxicas induziu<br />
vacuolização, alterações fenotípicas e mu<strong>da</strong>nças ultraestruturais, caracteriza<strong>da</strong>s<br />
pela formação de vacúolos com dupla ou múltipla m<strong>em</strong>branas e <strong>da</strong><strong>nos</strong><br />
mitocondriais. Ain<strong>da</strong>, nas culturas expostas a doses subtóxicas foi observa<strong>da</strong><br />
microgliose. No segundo estudo foram utiliza<strong>da</strong>s concentrações próximas à EC50 e<br />
foi d<strong>em</strong>onstrado que ETA e F32 induziram redução <strong>nos</strong> níveis de ATP, perturbação<br />
do potencial de m<strong>em</strong>brana mitocondrial e aumento significativo no número de<br />
células LC3-positivas após 12 h de exposição, aumento na ativação <strong>da</strong> caspase-3,<br />
após 16 h de exposição, e alteração drástica na morfologia de neurônios e de<br />
células gliais e um aumento significativo na morte celular após 24 horas de<br />
exposição. Curiosamente, pré-incubação com bafilomicina aumentou a morte celular<br />
e alterações morfológicas induzi<strong>da</strong>s pelo ETA, e privação de soro fetal bovino<br />
reduziu a morte celular e alterações morfológicas induzi<strong>da</strong>s por F32. Estes<br />
resultados suger<strong>em</strong> que os alcaloides juliprosopina e juliprosina são os responsáveis<br />
primários pelos <strong>da</strong><strong>nos</strong> neurotóxicos observados <strong>em</strong> animais intoxicados pela P.<br />
juliflora e que o mecanismo de morte neuronal e glial induzi<strong>da</strong> por estes envolve<br />
apoptose <strong>em</strong> resposta ao <strong>da</strong>no mitocondrial e inibição do fluxo <strong>da</strong> autofagia. Além<br />
disso, a autofagia parece ser um mecanismo importante de proteção contra a morte<br />
celular induzi<strong>da</strong> por alcaloides <strong>da</strong> P. juliflora <strong>em</strong> co-cultura de neurônios/células<br />
gliais.<br />
Palavras-chave: Prosopis juliflora; alcaloides piperidínicos; neurônios; células gliais;<br />
mitocôndria; vacúolos autofágicos.<br />
xiv
SILVA, Victor Diogenes Amaral <strong>da</strong>. Characterization of mitochondrial <strong>da</strong>mages<br />
and autophagic vacuolation induced by alkaloids of Prosopis juliflora in the<br />
central nervous syst<strong>em</strong> cells using bioch<strong>em</strong>ical and biophysical methods.<br />
2012. (91)p. Thesis (Ph.D., <strong>Animal</strong> Science in the Tropics) - School of Veterinary<br />
Medicine and Zootechny, Federal University of Bahia, Salvador, 2012.<br />
SUMMARY<br />
Prosopis juliflora pods is largely used for animal and human consumption. However,<br />
ingestion as sole substance has been shown to induce intoxication in animals, which<br />
is characterized by neuromuscular alterations induced by mechanisms that are not<br />
yet well understood. In this thesis we present the results obtained in two in vitro<br />
studies conducted for characterization of cellular and ultrastructural <strong>da</strong>mages<br />
observed in intoxicated animals after P. juliflora consumption, and mechanisms of<br />
neurotoxicity induced by alkaloids from this plant, using as a model cortical<br />
neurons/glial cells co-cultures derived from rats. Cells were exposed to a total<br />
alkaloi<strong>da</strong>l (TAE) extract from leaves of P. juliflora and an alkaloi<strong>da</strong>l fraction (F32). In<br />
the first study F32 was characterized by NMR as a mixture of two piperidine alkaloids<br />
juliprosopine and juliprosine. TAE and F32 were cytotoxic and the EC50 values were<br />
31.07 µg/mL and 7.36 µg/mL, respectively. Exposure to sub-toxic concentration<br />
induced vacuolation and phenotypic and ultra-structural changes, characterized by<br />
formation of double or multi m<strong>em</strong>brane vacuoles and mitochondrial <strong>da</strong>mage. Even in<br />
cultures exposed to sub-toxic doses microgliosis was also observed. In the second<br />
study, conducted with TAE and F32 doses near the EC50 concentrations, we found<br />
that both TAE and F32 induced reduction in ATP levels, disruption of mitochondrial<br />
m<strong>em</strong>brane potential and a significant increase in the number of autophagosome LC3<br />
positives cells after 12 h exposure, and caspase-3 activation, a marker of apoptosis<br />
after 16 h exposure, dramatic change on neuron and glial cells morphology and<br />
significant cell death after 24 h. Interestingly pre-incubation with bafilomycin, an<br />
inhibitor of autophagy, increased the cell death and morphologic changes induced by<br />
TAE, and serum deprivation reduced the cell death and morphologic changes<br />
induced by F32. These results suggest that juliprosopina and juliprosina alkaloids are<br />
primarily responsible for the neurotoxic <strong>da</strong>mage observed in animals intoxicated by<br />
P. juliflora and that the mechanism of neuronal and glial cell death induced by these<br />
involves apoptosis in response to mitochondrial <strong>da</strong>mage and inhibition of the<br />
autophagic flux. Furthermore, autophagy appears to be an important mechanism of<br />
protection against cell death induced by alkaloids of P. juliflora in co-culture of<br />
neuronal/glial cells.<br />
Palavras-chave: Prosopis juliflora; piperidine alkaloids; neurons; glial cells;<br />
mitochondria; autophagic vacuoles.<br />
xv
1. INTRODUCAO GERAL<br />
Prosopis juliflora Sw. DC (algaroba) é um arbusto que foi introduzido no<br />
nordeste do Brasil <strong>em</strong> 1940 (SPA, 1989). As vagens desta planta são ricas <strong>em</strong><br />
carboidratos e proteínas e têm sido uma fonte importante de alimento para huma<strong>nos</strong><br />
e animais (CHOGE et al., 2007; SILVA et al., 2002a; SILVA et al., 2002b; STEIN et<br />
al., 2005; PINHEIRO et al., 1986; ROSSI et al., 2009). No entanto, o consumo<br />
destas vagens provoca uma enfermi<strong>da</strong>de quando é a única fonte de alimento para o<br />
animal (BACA et al, 1967; DOLLAHITE & ANTHONY, 1957). A enfermi<strong>da</strong>de induzi<strong>da</strong><br />
por esta planta <strong>em</strong> animais é denomina<strong>da</strong> ''Cara torta" e caracteriza-se por<br />
<strong>em</strong>agrecimento, alterações neuromusculares (incluindo atrofia muscular dos<br />
masseteres), e lesões histológicas tais como espongiose, gliose, a per<strong>da</strong> <strong>da</strong><br />
substância de Nissl e vacuolização do pericário de neurônios do núcleo motor do<br />
nervo trigêmeo (FIGUEIREDO et al., 1995, TABOSA et al., 2000a).<br />
Extratos de vagens e folhas de algaroba têm d<strong>em</strong>onstrado possuir várias<br />
proprie<strong>da</strong>des farmacológicas, atribuí<strong>da</strong>s especialmente aos alcaloides piperidínicos<br />
presentes <strong>em</strong> diversas partes desta planta (KANTHASAMY et al, 1989; CÁ-CERES<br />
et al, 1995;. AL-SHAKH-HAMED & AL-JAMMAS, 1999; SATISH et al, 1999;<br />
KANTHASAMY et al, 1989; KAUSHIK et al, 2002; CHOUDHARY et al. 2005;<br />
BATATINHA et al., 2011). Estudos in vitro d<strong>em</strong>onstraram que os alcaloides<br />
presentes nas vagens e folhas <strong>da</strong> P. juliflora têm ação direta sobre células gliais<br />
gerando efeitos tóxicos e inflamatórios e ain<strong>da</strong> suger<strong>em</strong> que alcaloides que<br />
compõ<strong>em</strong> uma fração (F32) obti<strong>da</strong> por cromatografia do extrato total de alcaloides –<br />
ETA são os que apresentam maior potencial biológico (HUGHES et al, 2006; SILVA<br />
et al, 2007). No entanto ain<strong>da</strong> não se sabe quais os alcaloides presentes na fração<br />
F32 e ain<strong>da</strong> se estes são capazes de induzir in vitro aquelas lesões neuro-<br />
histológicas e ultraestruturais visualiza<strong>da</strong>s <strong>em</strong> animais intoxicados pelo consumo <strong>da</strong><br />
P. juliflora (TABOSA et al, 2000a; TABOSA et al, 2006;. CÂMARA et al, 2009).<br />
Assim, nesta Tese são apresentados os resultados obtidos <strong>em</strong> estudos<br />
sobre a caracterização in vitro de lesões celulares e ultraestruturais antes vistas <strong>em</strong><br />
animais intoxicados pelo consumo <strong>da</strong> P. juliflora e na investigação dos mecanismos<br />
1
de neurotoxici<strong>da</strong>de de alcaloides piperidínicos desta planta visando contribuir para<br />
eluci<strong>da</strong>r os impactos neurológicos observados <strong>em</strong> animais intoxicados e definir<br />
aspectos <strong>da</strong> toxicologia dos alcaloides piperidínicos.<br />
2. REVISAO DE LITERATURA<br />
2.1. As plantas do gênero Prosopis<br />
Plantas do gênero Prosopis, família Fabaceae (Legumi<strong>nos</strong>ae) e subfamília<br />
Mimosoideae, conheci<strong>da</strong>s por diversos nomes vulgares dentre eles a Algaroba e<br />
Mesquita são árvores ou arbustos com variados tamanhos, raramente sub-arbustos<br />
e predominant<strong>em</strong>ente xerófilos, aculeados, espinhosos ou raramente armados<br />
(Anexo 2)<br />
. As folhas são bipina<strong>da</strong>s, comumente com poucos pares de pinas opostas;<br />
folíolos peque<strong>nos</strong>, numerosos, geralmente opostos, lineares, oblongos, fusiformes,<br />
raramente grandes, <strong>da</strong> mesma cor <strong>em</strong> ambos os lados. Os frutos são lomentos<br />
drupáceos, lineares, retos, falcados, anulares para espiralados; mesocarpo carnudo,<br />
acurado ou fibroso; endocarpo dividido <strong>em</strong> compartimentos para uma s<strong>em</strong>ente,<br />
segmentos coriáceos para lenhosos, fechados ou às vezes de fácil abertura,<br />
longitudinais ou raramente seriados e transversos, com s<strong>em</strong>entes ovóides,<br />
achata<strong>da</strong>s com linha fissural nas faces, duras, amarronza<strong>da</strong>s, com endosperma<br />
mucilagi<strong>nos</strong>o circun<strong>da</strong>ndo o <strong>em</strong>brião; cotilédones achatados, arredon<strong>da</strong>dos,<br />
epíge<strong>nos</strong> na germinação. As flores são pequenas, actinomorfas, hermafroditas, de<br />
coloração branco-esverdea<strong>da</strong>, amarela<strong>da</strong> com a i<strong>da</strong>de, poliniza<strong>da</strong> por insetos<br />
(BURKART, 1976; GARIBALDI, 2001).<br />
Este gênero possivelmente originou-se na África Tropical, onde a P. africana<br />
é a última espécie natural que ain<strong>da</strong> existe. Seguindo a teoria de que os continentes<br />
eram ligados, os ancestrais <strong>da</strong>s espécies americanas migraram <strong>da</strong> África para a<br />
América e originaram dois polos de evolução: um na região México-Texana e outro<br />
na região Argentina-Paraguai-Chile. Muitos fatores indicam que, na América, o<br />
centro principal de dispersão de Prosopis é a Argentina (BURKART, 1976).<br />
Atualmente este gênero compreende 44 espécies distribuí<strong>da</strong>s por to<strong>da</strong> a Ásia<br />
2
Ocidental, África e regiões ári<strong>da</strong>s e s<strong>em</strong>i-ári<strong>da</strong>s <strong>da</strong>s Américas, desde o sudoeste dos<br />
Estados Unidos a região central do Chile e Argentina (SILVA et al., 1986a).<br />
Burkart (1976) classificou o gênero Prosopis <strong>em</strong> cinco seções com base <strong>em</strong><br />
diferenças morfológicas observa<strong>da</strong>s <strong>em</strong> distintos lugares, duas delas <strong>da</strong> África e <strong>da</strong><br />
Ásia: Prosopis e Anonychium; e três delas ocupando as Américas: Monilicarpa,<br />
Strombocarpa e Algarobia, sendo esta última subdividi<strong>da</strong> <strong>em</strong> cinco séries: Palli<strong>da</strong>e,<br />
Humildes, Denun<strong>da</strong>ntes, Sericanthae e Chilenses, a qual faz parte a espécie<br />
Prosopis juliflora. No entanto, estudos recentes de caracterização taxonômica<br />
usando técnicas de biologia molecular, suger<strong>em</strong> a necessi<strong>da</strong>de de reclassificação<br />
<strong>da</strong>s espécies dentro <strong>da</strong>s diferentes séries <strong>da</strong> seção Algarobia, por existir<strong>em</strong><br />
espécies nesta seção que não são geneticamente relaciona<strong>da</strong>s (SHERRY et al.,<br />
2011).<br />
2.1.1. Prosopis juliflora<br />
2.1.1.1 Introdução no Brasil<br />
Esta espécie, atualmente, pode ser encontra<strong>da</strong> <strong>em</strong> todo o Nordeste e <strong>em</strong><br />
outras regiões do Brasil, com as maiores concentrações <strong>nos</strong> Estados de<br />
Pernambuco (PE), Rio Grande do Norte, Minas Gerais e Paraíba (SILVA et al.,<br />
1986a). Estudos de Lima & Silva (1991) d<strong>em</strong>onstram que também há a presença <strong>da</strong><br />
P. affinis <strong>em</strong> Serra Talha<strong>da</strong> - PE e suger<strong>em</strong> que o lote de s<strong>em</strong>entes de P. juliflora<br />
introduzi<strong>da</strong> <strong>em</strong> 1942, continha mistura de s<strong>em</strong>entes de P. affinis, ou s<strong>em</strong>entes de<br />
material híbrido <strong>da</strong>s duas espécies.<br />
A primeira introdução <strong>da</strong> P. juliflora no Nordeste Brasileiro ocorreu com<br />
s<strong>em</strong>entes procedentes do Peru (AZEVEDO, 1961; GOMES, 2007). Duas<br />
introduções adicionais foram feitas <strong>em</strong> Angicos, Rio Grande do Norte: <strong>em</strong> 1947, com<br />
s<strong>em</strong>entes do Peru e, <strong>em</strong> 1948, com s<strong>em</strong>entes oriun<strong>da</strong>s do Sudão (AZEVEDO,<br />
1955). A partir <strong>da</strong>í, sua expansão para os d<strong>em</strong>ais estados <strong>da</strong> federação ocorreu<br />
através <strong>da</strong> regeneração natural e plantios.<br />
2.1.1.2. Uso <strong>da</strong> espécie e compostos bioativos<br />
O Brasil apresenta uma região caracteriza<strong>da</strong> como s<strong>em</strong>i árido que possui<br />
precipitação pluviométrica média anual inferior a 800 milímetros, índice de aridez de<br />
até 0,5 calculado pelo balanço hídrico que relaciona as precipitações e a<br />
3
evapotranspiração potencial no período entre 1961 e 1990, e risco de seca maior<br />
que 60%, tomando-se por base o período entre 1970 e 1990. Esta região engloba os<br />
Estados de Alagoas, Bahia, Ceará, Minas Gerais, Paraíba, Pernambuco, Piauí, Rio<br />
Grande do Norte e Sergipe, abrangendo um total de 1.133 municípios (PEREIRA<br />
JR., 2007). No entanto, <strong>em</strong> 2012 os índices pluviométricos nesta região foram tão<br />
baixos que, de acordo com o Ministério <strong>da</strong> Integração Nacional, 8,3 milhões de<br />
brasileiros de 1.187 municípios foram afetados pela seca durante este ano (MIN,<br />
2012). Em geral esta região apresenta uma vegetação denomina<strong>da</strong> Caatinga, que<br />
se caracteriza por uma baixa produtivi<strong>da</strong>de e pequena diversi<strong>da</strong>de de espécies <strong>em</strong><br />
relação à floresta tropical úmi<strong>da</strong>. A Caatinga se desenvolve <strong>em</strong> condições adversas,<br />
como solos rasos, pedregosos ou are<strong>nos</strong>os, com pH neutro ou próximo de 7, pobre<br />
<strong>em</strong> material orgânico e rico <strong>em</strong> sais minerais solúveis, especialmente cálcio e<br />
potássio (MENDES, 1986a). Apesar destas condições adversas a algaroba é capaz<br />
de se desenvolver plenamente, passando então a servir como recurso alternativo<br />
para esta região pela sua alta resistência e a<strong>da</strong>ptabili<strong>da</strong>de (MENDES, 1986b;<br />
SANTOS & TERTULIANO, 1998; PEGADO et al., 2006).<br />
Outro fator que tornou a algaroba extr<strong>em</strong>amente importante para o nordeste<br />
brasileiro foi o seu potencial <strong>em</strong> produzir vagens com alta palatabili<strong>da</strong>de e valor<br />
nutricional, e que fizeram <strong>da</strong> planta uma fonte geradora de alimentos para o hom<strong>em</strong><br />
e para os animais desta região (SILVA et al., 2008; MENDES, 1986b). Além <strong>da</strong>s<br />
vagens, as folhas também são usa<strong>da</strong>s na alimentação animal. Juntas geram uma<br />
capaci<strong>da</strong>de produtiva de ração de 20 a 40 tonela<strong>da</strong>s por hectare por ano (SILVA,<br />
1986b; GARIBALDI, 2001).<br />
Sabe-se que 100g <strong>da</strong> farinha de vagens possui 10 g de água, 25 g de<br />
proteínas, 5,2 g de gorduras, 36,5 g de carboidratos, 20 g de fibra bruta e 3,3 g de<br />
sais minerais. Os altos níveis de carboidratos faz<strong>em</strong> com que as vagens apresent<strong>em</strong><br />
sabor adocicado, e também torna possível a produção de álcool etílico a partir delas<br />
(SILVA et al., 2003). Os níveis de macronutrientes <strong>em</strong> folhas novas e <strong>em</strong> folhas<br />
velhas são respectivamente: N 2,59-1,90%; P 0,23-0,14%; K 1,93-2,04%; Ca 0,45-<br />
0,64%; Mg 0,49-0,63%; S 0,20-0,21% (HAAG et al., 1986).<br />
4
Desta forma têm-se sugerido a utilização <strong>da</strong>s vagens <strong>da</strong> P. juliflora como<br />
supl<strong>em</strong>ento ou parte integrante de rações na alimentação animal, objetivando-se a<br />
substituição do milho ou de outra fonte de energia e proteínas nas dietas de<br />
codornas (SILVA et al., 2002a), galinhas poedeiras (SILVA et al., 2002b) eqüi<strong>nos</strong><br />
(STEIN et al., 2005), suí<strong>nos</strong> (PINHEIRO et al., 1986), ruminantes (BARROS e<br />
QUEIROZ FILHO, 1982; RAVIKALA et al., 1995; MAHGOUB et al., 2005) e peixes<br />
(BASTOS & FAÇANHA, 1985).<br />
As espécies do gênero Prosopis têm sido uma fonte histórica de alimentos<br />
para as populações humanas na América do Norte e América do Sul, pelos povos<br />
indígenas, e ain<strong>da</strong> hoje as vagens e farinhas oriun<strong>da</strong>s destas têm sido usa<strong>da</strong>s para<br />
o consumo humano como pães, biscoitos, geléias, doces e ain<strong>da</strong> para a produção<br />
de água ardente e bebi<strong>da</strong> substituta do café (SILVA, 1986b; VIEIRA et al, 1995;<br />
SILVA et al., 2003; CHOGE et al, 2007).<br />
Moléculas com potencial bioativo isola<strong>da</strong>s <strong>da</strong> P. juliflora inclu<strong>em</strong> esteróides,<br />
alcaloides, cumarinas, flavonóides, sesquiterpe<strong>nos</strong>, ácido esteárico, proteínas do<br />
pólen de ação alergênica e <strong>da</strong>s s<strong>em</strong>entes com ação inibidora de proteinases<br />
(OLIVEIRA et al., 2002; KILLIAN & MCMICHAEL, 2004; ALMARAZ-ABARCA et al.,<br />
2007).<br />
Os principais alcaloides piperidínicos já caracterizados <strong>em</strong> diferentes partes<br />
<strong>da</strong> P. juliflora são a juliprosopina (juliflorina); juliprosina, juliprosineno, julifloridina,<br />
julifloricina, juliflorinina. A comparação <strong>da</strong> estrutura proposta para a juliprosopina,<br />
com base <strong>nos</strong> <strong>da</strong>dos espectrométricos <strong>da</strong> juliflorina, revelou que os dois alcaloides<br />
são idênticos, por isso passaram a ser considerados sinônimos (AHMAD et al.,<br />
1986). Ahmad & Mohammad (1979) buscaram eluci<strong>da</strong>r a estrutura <strong>da</strong> juliprosopina<br />
(C40H75N3O2) encontrando este composto também na P. glandulosa. Este mesmo<br />
alcaloide (OTT-LONGONI et al., 1980) e a juliprosina (C40H72N3O2) (DAETWYLER et<br />
al., 1981) foram isola<strong>da</strong>s <strong>da</strong>s folhas <strong>da</strong> P. juliflora, obti<strong>da</strong>s como uma resina incolor e<br />
um óleo, respectivamente. Ahmad et al. (1985) e Aqeel Ahmad et al. (1989)<br />
concluíram, através de <strong>da</strong>dos espectrométricos, que a juliprosopina e a julifloricina<br />
são alcaloides isômeros. A estruturas dos alcaloides juliprosinina (C40H70N3O2) e<br />
juliflorinina (C40H75N3O2), que possui a mesma configuração <strong>da</strong> juliflorina<br />
5
(juliprosopina) foram determina<strong>da</strong>s por Ahmad e colaboradores, <strong>em</strong> 1989 e os<br />
compostos caracterizados como um sal clorado, obtidos como uma resina.<br />
Os alcaloides piperidinicos <strong>da</strong> P. juliflora têm a sua estrutura composta por<br />
dois anéis de piperidínicos, que são ligados a um anel indolizidínico através de duas<br />
cadeias alifáticas (AHMAD & MOHAMMAD et al, 1979;. AHMAD et al, 1985;.<br />
AHMAD et al, 1986b,. AHMAD et al., 1989). Os alcaloides biologicamente ativos<br />
juliprosina e juliprosopina apresentam grupos funcionais químicos (carbonilas e<br />
hidroxilas) <strong>em</strong> carbo<strong>nos</strong> 3 e 3' dos anéis de piperidínicos ou no carbono 3''' do anel<br />
indolizidínico, respectivamente (NAKANO et al, 2004.; CHOUDHARY et al, 2005).<br />
Diversas proprie<strong>da</strong>des farmacológicas têm sido d<strong>em</strong>onstra<strong>da</strong>s para<br />
compostos obtidos de folhas e frutos <strong>da</strong> P. juliflora tais como ação anti-bacteriana<br />
(AQEEL AHMAD et al, 1989a; AQEEL AHMAD et al, 1986; AQEEL AHMAD et al,<br />
1995, KANTHASAMY et al, 1989; CÁ-CERES et al, 1995; SATISH et al, 1999;<br />
LAKSHMI et al., 2010), antifúngica (AQEEL AHMAD et al, 1989b; KANTHASAMY et<br />
al, 1989, KAUSHIK et al, 2002), estimulante do sist<strong>em</strong>a imunitário (AQEEL AHMAD<br />
et al. 1992), e os inibidores <strong>da</strong> acetilcolinesterase, inibidora <strong>da</strong> butirilcolinesterase<br />
com ativi<strong>da</strong>de de bloqueio de canais de Ca 2+ (CHOUDHARY et al. 2005), e anti-<br />
helmíntica (BATATINHA et al., 2011). Estas proprie<strong>da</strong>des têm sido atribuí<strong>da</strong>s aos<br />
alcaloides piperidinicos existentes nas diversas partes desta planta (AQEEL AHMAD<br />
et al., 1989; TABOSA et al., 2000a).<br />
2.1.1.3. Intoxicações pelo consumo <strong>da</strong> Prosopis juliflora<br />
Desde a déca<strong>da</strong> de 50, esta planta t<strong>em</strong> sido descrita como causadora de<br />
intoxicação <strong>em</strong> animais <strong>nos</strong> EUA (DOLLAHITE & ANTHONY, 1957), Peru (BACA et.<br />
al., 1967). Mais tarde, no Brasil a doença <strong>em</strong> bovi<strong>nos</strong>, provoca<strong>da</strong> pela sua ingestão,<br />
veio a ser chama<strong>da</strong> de doença <strong>da</strong> cara torta, caracteriza<strong>da</strong> por ed<strong>em</strong>a, alterações<br />
neuromusculares, incluindo atrofia do masseter e lesões histológicas como<br />
espongiose, gliose, per<strong>da</strong> de substância de Nills e vacuolização de neurônio de<br />
núcleo de nervo cranial (FIGUEIREDO et al, 1995).<br />
Em capri<strong>nos</strong>, TABOSA et al. (2000a) d<strong>em</strong>onstraram toxici<strong>da</strong>de para animais<br />
após ingestão crônica de uma dieta composta de 60 a 90% de matéria seca de<br />
6
vagens de P. juliflora. Os animais apresentaram sinais clínicos s<strong>em</strong>elhantes àqueles<br />
que foram previamente observados na intoxicação de bovi<strong>nos</strong> pelo consumo de<br />
vagens (FIGUEIREDO et al., 1995) e na microscopia, foram observa<strong>da</strong>s lesões<br />
histológicas caracteriza<strong>da</strong>s por vacuolização dos neurônios do núcleo oculomotor do<br />
nervo trig<strong>em</strong>inal, degeneração walleriana dos nervos mandibulares e trig<strong>em</strong>inais e<br />
atrofia muscular por degeneração de nervos periféricos. A intoxicação experimental<br />
<strong>em</strong> bovi<strong>nos</strong> com dieta crônica de alta porção de vagens (> 50%) evidenciou além<br />
dos sinais clínicos e alterações histológicas previamente evidencia<strong>da</strong>s, que estes<br />
animais apresentavam <strong>em</strong> neurônios do núcleo trig<strong>em</strong>inal, mitocôndrias com cristas<br />
dispersas perifericamente e desintegra<strong>da</strong>s.<br />
Casos de intoxicações espontâneas são atualmente relatados <strong>em</strong> região do<br />
s<strong>em</strong>i-árido brasileiro, <strong>em</strong> bovi<strong>nos</strong> que pastejaram áreas invadi<strong>da</strong>s pela Prosopis<br />
juliflora ou que ingeriram as vagens como alimento concentrado (CÂMARA et al.,<br />
2009).<br />
Até então, pouco se sabe sobre os principios ativos presentes nas vagens desta<br />
planta, mas alguns estudos foram pioneiros <strong>em</strong> apontar os alcaloides piperidínicos<br />
como potencialmente tóxicos (AQUEEL AHMAD et al., 1991; BATATINHA, 1997).<br />
Estudos de toxici<strong>da</strong>de <strong>em</strong> camundongos realizados por Tabosa e colaboradores<br />
(2000b) suger<strong>em</strong> que o efeito tóxico <strong>da</strong>s vagens <strong>da</strong> algaroba esta relacionado a uma<br />
ação sinérgica <strong>em</strong> uma fração <strong>da</strong> vag<strong>em</strong> (FAT) contendo os alcaloides juliprosopina,<br />
juliprosina e juliprosineno. Estes pesquisadores chegaram a tal reflexão ao<br />
comparar<strong>em</strong> a DL50 <strong>da</strong> FAT (10,3 mg/Kg) com a DL50 do alcaloide juliprosopina<br />
isolado (20,8 mg/Kg). A ação sinérgica de alcaloides piperidínicos de vagens <strong>da</strong> P.<br />
juliflora, também foi d<strong>em</strong>onstra<strong>da</strong> <strong>em</strong> culturas celulares por Batatinha (1997). O<br />
extrato metanólico de vagens, a fração alcaloi<strong>da</strong>l, b<strong>em</strong> como dois alcaloides isolados<br />
(juliprosopina e juliprosina) foram testados quanto a sua citotoxici<strong>da</strong>de <strong>em</strong> culturas<br />
de tumor epitelial humano (HeLa), tumor hepático (HepG2) e <strong>em</strong> dois modelos de<br />
fibroblastos: cultura primária de fibroblasto epitelial humano (F26) e linhag<strong>em</strong> de<br />
tumor sinovial (F57). Neste estudo foi verificado que to<strong>da</strong>s as culturas sofreram<br />
lesão <strong>em</strong> m<strong>em</strong>brana células, como efeito citotóxico. Evidenciando que houve lesão<br />
de m<strong>em</strong>brana <strong>em</strong> mais de 90% <strong>da</strong>s células trata<strong>da</strong>s com 3mg/mL do um extrato<br />
7
metanólico, 3 a 300 µg/mL <strong>da</strong> uma fração alcaloi<strong>da</strong>l ou 30 µg/mL dos alcaloides<br />
juliprosina e juliprosopina, isolados.<br />
2.2. Aspectos estruturais e funcionais dos principais componentes celulares<br />
do SNC<br />
O sist<strong>em</strong>a nervoso central (SNC) é constituído de neurônio, uni<strong>da</strong>de<br />
sinalizadora; e de um conjunto polivalente de células chamado de neuroglia ou glia<br />
(LENT, 2005). As células <strong>da</strong> glia dispõ<strong>em</strong>-se circun<strong>da</strong>ndo o corpo celular, axônio e<br />
dendritos dos neurônios para interagir extensivamente, influenciando suas<br />
ativi<strong>da</strong>des. Também estão envolvi<strong>da</strong>s na detoxificação e manutenção <strong>da</strong><br />
homeostasia (FIELD & STEVENS-GRAHAM, 2002; LENT, 2005).<br />
Como uni<strong>da</strong>de fun<strong>da</strong>mental do SNC, o neurônio é capaz de receber,<br />
processar e enviar informações, e para tanto apresenta a particulari<strong>da</strong>de de<br />
apresentar processos polarizados especializados denominados de neuritos (axônios<br />
e dendritos) capazes de propagar potenciais de ação, fazer junções sinápticas com<br />
outros neurônios e células, formando locais de liberação para neurotransmissores<br />
estocados <strong>em</strong> vesículas m<strong>em</strong>bra<strong>nos</strong>as (MOREST & SILVER, 2003; LENT, 2005). O<br />
citoesqueleto dos neurônios é constituído por duas estruturas principais: os<br />
microtúbulos, presentes no corpo celular, alongado para os axônios e dendritos; e os<br />
neurofilamentos, que são componentes constantes dos axônios, apresentando-se<br />
raramente <strong>em</strong> dendritos (MACHADO & FIGUEREDO, 1996; SIEGEL et al., 1999).<br />
Dentre os fatores que pod<strong>em</strong> influenciar a composição proteica dos prolongamentos<br />
neuronais, destaca-se o ambiente <strong>em</strong> que o mesmo está situado. Isso foi<br />
comprovado por Sonderegger et al. (1985), que revelaram diferença <strong>em</strong> doze<br />
proteínas componentes dos axônios, comparando neurônios cultivados na presença<br />
de outras células do sist<strong>em</strong>a nervoso central e periférico. Assim como os<br />
constituintes proteicos do citoesqueleto são influenciados pelo meio <strong>em</strong> que o<br />
neurônio se encontra, a quanti<strong>da</strong>de e tamanho dos neuritos também pod<strong>em</strong> sofrer<br />
alterações. Isso foi d<strong>em</strong>onstrado in vitro por WANG & CYNADER (1999), que<br />
comparando culturas de neurônios cultiva<strong>da</strong>s sobre diferentes matrizes,<br />
evidenciaram a importância <strong>da</strong>s células gliais para constituição de um ambiente que<br />
melhor proporciona o desenvolvimento e a sobrevi<strong>da</strong> de neurônios.<br />
8
As células gliais pod<strong>em</strong> ser dividi<strong>da</strong>s <strong>em</strong> duas grandes classes: a macroglia e<br />
a microglia. A macroglia, de orig<strong>em</strong> <strong>em</strong>brionária neuroepitelial, inclui os<br />
oligodendrócitos e os astrócitos. Os oligodendrócitos são responsáveis pela<br />
mielinização dos axônios neuronais, com o intuito de promover a condução saltatória<br />
do potencial de ação, impedindo que o impulso elétrico alastre-se para outras<br />
células que não sejam o alvo, possibilitando assim maior eficiência e rapidez na<br />
condução do impulso nervoso (KRIEGSTEIN & GÖTZ, 2003; LENT, 2005). Outras<br />
proprie<strong>da</strong>des biológicas têm sido atribuí<strong>da</strong>s aos oligodendrócitos tais como a<br />
ativi<strong>da</strong>de imunoefetora, pelo fato destas células expressar<strong>em</strong> moléculas de MHC<br />
classe I e II <strong>em</strong> suas m<strong>em</strong>branas plasmáticas (SIEGEL et al., 1999), e mais<br />
recent<strong>em</strong>ente a participação <strong>da</strong> nutrição de neurônios juntamente com os astrócitos<br />
foi d<strong>em</strong>onstra<strong>da</strong> (FÜNFSCHILLING et al., 2012).<br />
Os astrócitos, assim denominados pela morfologia estrela<strong>da</strong>, constitu<strong>em</strong> a<br />
população mais numerosa do sist<strong>em</strong>a nervoso central (COMBES et al., 2012). São<br />
fun<strong>da</strong>mentais para a captação de nutrientes e de oxigênio do sangue para os<br />
neurônios, para a manutenção <strong>da</strong> homeostasia do SNC, compõ<strong>em</strong> o arcabouço<br />
tecidual que fornece sustentação ao SNC e participam ain<strong>da</strong> dos mecanismos de<br />
defesa imunitária do tecido nervoso e dos fenôme<strong>nos</strong> de detoxificação cerebral<br />
(TARDY, 1991; LENT, 2005; TARDY, 2002). Estas células participam do processo<br />
de eliminação de espécies reativas de oxigênio, predominant<strong>em</strong>ente pela ação <strong>da</strong>s<br />
enzimas catalase e glutationa peroxi<strong>da</strong>se (DRINGEN et al., 2005) e através de<br />
moléculas receptoras <strong>nos</strong> pedículos <strong>da</strong>s extr<strong>em</strong>i<strong>da</strong>des dos prolongamentos<br />
astrocitários, rodeiam as sinapses centrais, para detoxificar o excedente de<br />
neurotransmissores acumulados nas fen<strong>da</strong>s sinápticas, tais como o ácido gama-<br />
aminobutírico (GABA) e o glutamato, que são metabolizados <strong>em</strong> glutamina. Este<br />
aminoácido, por sua vez, pode ser disponibilizado para os neurônios e utilizado para<br />
reformulação de neurotransmissores (CAJAL, 1995; KIRCHHOFF et al., 2001;<br />
NAKASE & NAUS, 2004). Anteriormente achava-se que esta seria a única<br />
participação dos astrócitos nas sinapses, atualmente têm sido propostas<br />
comunicações diretas entre astrócitos e neurônios com o desenvolvimento do<br />
conceito de gliotransmissores, que se refere à capaci<strong>da</strong>de de os astrócitos para<br />
libertar vários transmissores, tais como ade<strong>nos</strong>ina trifosfato (ATP), glutamato, D-<br />
serina, e GABA na vizinhança <strong>da</strong>s sinapses (ACHOUR & PASCUAL, 2012). Os<br />
9
astrócitos também representam o componente principal <strong>da</strong> Barreira<br />
H<strong>em</strong>atoencefálica gerando através dos chamados pés astrocitários (processos<br />
citoplasmáticos) contato direto com as células endoteliais, importante para a defesa<br />
contra agentes infecciosos (COMBES et al., 2012). Sendo também células<br />
apresentadoras de antígeno, os astrócitos são capazes de exteriorizar <strong>em</strong> suas<br />
m<strong>em</strong>branas, antíge<strong>nos</strong> e provocar uma resposta imunológica contra agentes<br />
patogênicos (SIEGEL et al., 1999).<br />
Estudos têm revelado que os astrócitos representam uma população celular<br />
capaz de reagir a insultos químicos, constituindo um bom modelo de estudo para<br />
neurotoxici<strong>da</strong>de de diversos agentes (COOKSON et al., 1994), dentre eles o ácido<br />
caínico, cloreto de mercúrio, cloreto de alumínio, tolueno, etanol, dibutiril-cAMP,<br />
trimetilestanho e aos próprios alcaloides de piperidinicos (RATABOUL et al., 1989;<br />
COOKSON E PENTREATH, 1994; MEAD PENTREATH, 1998; HARRY et al.; 2002;<br />
HUGHES et al, 2006; SILVA et al, 2007). Ain<strong>da</strong>, estudos têm revelado que os<br />
astrócitos são a primeira linha de defesa contra xenobióticos e expressam níveis<br />
elevados tanto de enzimas do metabolismo de fase I de drogas, o sist<strong>em</strong>a citocromo<br />
P450 (MEYER et al., 2007), que pode estar relacionado com a metabolização de<br />
alcaloides no SNC (Para revisão ver PITANGA et al., 2012), quanto enzimas de fase<br />
II do metabolismo de drogas, como as isoformas µ e π <strong>da</strong> glutationa-S-transferase<br />
que pod<strong>em</strong> estar associa<strong>da</strong>s a mecanismos de resistência à fármacos que atuam no<br />
SNC (SHANG et al., 2008).<br />
A microglia, de orig<strong>em</strong> <strong>em</strong>brionária h<strong>em</strong>atopoiética, é composta por células<br />
considera<strong>da</strong>s imuno-efetoras, as quais apresentam ativi<strong>da</strong>de fagocítica s<strong>em</strong>elhante<br />
à dos macrófagos (KANDEL, 2000) e que, portanto, realizam no SNC funções<br />
similares àquelas des<strong>em</strong>penha<strong>da</strong>s pelos macrófagos <strong>em</strong> outros órgãos, incluindo<br />
fagocitose, indução à inflamação e apresentação de antíge<strong>nos</strong>, constituindo, dessa<br />
maneira a primeira linha de defesa contra patóge<strong>nos</strong> invasores (ALOISI, 2001;<br />
CHANG et al., 2009). Estas células tanto pod<strong>em</strong> facilitar a sobrevivência dos<br />
neurônios, pela secreção de substâncias neurotróficas e ativação de astrócitos, até<br />
mesmo pela modulação de enzimas astrogliais envolvi<strong>da</strong>s no estresse oxi<strong>da</strong>tivo para<br />
aumentar a resistência destas células à tais condições (GIULIAN et al., 1994;<br />
ROOHL et al., 2008).<br />
10
Por outro lado as células microgliais também pod<strong>em</strong> estar associa<strong>da</strong>s a<br />
doenças neurodegenerativas como mal de Alzheimer, doença de Parkinson,<br />
esclerose múltipla e d<strong>em</strong>ência associa<strong>da</strong> a AIDS (DICKSON et al., 1993). Quando<br />
ativa<strong>da</strong> a microglia libera moléculas inflamatórias que pod<strong>em</strong> por sua vez ativar<br />
astrócitos dentro de minutos e que pode resultar <strong>em</strong> aumento <strong>da</strong> liberação de<br />
gliotransmissores, representando assim um passo importante na sequência inicial de<br />
acontecimentos que contribu<strong>em</strong> para a hiperexcitabili<strong>da</strong>de, excitotoxici<strong>da</strong>de,<br />
neurodegeneração e <strong>da</strong><strong>nos</strong> cerebrais (AGULHON et al., 2012).<br />
As células microgliais assum<strong>em</strong> várias aparências morfológicas que pod<strong>em</strong><br />
ser correlaciona<strong>da</strong>s a estágios funcionais distintos de repouso e ativação. A ativação<br />
<strong>da</strong> microglia t<strong>em</strong> sido caracteriza<strong>da</strong> pela modificação <strong>da</strong> morfologia, passando de<br />
uma forma ramifica<strong>da</strong> (<strong>em</strong> repouso) para uma forma amebóide (ativa<strong>da</strong>). Esta<br />
ativação também é caracteriza<strong>da</strong> pelo aumento <strong>da</strong> expressão de moléculas do<br />
sist<strong>em</strong>a principal de histocompatibili<strong>da</strong>de (MHC classe I e classe II), e de outras<br />
moléculas de m<strong>em</strong>brana como CD11B (receptor do fator 3 do sist<strong>em</strong>a compl<strong>em</strong>ento<br />
– OX-42), de forma que a imunomarcação destes receptores <strong>nos</strong> permite detectar a<br />
ativação de microglia (GEHRMANN et al., 1995; BUTOVSKY et al., 2007). Além <strong>da</strong><br />
mu<strong>da</strong>nça morfológica, a ativação microglial altera seu comportamento proliferativo e<br />
migratório, como também a produção de citocinas, tais como IL-1, IL-6, TNF-α, IFN-3<br />
e TGF-β (GEHRMANN et al., 1995) e produção de fatores neurotóxicos, como óxido<br />
nítrico (NO), que representa uma espécie reativa de oxigênio que medeia uma<br />
varie<strong>da</strong>de de funções biológicas, incluindo homeostasia vascular e<br />
neurotransmissão, mas que pode se combinar com o superóxido, produzindo<br />
peroxinitrito altamente reativo (ABBAS et al., 2003; MANNING et al., 2001;<br />
DAWSON & SNYDER 1994; SILVA et al., 2007; SILVA et al., 2008).<br />
2.3. A ação de alcaloides <strong>da</strong> Prosopis juliflora no SNC<br />
Testes com administração via oral de 62,5 mg/kg <strong>da</strong> fração de alcaloides<br />
totais de vagens <strong>em</strong> camundongos d<strong>em</strong>onstraram que os alcaloides <strong>da</strong> P. juliflora<br />
apresentam ativi<strong>da</strong>de no SNC por indução de alterações comportamentais<br />
sugestivas de um possível efeito ansiogênico (QUINTANS-JÚNIOR et al., 2004).<br />
11
Por outro lado, estudos in vitro têm d<strong>em</strong>onstrado que alcaloides, presentes<br />
nas vagens e folhas <strong>da</strong> P. juliflora apresentam ação direta <strong>em</strong> células do SNC.<br />
Dentre eles destaca-se o estudo de Hughes et al. (2005), que revelou a ação<br />
citotóxica dos mesmos, <strong>em</strong> células tumorais de orig<strong>em</strong> glial humanas, <strong>da</strong> linhag<strong>em</strong><br />
GL-15, a partir de 24 horas de exposição a um extrato de alcaloides obtido de<br />
vagens de P. juliflora, desde a concentração de 0,03 µg/mL. Este efeito foi<br />
evidenciado pela redução dose-dependente <strong>da</strong> ativi<strong>da</strong>de mitocondrial e lesão de<br />
m<strong>em</strong>brana celular, com aumento <strong>da</strong> ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> enzima lactato desidrogenase<br />
(LDH), que é essencialmente citossólica, no meio de cultura <strong>da</strong>s células, assim como<br />
pela redução <strong>da</strong> quanti<strong>da</strong>de de células capazes de excluir o corante azul de tripan,<br />
por não apresentar<strong>em</strong> a m<strong>em</strong>brana plasmática integra.<br />
Outros testes in vitro, também desenvolvidos por Hughes et. al. (2006) <strong>em</strong><br />
cultura primária de astrócitos muri<strong>nos</strong> revelaram que estas células são mais<br />
resistentes aos efeitos tóxicos do extrato bruto contendo alcaloides obtidos de<br />
vagens <strong>da</strong> P. juliflora. Este estudo d<strong>em</strong>onstrou que os alcaloides presentes no<br />
extrato total são capazes de induzir redução <strong>da</strong> ativi<strong>da</strong>de mitocondrial de astrócitos e<br />
lesão <strong>em</strong> m<strong>em</strong>brana celular, apenas <strong>em</strong> concentrações iguais ou superiores a 30<br />
µg/mL.<br />
Ain<strong>da</strong>, <strong>em</strong> um estudo desenvolvido por Silva et al. (2007), foi avaliado o efeito<br />
citotóxico do extrato alcaloi<strong>da</strong>l e de sete frações de alcaloides isolados de folhas de<br />
P. juliflora <strong>em</strong> cultura de células gliais. Observou-se que, após 24 horas de<br />
tratamento com o extrato alcaloi<strong>da</strong>l (ETA), as células apresentaram redução de<br />
ativi<strong>da</strong>de mitocondrial desde e lesão <strong>em</strong> m<strong>em</strong>brana celular desde exposição à<br />
concentração de 3 µg/mL. Por outro lado, observou-se a ativação <strong>da</strong> microglia<br />
presente nas culturas trata<strong>da</strong>s com concentrações de 30 µg/mL. Contudo, n<strong>em</strong><br />
to<strong>da</strong>s as frações de alcaloides obti<strong>da</strong>s a partir do ETA apresentaram o efeito<br />
citotóxico, similar àquele observado <strong>em</strong> células expostas ao extrato bruto. No<br />
entanto, outras frações, como as frações F29/30, F31/33, F32 e F34/35, revelaram<br />
importante ação citotóxica. A fração 32 (F32) se destacou por ser a mais citotóxica,<br />
e ain<strong>da</strong> induzir a produção de óxido nítrico (NO) <strong>em</strong> altos níveis pelas células gliais<br />
(SILVA et al., 2007).<br />
12
Considerando os aspectos toxicológicos <strong>da</strong> P. juliflora e efeitos neurotóxicos<br />
<strong>em</strong> células gliais, <strong>em</strong> especial atribuídos aos alcaloides presentes nesta planta, torna<br />
importante investigar os efeitos e mecanismos de ação de componentes alcaloi<strong>da</strong>is<br />
<strong>em</strong> sist<strong>em</strong>as mais complexos de interação de células SNC e determinação de alvos<br />
celulares.<br />
Nesse contexto, um estudo in vitro foi desenvolvido com o objetivo geral de<br />
determinar os mecanismos de citotoxici<strong>da</strong>de de extrato e fração de alcaloides<br />
extraídos de Prosopis juliflora sobre células gliais e neurais <strong>em</strong> sist<strong>em</strong>a de co-cultivo.<br />
Neste estudo foram objetivos específicos: 1) estu<strong>da</strong>r as proprie<strong>da</strong>des citotóxicas<br />
através de modificações estruturais e ultraestruturais nas células do SNC induzi<strong>da</strong>s<br />
in vitro <strong>em</strong> um sist<strong>em</strong>a de co-cultura primária de neurônios/células gliais; 2) eluci<strong>da</strong>r<br />
a resposta glial à neurotoxici<strong>da</strong>de induzi<strong>da</strong> pelos alcaloides de P. juliflora<br />
determinando ativação de astrócitos e microglia; 3) caracterizar alvos celulares de<br />
alcaloides <strong>da</strong> P. juliflora através <strong>da</strong> análise de alterações funcionais e metabólicas. O<br />
desenvolvimento deste estudo e os resultados obtidos serão apresentados <strong>nos</strong><br />
capítulos que se segu<strong>em</strong>.<br />
13
3. ARTIGO CIENTÍFICO I<br />
Alcaloides piperidínicos <strong>da</strong> Prosopis juliflora induz<strong>em</strong> <strong>da</strong>no mitocondrial e<br />
vacuolização citoplasmática <strong>em</strong> co-cultura de células gliais e neurônios.<br />
Artigo Submetido à Revista Toxicologic Pathology (SCHOLARONE)<br />
(Vide anexo)<br />
RESUMO<br />
Prosopis juliflora é um arbusto muito utilizado para consumo animal e humano. No<br />
entanto, a ingestão de suas vagens por animais induz intoxicação, que se<br />
caracteriza por alterações neuromusculares induzi<strong>da</strong>s por mecanismos que ain<strong>da</strong><br />
não são b<strong>em</strong> compreendidos. Neste estudo, foi investiga<strong>da</strong> a neurotoxici<strong>da</strong>de de um<br />
extrato alcaloi<strong>da</strong>l (ETA) e uma fração de alcaloides (F32) obti<strong>da</strong>s de folhas <strong>da</strong> P.<br />
juliflora <strong>em</strong> neurônios corticais de ratos e células gliais. Por RMN, a F32 foi<br />
caracteriza<strong>da</strong> como uma mistura dos alcaloides piperidínicos juliprosopina, como<br />
constituintes majoritários, e <strong>em</strong> menor quanti<strong>da</strong>de o alcaloide juliprosina. ETA e F32,<br />
<strong>em</strong> concentrações entre 0,3 e 45 µg/ml foram testados por 24 h <strong>em</strong> co-culturas de<br />
neurônios/células gliais. O teste de MTT revelou que ETA e F32 foram citotóxicos e<br />
os valores de EC50 foram 31,07 µg/ml e 7,36 µg/ml, respectivamente. A exposição<br />
<strong>da</strong>s células à concentrações subtóxicas (0,3-3µg/ml) induziu vacuolização,<br />
alterações fenotípicas e mu<strong>da</strong>nças ultraestruturais, caracteriza<strong>da</strong>s pela formação de<br />
vacúolos com dupla ou múltipla m<strong>em</strong>branas e <strong>da</strong><strong>nos</strong> mitocondriais. Ain<strong>da</strong> nas<br />
culturas expostas a doses subtóxicas foi observa<strong>da</strong> microgliose. Considerando que<br />
F32 foi mais citotóxica do que ETA e que esta reproduz in vitro as alterações<br />
morfológicas e ultraestruturais observa<strong>da</strong>s após o consumo <strong>da</strong> planta por bovi<strong>nos</strong> e<br />
capri<strong>nos</strong>, pod<strong>em</strong>os sugerir que os alcaloides juliprosopina e juliprosina são os<br />
responsáveis primários pelos <strong>da</strong><strong>nos</strong> neurotóxicos observados <strong>em</strong> animais<br />
intoxicados pela P. juliflora.<br />
Palavras-chave: Prosopis juliflora; alcaloides piperidínicos; neurônios; células gliais;<br />
neurotoxici<strong>da</strong>de, mitocôndria.<br />
14
Piperidine alkaloids from Prosopis juliflora induce mitochondrial <strong>da</strong>mage and<br />
cytoplasmic vacuolation on co-cultured glial cells and neurons.<br />
SUMMARY<br />
Prosopis juliflora is a shrub largely used for animal and human consumption.<br />
However, ingestion has been shown to induce intoxication in animals, which is<br />
characterized by neuromuscular alterations induced by mechanisms that are not yet<br />
well understood. In this study, we investigated the neurotoxicity of total alkaloid<br />
extract (TAE) and alkaloid fraction (F32) obtained from P. juliflora leaves on rat<br />
cortical neurons and glial cells. NMR characterization of F32 showed that it is<br />
composed by piperidine alkaloids juliprosopine, as the major constituent, and in<br />
smaller amount juliprosine. TAE and F32 at concentrations between 0.3 and 45<br />
µg/mL were tested for 24 h on neuron/glial cell primary co-cultures. MTT test<br />
revealed that TAE and F32 were cytotoxic and the EC50 values were 31.07 µg/mL<br />
and 7.36 µg/mL, respectively. Exposure to sub-toxic concentration (0.3-3 µg/mL)<br />
induced vacuolation, phenotypic changes, and ultra-structural changes,<br />
characterized by double or multi m<strong>em</strong>brane vacuoles and mitochondrial <strong>da</strong>mage.<br />
Microglial proliferation was also observed. Considering that F32 was more cytotoxic<br />
than TAE and that it reproduced in vitro the main morphologic and ultrastructural<br />
changes observed after P. juliflora consumption, we can suggest that alkaloids<br />
juliprosopine and juliprosine are the primarily responsible for the neurotoxic <strong>da</strong>mage<br />
observed in intoxicated animals.<br />
Keywords: Prosopis juliflora; piperidine alkaloids; neuron; glial cells; neurotoxicity,<br />
mitochondria.<br />
15
3.1. Introdução<br />
Espécies do gênero Prosopis origina<strong>da</strong>s <strong>da</strong> América Central, África do Sul e<br />
na Ásia foram distribuídos <strong>em</strong> torno <strong>da</strong>s regiões secas de diversas partes do mundo<br />
(BURKART, 1976). Prosopis juliflora Sw. DC (algaroba) é um arbusto que foi<br />
introduzido no nordeste do Brasil <strong>em</strong> 1940 (SPA, 1989). As vagens desta planta são<br />
ricas <strong>em</strong> carboidratos e proteínas e historicamente têm sido uma fonte importante de<br />
alimentos para as populações humanas na América do Norte e América do Sul,<br />
como farinha e outros produtos comestíveis. Atualmente a sua utilização para a<br />
produção de alimentos t<strong>em</strong> sido discuti<strong>da</strong> <strong>em</strong> outras regiões do mundo (CHOGE et<br />
al., 2007). Devido à sua resistência a condições ári<strong>da</strong>s, boa palatabili<strong>da</strong>de e valor<br />
nutricional, as vagens de P. juliflora ou o seu farelo são habitualmente utilizados<br />
para a alimentação de gado de leite e carne (SILVA, 1981). No entanto, o consumo<br />
desta planta provoca uma enfermi<strong>da</strong>de quando é a única fonte de alimento para o<br />
animal (BACA et al, 1967; DOLLAHITE & ANTHONY, 1957). A enfermi<strong>da</strong>de induzi<strong>da</strong><br />
por esta planta <strong>em</strong> animais é denomina<strong>da</strong> ''Cara torta" e caracteriza-se por<br />
<strong>em</strong>agrecimento, alterações neuromusculares (incluindo atrofia muscular dos<br />
masseteres), e lesões histológicas tais como espongiose, gliose, a per<strong>da</strong> <strong>da</strong><br />
substância de Nissl e vacuolização do pericário de neurônios do núcleo motor do<br />
nervo trigêmeo (FIGUEIREDO et al., 1995; TABOSA et al., 2000a). Alterações<br />
neuromusculares foram observa<strong>da</strong>s <strong>em</strong> capri<strong>nos</strong> e bovi<strong>nos</strong> alimentados com rações<br />
contendo altas concentrações de vagens <strong>da</strong> P. juliflora (> 50%), especialmente após<br />
exposição crônica (> 200 dias). As lesões histológicas também foram caracteriza<strong>da</strong>s<br />
por vacuolização fina do pericário de neurônios, astrócitos reativos e per<strong>da</strong> de<br />
neurônios no núcleo motor do trigêmeo (TABOSA et al., 2006). Ocasionalmente,<br />
<strong>da</strong><strong>nos</strong> <strong>em</strong> neurônios do núcleo oculomotor e degeneração walleriana <strong>nos</strong> nervos<br />
mandibulares e trigêmeos foram observados (TABOSA et al, 2000a; TABOSA et al,<br />
2006).<br />
Estudos in vitro d<strong>em</strong>onstraram que os alcaloides de vagens e folhas <strong>da</strong> P.<br />
juliflora têm uma ação direta sobre células gliais gerando efeitos tóxicos e<br />
inflamatórios e ain<strong>da</strong> suger<strong>em</strong> que os alcaloides que compõ<strong>em</strong> uma fração (F32)<br />
obti<strong>da</strong> por cromatografia <strong>em</strong> sílica gel do um extrato rico <strong>em</strong> alcaloides (extrato<br />
alcaloi<strong>da</strong>l – ETA) são os que apresentam maior potencial biológico (HUGHES et al,<br />
16
2006; SILVA et al, 2007). No entanto ain<strong>da</strong> não se sabia quais os alcaloides estão<br />
presentes na fração F32 e ain<strong>da</strong> se estes são capazes de induzir in vitro aquelas<br />
lesões neuro-histológicas e ultraestruturais visualiza<strong>da</strong>s <strong>em</strong> animais intoxicados pelo<br />
consumo <strong>da</strong> P. juliflora (TABOSA et al, 2000a; TABOSA et al, 2006; CÂMARA et al,<br />
2009).<br />
Vacuolização neuronal não é um achado específico de intoxicação por P.<br />
juliflora e ocorre <strong>em</strong> outras doenças de herbívoros provoca<strong>da</strong>s pela ingestão plantas<br />
do gênero Solanum (PIENAAR et al., 1976, MENZIES et al. 1979, BOURKE 1997,<br />
PORTER et al. 2003), Swainsona, Oxytropis, Astragalus (SUMMERS et al., 1995) e<br />
Ipomoea (VAN DER LUGT., 2002). Muitas dessas plantas, a ex<strong>em</strong>plo de Solanum<br />
fastigiatum, induz<strong>em</strong> vacúolos no citoplasma de neurônios como resultado do<br />
acúmulo de substratos não metabolizados <strong>em</strong> lisossomos, que caracteriza a doença<br />
de depósito lisossomal (DSL). Outras, como a P. juliflora, ain<strong>da</strong> que induzam a<br />
formação de vacúolos, estes últimos ain<strong>da</strong> não foram caracterizados, o que poderia<br />
constituir uma informação importante para a compreensão do mecanismo de ação<br />
dos compostos tóxicos destas plantas.<br />
Este estudo compl<strong>em</strong>enta os estudos in vitro anteriores do <strong>nos</strong>so grupo, que<br />
suger<strong>em</strong> os alcaloides como os agentes tóxicos <strong>da</strong> intoxicação animal por P.<br />
juliflora. Nós caracterizamos os alcaloides presentes na fração mais bioativa (F32)<br />
obti<strong>da</strong> de folhas <strong>da</strong> P. juliflora, e estu<strong>da</strong>mos in vitro as alterações morfológicas e<br />
ultraestruturais induzi<strong>da</strong>s por esta fração e o extrato alcaloi<strong>da</strong>l (ETA) <strong>em</strong> modelo de<br />
co-cultura primária de neurônios/células gliais.<br />
3.2. Materiais e métodos<br />
Extração e caracterização de alcaloides<br />
Folhas de P. juliflora foram colhi<strong>da</strong>s <strong>em</strong> Salvador (BA) na Escola de Medicina<br />
Veterinária e Zootecnia <strong>da</strong> Universi<strong>da</strong>de Federal <strong>da</strong> Bahia (UFBA). O extrato<br />
alcaloi<strong>da</strong>l foi obtido através do método ácido/base de extração, tal como descrito por<br />
OTT-LONGONI et al. (1980), com pequenas modificações (SILVA et al, 2007). As<br />
folhas foram secas <strong>em</strong> estufa a 50° C. Para eliminar componentes não-polares o<br />
material seco e triturado (874 g) sofreu três extrações com hexano (2,0 L/kg) durante<br />
48 h à t<strong>em</strong>peratura ambiente, ca<strong>da</strong> extração, com agitação ocasional. O extrato foi,<br />
17
<strong>em</strong> segui<strong>da</strong>, filtrado, e o resíduo foi submetido a nova extração com metanol (1,5<br />
L/kg), utilizando o mesmo processo descrito acima. O extrato metanólico foi<br />
concentrado num sist<strong>em</strong>a de evaporação rotativa a 40° C, e a este resíduo foi<br />
adicionado solução de HCl 0,2N, mantido sob agitação durante 16 h e seguido por<br />
filtração. A solução foi agita<strong>da</strong> com clorofórmio para r<strong>em</strong>over o material não-básico.<br />
Para obtenção dos constituintes nitrogenados, a cama<strong>da</strong> aquosa foi basifica<strong>da</strong> com<br />
hidróxido de amônio até atingir pH 11 e foi então extraí<strong>da</strong> com clorofórmio. A fase de<br />
clorofórmio foi evapora<strong>da</strong>, levando à produção do extrato alcaloi<strong>da</strong>l (ETA). Este<br />
extrato foi fracionado por cromatografia <strong>em</strong> coluna de sílica gel utilizando<br />
clorofórmio/ metanol (99:1 a 1:1) como fase móvel, com uma eluição subsequente<br />
<strong>em</strong> metanol a 100%. As trinta e seis frações obti<strong>da</strong>s a partir do ETA foram testa<strong>da</strong><br />
para a presença de alcaloides utilizando o teste de Dragendorf (WAGNER et al.,<br />
1983). Considerando que <strong>nos</strong>sos experimentos anteriores apontaram a F32 como a<br />
fração mais tóxica para as células <strong>da</strong> glia (SILVA et al., 2007), neste estudo<br />
investigamos o efeito citotóxico do ETA e F32 <strong>em</strong> neurônios e células gliais. Ain<strong>da</strong>,<br />
caracterizamos a composição <strong>da</strong> F32 por ressonância magnética nuclear de H1 (500<br />
MHz, CD3OD) e C13 RMN (125 MHz, CD3OD).<br />
Tratamentos<br />
Para os tratamentos, o ETA e a F32 foram dissolvidos <strong>em</strong> dimetilsulfóxido<br />
(DMSO, Sigma, St. Louis, MO), para gerar soluções de estoque <strong>em</strong> concentrações<br />
de 30 mg/mL, que foram armazena<strong>da</strong>s a -20° C. As células foram trata<strong>da</strong>s com<br />
concentrações variando entre 0,3 - 45 µg/mL, durante 24 h. O grupo de controlo<br />
negativo foi tratado com DMSO diluído <strong>em</strong> meio de cultura, considerando o maior<br />
volume equivalente usado <strong>nos</strong> grupos tratados (0,1%) e não mostrou nenhum efeito<br />
significativo <strong>nos</strong> parâmetros analisados <strong>em</strong> comparação com células que não<br />
receberam o diluente.<br />
Culturas de células<br />
As culturas celulares foram prepara<strong>da</strong>s a partir de h<strong>em</strong>isférios cerebrais de<br />
ratos Wistar, obtidos junto ao Departamento de Biorregulação do Instituto de<br />
<strong>Ciência</strong>s <strong>da</strong> Saúde <strong>da</strong> Universi<strong>da</strong>de Federal <strong>da</strong> Bahia (Salvador, BA, Brasil) e<br />
realiza<strong>da</strong> de acordo com o Comitê Local de Ética <strong>em</strong> Experimentação <strong>Animal</strong>.<br />
18
Co-culturas primárias de neurônios/células gliais<br />
Culturas primárias <strong>da</strong>s células <strong>da</strong> glia foram prepara<strong>da</strong>s de acordo com<br />
método descrito por COOKSON & PENTREATH (1994). Resumi<strong>da</strong>mente, os<br />
h<strong>em</strong>isférios cerebrais de crias de ratos Wistar de um dia de i<strong>da</strong>de pós-natal foram<br />
isolados assepticamente e as meninges foram r<strong>em</strong>ovi<strong>da</strong>s com auxilio de lupa para<br />
posterior dissecção do tecido cortical. Em segui<strong>da</strong>s, as células foram suspensas <strong>em</strong><br />
meio DMEM/HAM-F12 (Cultilab, SP, Brasil), supl<strong>em</strong>entado com 100 UI/mL de<br />
penicilina G, estreptomicina 100 µg/mL, 2 mM de L-glutamina, 0,011 g/L de piruvato,<br />
10% de SFB, 3,6 mg/L Hepes e 33 mM de glicose (Cultilab, SP, Brasil) e cultiva<strong>da</strong>s<br />
<strong>em</strong> placas de 100 milímetros Ø <strong>em</strong> uma atmosfera úmi<strong>da</strong> com 5% de CO2 a 37° C.<br />
O meio de cultura foi mu<strong>da</strong>do a ca<strong>da</strong> dois dias, e as células foram cultiva<strong>da</strong>s durante<br />
15 dias, para ser<strong>em</strong> então tripsiniza<strong>da</strong>s (tripsina-EDTA) e plaquea<strong>da</strong>s a uma<br />
densi<strong>da</strong>de de 670 células/mm 2 e mantidos por 48 h <strong>em</strong> uma atmosfera úmi<strong>da</strong> com<br />
5% de CO2 a 37° C para estabilização <strong>da</strong> cultura. Neste momento, neurônios de<br />
h<strong>em</strong>isférios cerebrais de <strong>em</strong>briões de ratos Wistar com 15-18 dias de i<strong>da</strong>de<br />
gestacional, foram obtidos através do mesmo método descrito acima para a cultura<br />
<strong>da</strong> glia. As células neuronais <strong>em</strong> suspensão no meio DMEM/HAM-F12<br />
supl<strong>em</strong>entado foram s<strong>em</strong>ea<strong>da</strong>s sobre a monocama<strong>da</strong> astroglial numa proporção de<br />
1:2 células gliais (335 células/mm 2 ). As células gliais e neuronais juntas foram<br />
incuba<strong>da</strong>s <strong>em</strong> atmosfera úmi<strong>da</strong> com 5% de CO2 a 37° C durante 8 dias, quando os<br />
tratamentos foram realizados.<br />
Viabili<strong>da</strong>de celular - Curvas de dose-resposta<br />
Curvas de dose-resposta foram alcança<strong>da</strong>s pelo teste do brometo de 3-(4,5-<br />
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT, Sigma, St. Louis, MO). O experimento foi<br />
realizado <strong>em</strong> placas de 96 poços (TPP Suíça) com co-culturas de neurônios/células<br />
gliais. As células foram incuba<strong>da</strong>s com 1,5 - 45 µg/mL de ETA, F32 ou 0,1% de<br />
DMSO (controle) durante 24 h. A viabili<strong>da</strong>de celular foi quantifica<strong>da</strong> pelo índice de<br />
conversão do MTT (cor amarela) por desidrogenases mitocondriais de células vivas<br />
a formazan (cor púrpura) (HANSEN et al., 1989). As células <strong>em</strong> condições controle e<br />
trata<strong>da</strong>s foram incuba<strong>da</strong>s com MTT a uma concentração final de 1 mg/mL, durante 2<br />
h. Em segui<strong>da</strong>, as células foram lisa<strong>da</strong>s com 20% (peso/volume) de dodecil sulfato<br />
de sódio (SDS) e 50% (v/v) de dimetilformami<strong>da</strong> (DMF) (pH 4,7). As placas foram<br />
incuba<strong>da</strong>s durante a noite a 37º C para dissolver os cristais de formazan. A<br />
19
densi<strong>da</strong>de óptica de ca<strong>da</strong> amostra foi medi<strong>da</strong> a 492 nm utilizando um<br />
espectrofotómetro (Thermo-Plate Reader). Três experimentos independentes foram<br />
realizados com oito poços duplicados para ca<strong>da</strong> análise. Os resultados do teste de<br />
MTT foram expressos como percentuais de viabili<strong>da</strong>de dos grupos tratados <strong>em</strong><br />
comparação com os grupos controle. A regressão não linear foi realiza<strong>da</strong> usando o<br />
software Graphpad Prism 3.0, para realização de análises estatísticas e para<br />
calcular a EC50 do ETA e F32, que representam as concentrações eficazes para<br />
matar 50% <strong>da</strong>s células.<br />
Analise de alterações morfológicas<br />
Coloração de Rosenfeld<br />
Alterações morfológicas e vacuolização foram primeiramente avalia<strong>da</strong>s por<br />
coloração de Rosenfeld. O experimento foi realizado <strong>em</strong> placas de 3,5 Ø (TPP<br />
Suíça). As células foram lava<strong>da</strong>s três vezes com PBS e fixa<strong>da</strong>s durante 10 min com<br />
metanol a -20° C. As células fixas foram então cora<strong>da</strong>s. Para tanto, o reagente de<br />
Rosenfeld (1 mL) foi adicionado e incubado durante 20 min à t<strong>em</strong>peratura ambiente.<br />
Em segui<strong>da</strong>, as placas foram lava<strong>da</strong>s com água, secas ao ar, analisa<strong>da</strong>s num<br />
microscópio óptico (Olympus BX70) e fotografa<strong>da</strong>s utilizando uma câmara digital (CE<br />
Roper Scientific). A vacuolização foi quantifica<strong>da</strong> <strong>em</strong> dez campos fotografados,<br />
conforme predeterminação que os astrócitos com mais de 10 vacúolos no<br />
citoplasma eram considerados <strong>em</strong> processo de vacuolização (ISOBE et al., 2003).<br />
Imunocitoquímica<br />
Alterações morfológicas <strong>em</strong> astrócitos e neurónios foram também estu<strong>da</strong><strong>da</strong>s<br />
por imunocitoquímica para as proteínas do citoesqueleto, GFAP e βIII-tubulina,<br />
respectivamente. Células <strong>em</strong> condições controle e trata<strong>da</strong>s foram s<strong>em</strong>ea<strong>da</strong>s <strong>em</strong><br />
placas de 3,5 Ø (TPP Suíça) e após tratamento de 24h foram lava<strong>da</strong>s três vezes<br />
com PBS e fixa<strong>da</strong>s com metanol frio a -20 º C durante 10 minutos. A ligação não<br />
específica do anticorpo foi bloquea<strong>da</strong> por pré-incubação <strong>da</strong>s placas com 3% de<br />
albumina de soro bovino (BSA) <strong>em</strong> PBS. Para marcação de neurônios, as células<br />
foram incuba<strong>da</strong>s com anticorpo monoclonal de camundongo anti-βIII-tubulina<br />
conjugado com CY3, por 2h (1:500 <strong>em</strong> PBS, Sigma, EUA). E para marcação de<br />
astrócitos, as células foram incuba<strong>da</strong>s com anticorpo policlonal de coelho anti-GFAP<br />
(1:100 <strong>em</strong> PBS, DAKO, EUA) overnight e, <strong>em</strong> segui<strong>da</strong>, incuba<strong>da</strong>s com anticorpo de<br />
20
cabra anti-IgG de coelho conjugado com isotiocianato de tetrametilro<strong>da</strong>mina (1:250<br />
<strong>em</strong> PBS, Sigma) durante 30 min à t<strong>em</strong>peratura ambiente. A cromatina nuclear <strong>da</strong>s<br />
células fixa<strong>da</strong>s foram cora<strong>da</strong>s com o corante fluorescente DAPI, a uma<br />
concentração final de 5 µg/mL <strong>em</strong> PBS, durante 10 min à t<strong>em</strong>peratura ambiente <strong>em</strong><br />
câmara escura. Em segui<strong>da</strong>, as células foram analisa<strong>da</strong>s por microscopia de<br />
fluorescência (Olympus BX70) e fotografa<strong>da</strong>s utilizando uma câmara digital (CE<br />
Roper Scientific).<br />
Para identificar microglia ativa<strong>da</strong> <strong>em</strong> células fixa<strong>da</strong>s foi realiza<strong>da</strong><br />
imunocitoquímica para OX-42 (CD11b) antes <strong>da</strong> coloração de Rosenfeld. Primeiro, a<br />
ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> peroxi<strong>da</strong>se endógena foi bloquea<strong>da</strong> durante 10 minutos com peróxido<br />
de hidrogênio a 3%. A co-cultura foi incuba<strong>da</strong> durante 1 h com o anticorpo<br />
monoclonal de camundongo anti OX-42 (CD11b/c (1:200), Caltag, Burlingame, CA).<br />
As células foram então incuba<strong>da</strong>s com anticorpo de cabra anti-IgG de camundongo<br />
conjugado com peroxi<strong>da</strong>se (1:1000, Sigma) durante 1 h. As células microgliais foram<br />
identifica<strong>da</strong>s pela cor castanho após a incubação com o substrato, 0,3% de 4-Cl-<br />
alfanaftol/solução de metanol diluído <strong>em</strong> tampão PBS (1:5) mais H2O2 (0,33 mL/mL),<br />
à t<strong>em</strong>peratura ambiente durante 30 min. E após coloração de Rosenfeld as mesmas<br />
foram identifica<strong>da</strong>s com uma cor preta. Estas células foram analisa<strong>da</strong>s (Olympus<br />
BX70) e fotografa<strong>da</strong>s (CE Roper Scientific) num microscópio de fase óptica de luz<br />
utilizando uma câmara digital. O número de células imunorreactivas foram conta<strong>da</strong>s<br />
sob o microscópio usando 20X de ampliação num campo 0,29 mm 2 . Dez campos<br />
representativos aleatorizados foram analisados, e a proporção de células OX-42-<br />
positivas foi apresenta<strong>da</strong> como a percentag<strong>em</strong> de células marca<strong>da</strong>s entre o número<br />
total de células conta<strong>da</strong>s.<br />
Ensaio de proteína e western blot<br />
A expressão de GFAP foi investiga<strong>da</strong> por Western blot e imunodetecção.<br />
Após o tratamento, as células foram lava<strong>da</strong>s duas vezes com PBS, lisa<strong>da</strong>s e<br />
coleta<strong>da</strong>s <strong>em</strong> 2% (peso/volume) de SDS, 2 mmol/L de EGTA, 4 mol/L de ureia, 0,5%<br />
(v/v) de Triton X-100, e 62,5 mmol/L Tris-HCl (pH 6,8) supl<strong>em</strong>entado com 0,1% (v/v)<br />
de um coquetel de inibidores de protease (Sigma). O teor de proteína total foi<br />
determinado através de um método de LOWRY et al. (1951) a<strong>da</strong>ptado <strong>em</strong> kit de<br />
reagente de proteína (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Para este ensaio, 50 µg de<br />
21
proteínas totais, prepara<strong>da</strong> conforme descrito acima, foi deposita<strong>da</strong> <strong>em</strong> gel de<br />
<strong>em</strong>pilhamento a 4% de poliacrilami<strong>da</strong> e corrido <strong>em</strong> gel a 8% de poliacrilami<strong>da</strong>. A<br />
eletroforese foi realiza<strong>da</strong> a 200 V durante 45 min. As proteínas foram então<br />
transferi<strong>da</strong>s para uma m<strong>em</strong>brana de fluoreto de polivinilideno (PVDF, Immobilon-P,<br />
Millipore), a 100 V durante 1 h. A padronização na quanti<strong>da</strong>de de proteína<br />
deposita<strong>da</strong> foi confirma<strong>da</strong> por coloração <strong>da</strong>s m<strong>em</strong>branas com vermelho Ponceau<br />
(Sigma). Em segui<strong>da</strong>, as m<strong>em</strong>branas foram bloquea<strong>da</strong>s durante 1 h à t<strong>em</strong>peratura<br />
ambiente, <strong>em</strong> 20 mmol/l Tris-solução salina tampona<strong>da</strong> (pH 7,5), contendo 0,05% de<br />
Tween 20 (TBS-T) e 5% de leite desnatado <strong>em</strong> pó. Subsequent<strong>em</strong>ente, as<br />
m<strong>em</strong>branas foram incuba<strong>da</strong>s com anticorpo de coelho anti-GFAP (1:5000, DAKO,<br />
EUA), diluído <strong>em</strong> TBS-T contendo 1% de leite desnatado <strong>em</strong> pó, durante a noite. Em<br />
sequencia foram lava<strong>da</strong>s com TBS-T e incuba<strong>da</strong>s anticorpo secundário de cabra<br />
anti-IgG de coelho conjugado com fosfatase alcalina (1:5000 <strong>em</strong> TBS-T, Bio-Rad).<br />
Ban<strong>da</strong>s imunorreativas foram visualiza<strong>da</strong>s utilizando o kit de substrato de AP-<br />
conjugado (Bio-Rad), de acordo com as instruções do fabricante.<br />
Dosag<strong>em</strong> de nitrito<br />
A produção de óxido nítrico (NO) foi avalia<strong>da</strong> como o acúmulo de nitrito no<br />
meio de cultura por meio de teste colorimétrico, que envolve o uso do reagente de<br />
Griess (WANG et al., 2002). Amostras (50 µL) foram recolhi<strong>da</strong>s após 24 horas de<br />
tratamento. Volumes iguais de sobrena<strong>da</strong>nte de cultura e de reagente de Griess<br />
(sulfanilami<strong>da</strong> 1%, 0,1% de N-(1-naftil)-etileno diamina, ácido fosfórico a 2%) foram<br />
misturados. A mistura foi incuba<strong>da</strong> durante 10 min à t<strong>em</strong>peratura ambiente, e a<br />
absorvância a 560 nm foi medi<strong>da</strong> num leitor de microplacas (Thermo Placa TP-<br />
Reader). As concentrações de nitrito nas amostras foram determina<strong>da</strong>s com base<br />
numa curva padrão de nitrito de sódio (NaNO2, 1,26-100 pg/mL).<br />
Análise ultraestrutural do citoplasma<br />
Alterações ultraestruturais foram avalia<strong>da</strong>s por microscopia eletrônica de<br />
transmissão. O experimento foi realizado <strong>em</strong> placas de 3,5 Ø (TPP Switzerland) com<br />
co-culturas de neurônios/ células gliais incuba<strong>da</strong>s com 3 µg/mL de ETA, F32 ou<br />
0,1% de DMSO. As células foram fixa<strong>da</strong>s com glutaraldeído a 2,5% (Sigma.) <strong>em</strong> 0,1<br />
M de tampão de cacodilato (pH 7,2) durante duas horas à t<strong>em</strong>peratura ambiente, e<br />
lava<strong>da</strong>s <strong>em</strong> tampão de cacodilato 0,1 M e pós-fixa<strong>da</strong>s com tetróxido de ósmio a 1%<br />
22
e ferrocianeto de potássio a 0,8% e 5 mM de CaCl2 no mesmo tampão durante 1 h à<br />
t<strong>em</strong>peratura ambiente. As células foram então raspa<strong>da</strong>s, desidrata<strong>da</strong>s numa série<br />
de soluções de acetona e <strong>em</strong>bebi<strong>da</strong>s <strong>em</strong> resina Polybed. Cortes fi<strong>nos</strong> foram corados<br />
com acetato de uranila e citrato de chumbo e observa<strong>da</strong>s <strong>em</strong> um microscópio<br />
eletrônico de transmissão Zeiss EM109.<br />
Análise estatística<br />
Os resultados são expressos <strong>em</strong> média ± desvio-padrão. One-way ANOVA<br />
seguido pelo pós-teste de Student-Newmann-Keuls para determinar as diferenças<br />
estatísticas entre os grupos que difer<strong>em</strong> <strong>em</strong> apenas um parâmetro. Teste t de<br />
Student foi utilizado para as comparações entre dois grupos. Valores de p
Curvas de dose-resposta<br />
Os efeitos tóxicos de ETA e F32 obtidos a partir de folhas de P. juliflora sobre<br />
a viabili<strong>da</strong>de <strong>da</strong>s células foram avaliados por teste MTT, que mede a redução do sal<br />
de tetrazólio (MTT) a formazan de cor púrpura pelas enzimas desidrogenases de<br />
células vivas. Depois de vinte e quatro horas de exposição a 1,5 - 45 µg/ml de ETA<br />
ou F32 <strong>em</strong> co-culturas de neurónios/ células gliais foi visualiza<strong>da</strong> uma diminuição<br />
dose-dependente <strong>da</strong> ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong>s desidrogenases (Figura 2). As concentrações<br />
inibitórias médias (valores de EC50) foram 31,07 µg/mL (ETA) e 7,36 µg /mL (F32).<br />
Para tornar possível a análise de alterações morfológicas e ultraestruturais,<br />
utilizaram-se doses subtóxica (1,5 µg/mL e 3 µg/mL) para a realização dos d<strong>em</strong>ais<br />
testes.<br />
Efeito dos alcaloides sobre morfologia <strong>da</strong>s células <strong>da</strong> glia e neuronal.<br />
Para investigar os efeitos dos alcaloides <strong>da</strong> P. juliflora sobre a morfologia<br />
celular, coloração de Rosenfeld e imunocitoquímicas para GFAP, βIII-tubulina e OX-<br />
42 foram realiza<strong>da</strong>s <strong>em</strong> co-culturas de neurônios/células gliais. A coloração de<br />
Rosenfeld nas células <strong>em</strong> condições controle revelou neurônios homogeneamente<br />
distribuídos ao longo <strong>da</strong> monocama<strong>da</strong> densa de astrócitos, com estes apresentando<br />
um fenótipo plano/poligonal (Fig. 3 A). Em culturas expostas a 1,5 µg/mL de ETA, a<br />
rede de neuritos foi manti<strong>da</strong>, mas alguns astrócitos apresentaram vacuolização<br />
citoplasmática (Fig. 3 B). No entanto, <strong>em</strong> culturas expostas a 3 µg/ml de ETA, a<br />
proporção de astrócitos com vacuolização citoplasmática aumentou<br />
significativamente (Fig. 3 C e G), com a redução <strong>da</strong> integri<strong>da</strong>de <strong>da</strong> rede de neuritos,<br />
alguns astrócitos gigantes também foram observados. A exposição de células a 1,5<br />
µg/mL de F32 foi suficiente para perturbar a monocama<strong>da</strong> de astrócitos e a rede de<br />
neuritos. Vacuolização citoplasmática intensa <strong>nos</strong> astrócitos e vacúolos <strong>em</strong> neurites<br />
também foram observa<strong>da</strong>s (Fig. 3 D, E e H). Estes efeitos foram amplificados <strong>em</strong><br />
culturas trata<strong>da</strong>s com 3 µg/mL de F32 (Fig. 3 F e H), no entanto, nesta concentração<br />
adota<strong>da</strong> não foi possível quantificar os astrócitos <strong>em</strong> processo de vacuolização,<br />
devido a pouca quanti<strong>da</strong>de de células aderentes nesta condição de tratamento.<br />
Culturas analisa<strong>da</strong>s por imunocitoquímica para a GFAP, proteína do<br />
citoesqueleto de astrócitos, mostraram uma monocama<strong>da</strong> de células grandes com<br />
24
morfologia plana/poligonal, com estas proteínas distribuí<strong>da</strong>s ao longo dos corpos<br />
celulares (Fig. 4). No entanto, mu<strong>da</strong>nças na morfologia dos astrócitos foram apenas<br />
observados <strong>em</strong> culturas trata<strong>da</strong>s com 3 µg/mL de F32. Nestas condições, os<br />
astrócitos r<strong>em</strong>anescentes apresentaram fi<strong>nos</strong> e multipolares filamentos positivos<br />
para GFAP (Fig. 4 C), sugerindo a ativação de astrócitos. Análises por western blot<br />
revelaram que os níveis de GFAP <strong>em</strong> condições controle e culturas trata<strong>da</strong>s com 1,5<br />
- 3 µg/mL de ETA e 1,5 µg/mL de F32 permaneceram s<strong>em</strong>elhantes, como<br />
determinado por uma ban<strong>da</strong> imunorreativa de 49kDa. No entanto, <strong>em</strong> culturas<br />
expostas a 3 µg/mL de F32, uma mu<strong>da</strong>nça no padrão de migração <strong>da</strong> GFAP foi<br />
observa<strong>da</strong>. A GFAP apareceu como uma ban<strong>da</strong> de proteína prolonga<strong>da</strong> de pesos<br />
moleculares muito s<strong>em</strong>elhantes, sugerindo uma degra<strong>da</strong>ção desta proteína (Fig. 4<br />
C).<br />
As análises realiza<strong>da</strong>s por imunocitoquímica para βIII-tubulina revelaram que<br />
os neurônios exibiram polimerização disfuncional desta proteína <strong>em</strong> culturas<br />
trata<strong>da</strong>s com 3 µg/mL de F32, quando compara<strong>da</strong>s com células <strong>em</strong> condições<br />
controle que apresentaram a expressão desta proteína por todo o corpo celular e<br />
neuritos (Fig. 5).<br />
Poucas células microgliais ativa<strong>da</strong>s marca<strong>da</strong>s para OX-42 (1,3%) apareceram<br />
como pequenas células redon<strong>da</strong>s, de cor preta <strong>em</strong> condições de controle (Fig. 6 A).<br />
No entanto, a exposição a 1,5 - 3 µg/mL de ETA ou F32 aumentou a proporção de<br />
células microgliais OX-42-positivas <strong>em</strong> até cinco vezes (Fig. 6 BE). Em condições<br />
controle, o sobrena<strong>da</strong>nte do meio de culturas trata<strong>da</strong>s com veículo DMSO (0,1%)<br />
mostraram níveis baixos de nitrito: 35,5 ± 4,5 pg/mL. O sobrena<strong>da</strong>nte do meio de<br />
culturas trata<strong>da</strong>s com 1,5 µg/mL de ETA, 3 µg/mL de ETA ou 1,5 µg/mL de F32<br />
apresentaram níveis s<strong>em</strong>elhantes de nitrito, com valores de 31,3 ± 6,3; 34,7 ± 4,3 e<br />
36,1 ± 3,6, respectivamente (Fig. 7). No entanto, a exposição <strong>da</strong>s células a 3 µg/mL<br />
de F32 induziu um aumento significativo no nível de nitrito <strong>em</strong> meio de cultura, para<br />
44,9 ± 4,8 pg/mL (Fig. 7 B).<br />
Análise ultraestrutural do citoplasma<br />
A análise ultraestrutural revelou que as células <strong>em</strong> condições controle (DMSO<br />
a 0,1%) (Fig. 8 A) apresentaram uma morfologia normal do citoplasma, mitocôndrias<br />
25
e núcleos. No entanto, as células trata<strong>da</strong>s durante 24 h com 3 µg/mL de ETA<br />
apresentaram alterações na morfologia e tamanho mitocondrial. Estas alterações na<br />
morfologia mitocondrial foram sugestivas de uma fusão mitocondrial. Além disso, as<br />
células trata<strong>da</strong>s durante 24 h com 3 µg/mL de F32, apresentaram mitocôndrias com<br />
cristas desintegra<strong>da</strong>s, e vacúolos citoplasmáticos caracterizados por dupla ou<br />
multim<strong>em</strong>branas. Estas morfologias dos vacúolos citoplasmáticos foram sugestivas<br />
de um processo autofágico (Fig. 8B e C).<br />
3.4. Discussão<br />
Em <strong>nos</strong>sos estudos anteriores, d<strong>em</strong>onstramos que o extrato alcaloi<strong>da</strong>l (ETA)<br />
e algumas frações de alcaloides <strong>da</strong>s folhas de Prosopis juliflora foram citotóxicas e<br />
induziram ativação de células gliais <strong>em</strong> culturas primárias (SILVA et al., 2007). As<br />
células <strong>da</strong> glia têm funções importantes que impactam na saúde e integri<strong>da</strong>de de<br />
células neuronais (COYLE & SCHWARCZ, 2000). Considerando-se ca<strong>da</strong> vez mais<br />
evidências de que os astrócitos e microglia des<strong>em</strong>penham papéis importantes na<br />
fisiologia do sist<strong>em</strong>a nervoso central e <strong>nos</strong> mecanismos <strong>da</strong> patogênese de várias<br />
doenças neurológicas (CHANG et al., 2000, GEBICKE-HAERTER, 2001 e CHANG<br />
et al., 2009), é importante investigar as reações de células gliais que interag<strong>em</strong> com<br />
os neurônios a vários estímulos, incluindo agentes químicos. Neste estudo,<br />
investigamos os efeitos do ETA e <strong>da</strong> fração de alcaloides mais citotóxica para as<br />
células <strong>da</strong> glia (fração F32, para revisão ver SILVA et al., 2007) <strong>em</strong> um sist<strong>em</strong>a de<br />
neurônio/células gliais <strong>em</strong> um sist<strong>em</strong>a de co-cultivo para induzir e caracterizar<br />
alterações morfológicas e ultra-estruturais visualiza<strong>da</strong>s <strong>em</strong> células do sist<strong>em</strong>a<br />
nervoso central na ¨Doença <strong>da</strong> cara torta¨. A caracterização <strong>da</strong> F32 por RMN<br />
mostrou que esta fração é composta por uma mistura de dois alcaloides<br />
juliprosopina, como constituinte majoritário, e <strong>em</strong> menor quanti<strong>da</strong>de juliprosina. Em<br />
uma investigação fitoquímica <strong>da</strong>s vagens de Prosopis juliflora cultiva<strong>da</strong>s na região<br />
s<strong>em</strong>iári<strong>da</strong> do Estado <strong>da</strong> Paraíba do Brasil, TABOSA et al. (2000b) observaram que a<br />
ativi<strong>da</strong>de tóxica, observa<strong>da</strong> <strong>em</strong> animais de laboratório, é quimicamente relaciona<strong>da</strong><br />
com os alcaloides piperidínicos juliprosopina e juliprosina.<br />
Em <strong>nos</strong>so estudo, as concentrações citotóxicas de ETA e F32 <strong>em</strong> co-culturas<br />
de neurônios/células gliais foram determina<strong>da</strong>s pelo teste de MTT. O brometo de 3-<br />
(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio é um sal de tetrazólio solúvel <strong>em</strong> água, o<br />
26
qual é convertido para formazan insolúvel de cor púrpura pela clivag<strong>em</strong> do anel de<br />
tetrazólio pela enzima succinato desidrogenase no interior <strong>da</strong> mitocôndria de células<br />
saudáveis (MOSMAN, 1983, SHEARMAN et al., 1995). Evidências mais recentes<br />
suger<strong>em</strong> que a redução de MTT pode também ser media<strong>da</strong> por succinato, NADH ou<br />
NADPH como substrato no interior <strong>da</strong>s células e fora <strong>da</strong> mitocôndria (Berridge e Tan,<br />
1993). Observou-se pelo teste de MTT, que após 24 h de exposição a baixas<br />
concentrações de alcaloides <strong>da</strong> F32 e ETA (3 µg/mL), estas não foram suficientes<br />
para reduzir a ativi<strong>da</strong>de de desidrogenases no sist<strong>em</strong>a de cultura adotado. No<br />
entanto, esta concentração subtóxica induziu distúrbios mitocondriais visualizados<br />
por microscopia eletrônica. Pelo teste MTT, apenas concentrações mais eleva<strong>da</strong>s de<br />
F32 (7,5 µg/ml) e ETA (30 µg/ml) d<strong>em</strong>onstraram induzir redução <strong>da</strong> ativi<strong>da</strong>de <strong>da</strong><br />
succinato desidrogenase.<br />
Vacuolização citoplasmática após a exposição a uma varie<strong>da</strong>de de produtos<br />
químicos e substâncias bioativas t<strong>em</strong> sido extensivamente relata<strong>da</strong> (para revisão ver<br />
AKI et al., 2012). Observou-se também, após coloração com Rosenfeld, que a<br />
exposição de neurônios e células gliais aos alcaloides induziu <strong>em</strong> astrócitos<br />
mu<strong>da</strong>nças estruturais e vacuolização dose-dependente do citoplasma. Além disso,<br />
uma perturbação na rede de neuritos e vacuolização intensa <strong>em</strong> neuritos foram<br />
observa<strong>da</strong>s. No campo <strong>da</strong> patologia celular, deteriorações celulares caracteriza<strong>da</strong>s<br />
por vacuolização citoplasmática são chama<strong>da</strong>s degenerações vacuolares (COTRAN<br />
et al., 1999), e a vacuolização induzi<strong>da</strong> por alcaloides de P. juliflora <strong>em</strong> co-cultura de<br />
neurônios/células gliais pod<strong>em</strong> ser um tipo de degeneração vacuolar. S<strong>em</strong>elhantes<br />
alterações morfológicas <strong>em</strong> células do sist<strong>em</strong>a nervoso central foram relata<strong>da</strong>s <strong>em</strong><br />
ingestão experimental e espontânea de P. juliflora por bovi<strong>nos</strong>. Tabosa et al. (2006)<br />
e Câmara et al. (2009) observaram gliose, vacuolização e per<strong>da</strong> neuronal <strong>em</strong><br />
núcleos motor do nervo trigêmeo e outros núcleos de nervos crania<strong>nos</strong> como as<br />
principais lesões histológicas após intoxicação P. juliflora.<br />
Autolisossomos não são vacúolos ver<strong>da</strong>deiros, que às vezes se expand<strong>em</strong><br />
para encher o citoplasma e, portanto, muitas vezes são referidos como vacúolos<br />
autofágicos, que pod<strong>em</strong> ser observados sob microscopia de fase (AKI et al., 2012).<br />
A análise ultraestrutural sugere a formação de vacúolos autofágico nas células<br />
trata<strong>da</strong>s durante 24 h com 3 µg/mL de F32. A autofagia é um processo pelo qual há<br />
27
a degra<strong>da</strong>ção intracelular de proteínas, e <strong>em</strong> que organelas citoplasmáticas são<br />
degra<strong>da</strong><strong>da</strong>s e recicla<strong>da</strong>s através de lisossomos. Ela des<strong>em</strong>penha um papel<br />
importante na eliminação <strong>da</strong>s organelas <strong>da</strong>nifica<strong>da</strong>s, tais como mitocôndrias e pode<br />
constituir um mecanismo de proteção contra a morte celular programa<strong>da</strong> induzi<strong>da</strong><br />
por disfunção mitocondrial <strong>em</strong> células neuronais (PARIS et al, 2011). Além disso, as<br />
células trata<strong>da</strong>s durante 24 h com 3 µg/ml de F32 apresentaram mitocôndrias com<br />
cristas desintegra<strong>da</strong>s. No entanto, as células trata<strong>da</strong>s durante 24 h com 3 µg/ml de<br />
ETA apresentaram alterações na morfologia mitocondrial que sugeriam uma fusão<br />
mitocondrial, que caracteriza a combinação de duas mitocôndrias <strong>em</strong> uma única<br />
organela (ARDUINO et al., 2011). Estudos indicam que a fusão está relaciona<strong>da</strong> a<br />
mu<strong>da</strong>nças na função mitocondrial, e protege a mitocôndria <strong>da</strong> degra<strong>da</strong>ção<br />
autofagossomal (ARDUINO et al, 2011; RAMBOLD et al, 2011).<br />
Filamentos intermediários (FI) são estruturas que, <strong>em</strong> conjunto com os<br />
microtúbulos e microfilamentos, formam o citoesqueleto, que está presente <strong>em</strong><br />
quase to<strong>da</strong>s as células eucarióticas. A principal proteína FI dos astrócitos é proteína<br />
ací<strong>da</strong> fibrilar glial (GFAP). Estudos recentes revelaram a presença de múltiplas<br />
isoformas de GFAP, que pod<strong>em</strong> ser diferencialmente expressas <strong>em</strong> astrócitos<br />
reativos e astrócitos <strong>em</strong> repouso (para revisão ver LIEM & MESSING, 2009).<br />
Alterações na expressão de GFAP indicam a reativi<strong>da</strong>de astroglial (astrogliose). Os<br />
astrócitos reagiram à dose mais eleva<strong>da</strong> testa<strong>da</strong> do F32 (3 µg/mL) para a análise <strong>da</strong><br />
expressão desta proteína, com uma forte retração do corpo celular e <strong>em</strong>issão de<br />
processos de fina espessura e ramificados. Este fenômeno foi associado com o<br />
aparecimento de duas ban<strong>da</strong>s imunorreativas-GFAP (como revelado por western<br />
blot), sugerindo instabili<strong>da</strong>de proteica. Em <strong>nos</strong>sos estudos anteriores, <strong>em</strong> culturas de<br />
células <strong>da</strong> glia, observou-se que os astrócitos expostos a 3 µg/mL de ETA<br />
desenvolveram corpos celulares compactos, com muitos processos super-<br />
expressando GFAP, mas a exposição a 3 µg/mL de F32 induziu ruptura na<br />
expressão <strong>da</strong> GFAP (SILVA et al., 2007) . Embora um aumento na produção de<br />
GFAP possa ser um sinal de astrogliose reativa a lesão, e até mesmo a<br />
neurodegeneração (COSTA et al 2002; COYLE & SCHWARCZ, 2000, TARDY,<br />
1991), uma redução <strong>nos</strong> seus níveis pod<strong>em</strong> significar sinaptogénese ou<br />
neurotransmissão anormal (O ' CALLAGHAN, 1991; RAJKOWSKA et al., 2002).<br />
28
Exposição de co-culturas de neurônios/células gliais a alcaloides <strong>da</strong> P. juliflora<br />
induziu perturbação <strong>da</strong> monocama<strong>da</strong> de astrócitos e <strong>da</strong> rede de neuritos, e ain<strong>da</strong><br />
intensa vacuolização <strong>em</strong> ambos os tipos de células. Estes fenôme<strong>nos</strong> também foram<br />
associados com alterações na expressão de βIII-tubulina, o principal componente do<br />
citoesqueleto neuronal. Interrupções na marcação <strong>da</strong> βIII-tubulina foram tipicamente<br />
observa<strong>da</strong>s <strong>em</strong> culturas expostas a 3 µg/mL de F32, sugerindo uma falha na<br />
polimerização desta proteína dos neurônios, um fenômeno que pode estar<br />
associado com a vacuolização. Estudos publicados refer<strong>em</strong> que os astrócitos são<br />
capazes de produzir moléculas que afetam o crescimento axonal, tal como o<br />
componente de matriz extracelular laminina. Além disso, intervenções na integri<strong>da</strong>de<br />
de astrócitos e astrogliose afetam neuritos (COSTA et al, 2002; NONES et al, 2010;<br />
TARDY, 2002). A resposta dos astrócitos a alcaloides de P. juliflora, caracteriza<strong>da</strong><br />
por alterações na morfologia e na expressão de GFAP, pode estar associa<strong>da</strong> a<br />
alterações na expressão de βIII-tubulina e na integri<strong>da</strong>de <strong>da</strong> rede de neurites.<br />
A microglia representa o conjunto de células imunes residentes no cérebro,<br />
que funcionam de forma s<strong>em</strong>elhante aos macrófagos de tecidos de outros órgãos,<br />
servindo como fagócitos (quando requisitados) e que constitu<strong>em</strong> a primeira linha de<br />
defesa contra os agentes patogênicos invasores e outros insultos (STREIT et al.,<br />
1999). Estas células são muito sensíveis a até pequenas perturbações na<br />
homeostasia do SNC, e tornam-se facilmente ativa<strong>da</strong>s durante a maior parte <strong>da</strong>s<br />
condições neuropatológicas, incluindo lesão do nervo periférico, trauma e enfarto,<br />
doenças inflamatórias, e neurotóxicas induzi<strong>da</strong>s por lesão neuronal (STREIT et al.,<br />
2000). No entanto, a sua ativação pode interferir com a saúde e integri<strong>da</strong>de de<br />
células neuronais (COYLE & SCHWARCZ, 2000; MOISES et al., 2002). A ativação<br />
<strong>da</strong> microglia gera alterações morfológicas que transformam estas <strong>em</strong> células<br />
pequenas e redon<strong>da</strong>s, s<strong>em</strong> processos e que expressam OX-42 (HUMPEL & SALIMI,<br />
2002; SILVA et al., 2008). Um número maior de células OX-42-positivas foram<br />
observa<strong>da</strong>s <strong>em</strong> co-culturas de neurônios/células gliais expostas a ambos, ETA e<br />
F32. Este efeito apresentou-se aumentado na presença <strong>da</strong> concentração mais<br />
eleva<strong>da</strong>s de ETA e F32 (3 µg/mL). Esta observação indica que os alcaloides <strong>da</strong> P.<br />
juliflora também pod<strong>em</strong> induzir a microgliose. Entre vários fatores liberados pelas<br />
células gliais ativa<strong>da</strong>s, o NO parece des<strong>em</strong>penhar um papel crítico por lesão<br />
29
cerebral induzido por estresse (DIMAYUGA et al., 2007;. GEBICKE-HAERTER,<br />
2001; MANNING et al., 2001; NICHOLSON et al., 2004).<br />
Em repouso as células gliais não produz<strong>em</strong> NO. A produção de NO pode ser<br />
induzi<strong>da</strong> pela conversão de L-arginina <strong>em</strong> L-citrulina, que é catalisa<strong>da</strong> pela óxido<br />
nítrico sintase induzível (iNOS). Nesse estudo, não houve mu<strong>da</strong>nças significativas<br />
<strong>nos</strong> níveis de nitrito observa<strong>da</strong>s no meio de cultura de células trata<strong>da</strong>s com 1,5 - 3<br />
µg/mL de ETA ou no meio de culturas trata<strong>da</strong>s com 1,5 µg/mL de F32. No entanto, o<br />
tratamento de 24 h <strong>da</strong>s culturas com 3 µg/mL de F32 induziu um aumento<br />
significativo na produção de nitrito, possivelmente devido à ativação glial. Estudos<br />
realizados <strong>em</strong> culturas primárias de células gliais verificaram que alguns agentes<br />
químicos induz<strong>em</strong> ativação glial e indução <strong>da</strong> produção de NO (RÖHL & SIEVERS,<br />
2005; SAMANTARAY et al., 2007; RYU et al., 2007). Num estudo, utilizando culturas<br />
primárias de células gliais, observou-se que 24 h de tratamento <strong>da</strong>s culturas mistas<br />
de astrócitos/microglia com flavonóide rutina (100 µmol/L) induziu um aumento<br />
significativo na produção de nitrito. Este tratamento não teve o mesmo efeito <strong>em</strong><br />
culturas primárias de astrócitos, possivelmente indicando a ativação <strong>da</strong> microglia<br />
(SILVA et al., 2008). Um aumento dos níveis de nitrito no meio de culturas primárias<br />
de células <strong>da</strong> glia foi também observa<strong>da</strong> após a exposição a 3 µg/mL <strong>da</strong> fração F32<br />
(SILVA et al., 2007). Em ambos os casos, a ativação e proliferação de microglia<br />
foram também observa<strong>da</strong>s após a exposição aos compostos e relaciona<strong>da</strong>s com o<br />
óxido nítrico (NO), que indica a microglia, como fonte principal de NO <strong>em</strong> resposta a<br />
desafios químicos.<br />
Considerando-se que a F32 foi mais citotóxica do que ETA e que a F32<br />
induziu in vitro as alterações morfológicas e ultraestruturais características <strong>da</strong><br />
“Doença <strong>da</strong> cara torta”, pod<strong>em</strong>os sugerir que os alcaloides piperidinicos juliprosopina<br />
e juliprosina são os responsáveis primários pelos <strong>da</strong><strong>nos</strong> neurotóxicos observados<br />
<strong>em</strong> animais após o consumo <strong>da</strong> planta. Mais estudos dev<strong>em</strong> ser realizados para<br />
caracterizar o mecanismo de formação de vacúolos e se eles têm uma ação<br />
protetora contra a morte celular programa<strong>da</strong> induzi<strong>da</strong> pelo <strong>da</strong>no mitocondrial<br />
observado neste estudo.<br />
30
3.5 Agradecimentos<br />
Este trabalho foi fomentado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento<br />
Científico e Tecnológico (CNPq) e Fun<strong>da</strong>ção de Amparo à Pesquisa do Estado <strong>da</strong><br />
Bahia (FAPESB). Nós agradec<strong>em</strong>os o apoio de pesquisas prestado pela Fun<strong>da</strong>ção<br />
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), e pelo<br />
Programa de <strong>Pós</strong>-graduação <strong>em</strong> <strong>Ciência</strong> <strong>Animal</strong> <strong>nos</strong> Trópicos - Universi<strong>da</strong>de<br />
Federal <strong>da</strong> Bahia. A microscopia eletrônica foi apoia<strong>da</strong> pela Plataforma de<br />
Microscopia Eletrônica - Centro de Pesquisa Gonçalo Muniz, <strong>da</strong> Fun<strong>da</strong>ção Oswaldo<br />
Cruz, Salvador, Brasil.<br />
31
3.6 Referências<br />
AHMAD, A.; ALI KHAN K.; AHMAD V.U. QAZI S. Antibacterial activity of juliflorine<br />
isolated from Prosopis juliflora. Planta Medica, v.1, p. 285-288, 1986.<br />
AHMAD, A.; KHURSHEEDM, A.K.; SABIHA, Q.; VIQARUDDIN, A. Antifungial activity<br />
of some hydrosoluble Prosopis juliflora alkaloids. Fitoterapia, v. 60, p. 86-89, 1989.<br />
AL-SHAKH-HAMED, W. M. A.; AL-JAMMAS, M. A. The antimicrobial activity of<br />
alkaloi<strong>da</strong>l fraction of Prosopis juliflora. Iraqi Journal Veterinary Science, v. 12, p.<br />
281-287, 1999.<br />
APERIA, A., BERTORELLO, A., SERI, I. Dopamine causes inhibition of Na+-<br />
K+ATPase 686 activity in rat proximal convoluted tubule segments. Am.J.Physiol, v.<br />
252, p. 39–45,1987.<br />
AQEEL, A.; KHURSHEED, A. K.; VIQARUDDIN, A.; SABIHA Q. Antimicrobial activity<br />
of julifloricine isolated from Prosopis juliflora. Arzneim. - Forsch./Drug Research,<br />
39, .652-655, 1989.<br />
ARDUINO, D, M,;ESTEVES,R.; CARDOSO, S. Mitochondrial Fusion/Fission,<br />
Transport and Autophagy in Parkinson’s Disease: When Mitochondria Get Nasty.<br />
Parkinson’s Disease. Article. ID 767230, 2011.<br />
BACA, S.F.; VALLENAS, A.; NOVOA, C. Estudio experimental de la “Coquera” en<br />
capri<strong>nos</strong>. Revta Fac Med Vet. v. 18, p. 131-159, 1967.<br />
CÂMARA, A.C.L.; COSTA, N.A.; RIET-CORREA F.; AFONSO, J.A.B.; DANTAS,<br />
A.F.M.; MENDONÇA, C.L.; SOUZA; M.I. Intoxicação espontânea por vagens de<br />
Prosopis juliflora (Leg. Mimosoideae) <strong>em</strong> bovi<strong>nos</strong> no Estado de Pernambuco. Pesq.<br />
Vet. Brás. v. 29, p. 233-240, 2009.<br />
CHANG, R. C.C.; CHIU1, KIN.; HO, Y.S.; SO, K.FA. Modulation of Neuroimmune<br />
Responses on Glia in the Central. Cellular & Molecular Immunology. v. 6, p. 317-<br />
326, 2009.<br />
32
CHANG, R.C.C.; HUDSON, P.; WILSON, B.; HADDON, L.; HONG, J.S. Influence of<br />
neurons on lipopolysaccharide-stimulated production of nitric oxide and tumor<br />
necrosis factor-a by cultured glia. Brain Research, v. 853, p. 236–244, 2000.<br />
COSTA, S.L.; PLANCHENAULT, T.; CHARRIERE-BERTRAND, C.; MOUCHEL, Y.;<br />
FAGES, C.; SHARON, J.; LEFRANÇOIS, T.; BARLOVATZ-MEIMON, G., TARDY, M.<br />
Astroglial permissivity for neurotic outgrowth in neuron-astrocyte cocultures depends<br />
on regulation of lamini bioavailability. Glia. v. 37, p. 105–113, 2002.<br />
COTRAN, R.S.; KUMAR, V.; COLLINS, T. Cellular pathology I: cell injury and cell<br />
death. In Robbin’s Pathologic Basis of Disease, edition 6; Cotran, R.S.; Kumar, V.;<br />
Collins, T. Saunders, Philadelphia, p. 1–29, 1999.<br />
COYLE, J.T.; SCHWARCZ, R. Mind glue: implications of glial cell biology for<br />
psychiatry. Arch Gen Psychiatry. v. 57, p. 90-93, 2000.<br />
DIMAYUGA, F.O.; WANG, C., CLARK, J.M.; DIMAYUGA, E.R.; DIMAYUGA, V.M.;<br />
BRUCE-KELLER, A.J. SOD1 overexpression alters ROS production and reduces<br />
neurotoxic inflammatory signaling in microglial cells. Journal of Neuroimmunology.<br />
v. 182, p. 89–99, 2007.<br />
DOLLAHITE, J.W.; ANTHONY, W.V. Malnutrition in cattle on an unbalanced diet of<br />
mesquite beans. Texas Agri. Exp. Station, v. 11, p. 209-212, 1957.<br />
FESTJENS, N.; VANDEN BERGHE, T.; VANDENABEELE, P. Necrosis, a well-<br />
orchestrated form of cell d<strong>em</strong>ise: signaling cascades, important mediators and<br />
concomitant immuneresponse, Biochim. Biophys. Acta., v. 1757, p. 1371–1387,<br />
2006.<br />
FIGUEIREDO, L.J.C.; FERREIRA, M.M.; TÁVORA, J.P.F.; DANTAS, J. SIMÕES,<br />
S.D. Estudo clínico e anátomopatológico <strong>da</strong> doença "cara torta" <strong>em</strong> bovi<strong>nos</strong> no<br />
nordeste brasileiro. Arq. Med. Vet. – UFBA. v.18, p. 175-183, 1995.<br />
33
GEBICKE-HAERTER, P.J. Microglia in Neurodegeneration: Molecular Aspects.<br />
Microsc. Res. Tech. v. 54, p. 47–58, 2001.<br />
GOLSTEIN, P., KROEMER, G. Cell death by necrosis: towards a molecular<br />
definition. Trends Bioch<strong>em</strong>. Sci. v. 32, p. 37–43, 2007.<br />
GOZUACIK, D.; KIMCHI, A. Autophagy and cell death. Curr. Top. Dev. Biol., v. 78,<br />
p. 217–245, 2007.<br />
HENICS, T.; WHEATLEY, D.N. Cytoplasmic vacuolation, a<strong>da</strong>ptation and cell death:<br />
A view on new perspectives and features. Biology of the Cell. v. 91, p. 485-498,<br />
1999.<br />
HUGHES, J.B.; SILVA, V.D.A.; SILVA, A.R.; SOUZA, C.S.; SILVA, A.M.M.;<br />
VELOSO, E.S.; BATATINHA, M.J.M.; COSTA, M.F.D.; TARDY, M.; ELBACHÁ, R.S.;<br />
COSTA, S.L. Cytotoxicity effect of alkaloi<strong>da</strong>l extract from Prosopis juliflora Sw. D.C.<br />
(Algaroba) pods on glial cells. Brazilian Journal of Veterinary Research and<br />
<strong>Animal</strong> Science, v. 43, p. 50-58, 2006.<br />
HUGHES, J.B.; SOUSA, J.S.; BARRETO, R.A.; SILVA, A.R.; SOUZA, C.S. SILVA,<br />
V.D.A. SILVA, B.M.P.; FREITAS, S.R.V.B.; COSTA, M.F.D.; EL-BACHÁ, R.S.;<br />
BATATINHA, M.J.M.; TARDY, M.; VELOZO, E.S. AND COSTA, S.L. Cytotoxic<br />
effects of an extract containing alkaloids obtained from Prosopis juliflora Sw. D.C.<br />
(Algaroba) pods on glioblastoma cells. Rev. Bras. Saúde Prod. An. v. 6, p. 31-41,<br />
2005.<br />
ISOBE, I.; MAENO,Y.; NAGAO, M.;IWASA, M.; KOYAMA, H.; SEKO-<br />
NAKAMURA,Y.; MONMA-OHTAKI, J. Cytoplasmic vacuolation in cultured rat<br />
astrocytes induced by an organophosphorus agent requires extracellular signal-<br />
regulated kinase activation. Toxicology and Applied Pharmacology. v. 193, p.<br />
383–392, 2003.<br />
34
KANTHASAMY, A.; SUBRAMANIAN, S.; GOVINDASAMY, S. Bacterici<strong>da</strong>l and<br />
fungici<strong>da</strong>l effects of Prosopis juliflora alkaloi<strong>da</strong>l fraction. Indian Drugs, v. 26, p. 390-<br />
394, 1989.<br />
LAKSHMI, B.S.; NAIDU, K.C.; MURTHY, Y.L.N.; BOBBARALA, V.; PANDIT, N. Bio-<br />
efficacy of some medicinal plants against pathogens of cereal crops and<br />
phytoch<strong>em</strong>ical examination of Prosopis juliflora (SW) Dc. Journal of Pharmacy<br />
Research, v. 3, p. 356-360, 2010.<br />
LIEM, R.K.; MESSING, A. Dysfunctions of neuronal and glial intermediate filaments<br />
in disease. J. Clin. Invest. v. 119, p. 1814-1824, 2009.<br />
MANNING, P.; COOKSON, M.R.; MCNEIL, C.J.; FIGLEWICZ, D.; SHAW, P. J. Brain<br />
Research, v. 911, p. 203–210, 2001.<br />
MEYER, R.P.; GEHLHAUS, M.; KNOTH, R.; VOLK, B. Expression and Function of<br />
Cytochrome P450 in Brain Drug Metabolism. Current Drug Metabolism, v. 8, p.<br />
297-306, 2007.<br />
MOISES, H.W.; ZOEGA, T.; GOTTESMAN, I.I. The glial growth factors deficiency<br />
and synaptic destabilization hypothesis of schizophrenia. BMC Psych., v. 2, p. 8,<br />
2002.<br />
MOSMAN, T. Rapid, colorimetric assay for cellular growth and survival: application to<br />
proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Meth. v. 65, p. 55–63, 1983.<br />
NICHOLSON, T.E.; DIBB, S.; RENTON, K.W. Nitric oxide mediates an LPS-induced<br />
depression of cytochrome P450 (CYP1A) activity in astrocytes. Brain Res. 1029,<br />
148–154. 2004.<br />
NONES, J.; STIPURSKY, J.; COSTA, S.L.; GOMES, F.C.A. Flavonoids and<br />
Astrocytes Crosstalking: Implications for Brain Development and Pathology.<br />
Neuroch<strong>em</strong> Res. v. 35, p. 955–966, 2010.<br />
35
O’CALLAGHAN, J.P. Assessment of neurotoxicity: use of glial fibrillary acidic protein<br />
as a biomarker. Biomed. Environ. Sci. v. 4, p. 197–206, 1991.<br />
OTT-LONGONI, R.; VISWANATHAN, N.; HESSE, M. Die konstitution des alkaloides<br />
Juliprosopin aus Prosopis juliflora A. DC. Helvetica Chimica Acta. v. 63, p. 2119-<br />
2129, 1980.<br />
PARIS, I.; MUNOZ, P.; HUENCHUGUALA, S.; COUVE, E.; SANDERS, L.H.;<br />
GREENAMYRE, J.T.; CAVIEDES, P.; SEGURA-AGUILAR, J. Autophagy Protects<br />
Against Aminochrome-Induced Cell Death in Substantia Nigra-Derived Cell Line.<br />
Toxicological sciences. v. 121, n.2, p. 376–388, 2011.<br />
PARIS, I., PEREZ-PASTENE, C., COUVE, E., CAVIEDES, P., LEDOUX, S., AND<br />
SEGURA-AGUILAR, J. Copper dopamine complex induces mitochon-drial autophagy<br />
preceding caspase-independent apoptotic cell death. J. Biol. Ch<strong>em</strong>. v. 284, p.<br />
13306–13315, 2009.<br />
RAJKOWSKA, G.; MIGUEL-HIDALGO, J.J.; MAKKOS, Z.; MELTZER, H.;<br />
OVERHOLSER, J.; STOCKMEIER, C. Layer-specific reductions in GFAP-reactive<br />
astroglia in the dorsolateral prefrontal cortex in schizophrenia. Schizophr. Res. v. 57,<br />
p. 127–138, 2002.<br />
RAMBOLD, A.S.; KOSTELECKY, B.; LIPPINCOTT-SCHWARTZ, J. Together we are<br />
stronger. Fusion protects mitochondria from autophagosomal degra<strong>da</strong>tion.<br />
Autophagy. v. 7, n. 12, p. 1–2, 2011.<br />
RÖHL, C., SIEVERS, J. Microglia is activated by astrocytes in trimethyltin<br />
intoxication. Toxicology and Applied Pharmacology. v. 204, p. 36-45, 2005.<br />
RYU, J.K.; TRAN, K.C.; MCLARNON, J.G. Depletion of neutrophils reduces neuronal<br />
degeneration and inflammatory responses induced by Quinolinic acid in vivo. GLIA.<br />
v. 55, p. 439–451, 2007.<br />
36
SALIMI, K.; HUMPEL, C. Down regulation of compl<strong>em</strong>ent receptor 3 and major<br />
histocompatibility complex I and II antigen-like immunoreactivity accompanies<br />
ramification in isolated rat microglia. Brain Res. v. 946, p. 283–289, 2002.<br />
SAMANTARAY, S.; KNARYAN, V.H.; GUYTON, M.K.; MATZELLE, D.D.; RAY, S.K.;<br />
BANIK, N.L. The parkinsonian neurotoxin rotenone activates calpain and caspase-3<br />
leading to motoneuron degeneration in spinal cord of Lewis rats. Neuroscience. v.<br />
146, p. 741-755, 2007.<br />
SHEARMAN, M.S.; HAWTIN, S.R.; TAILOR, V.J. The intracellular component of<br />
cellular 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction<br />
is specifically inhibited by b-amyloid peptides. J. Neuroch<strong>em</strong>. v. 65, p. 218–227,<br />
1995.<br />
SILVA, A.M.M.; SILVA, A.R.; PINHEIRO, A.M.; FREITAS, S.R.V.B.; SILVA, V. D.A.;<br />
SOUZA, C.S.; VELOSO, E.S.; ELBACHÁ, R.S.; COSTA, M.F.D.; COSTA, S.L.<br />
Alkaloids from Prosopis juliflora leaves induce glial activation, cytotoxicity and<br />
stimulate NO production. Toxicon, v. 49, p. 601-614, 2007.<br />
SILVA, A.R.; PINHEIRO, A.M.; SOUZA, C.S.; FREITAS, S.R.V.B.;<br />
VASCONCELLOS, V.; EL-BACHÁ, R.S.: COSTA, M.F.D.: COSTA, S.L. The<br />
flavonoid rutin induces astrocyte and microglia activation and regulates TNF-alpha<br />
and NO release in primary glial cell cultures. Cell Biol Toxicol, v. 24, p. 75–86,<br />
2008.<br />
SILVA, D.S. Substituição progressiva do farelo de trigo pela vag<strong>em</strong> <strong>da</strong> algaroba na<br />
alimentação de bovi<strong>nos</strong> <strong>em</strong> engor<strong>da</strong> [dissertação]. Areia (PB): Universi<strong>da</strong>de Federal<br />
<strong>da</strong> Paraíba, 1981.<br />
SOFRONIEW, M.V.; HOWE, C.L.; MOBLEY, W.C. Nerve growth factor signaling,<br />
neuroprotection, and neural repair. Annu. Rev. Neurosci. v. 24, p. 1217–281, 2001.<br />
37
SAMOYLENKO, V., ASHFAQ ,M.K., JACOB, M.R., TEKWANI, B.L., KHAN, S.I.,<br />
MANLY, S.P., JOSHI, V.C., WALKER, L.A., MUHAMMAD, I. Indolizidine, antiinfective<br />
and antiparasitic compounds from Prosopis glandulosa var. glandulosa. J Nat Prod.<br />
v. 72, p. 92-8, 2009.<br />
SPA – Secretaria de Produção <strong>Animal</strong> A algarobeira (Prosopis juliflora Sw, D.C.) no<br />
nordeste do Brasil, 1989.<br />
STREIT, W.J.; WALTER, S.A.; PENNEL, N.A. Reactive microgliosis. Progr.<br />
Neurobiol. v. 57, p. 563–581, 1999.<br />
TABOSA, I.M.; SOUZA, J.C.A.; GRAÇA, D.L.; BARBOSA-FILHO, J.M.; ALMEIDA,<br />
R.N.; RIET-CORREA, F. Neuronal vacuolation of the trig<strong>em</strong>inal nuclei in goats<br />
caused by ingestion of Prosopis juliflora pods (Mesquite beans). Vet and Human<br />
Toxico, v. 42, p. 155-158, 2000a.<br />
TABOSA, I.M.; QUINTANS-JÚNIOR, L.J.; PAMPLONA, F.V.; ALMEIDA, R.N.;<br />
CUNHA, E.V.L. DA; SILVA, M.S. DA; SOUZA, J.C. DE A.; BARBOSA FILHO, J.M.<br />
Isolamento biomonitorado de alcalóides tóxicos de Prosopis juliflora (algaroba). Rev.<br />
Bras. Farmacogn. v. 9/10, p. 11-22, 2000b.<br />
TABOSA, I.M.; RIET-CORREA, F.; BARROS, S.S.; SUMMERS, B.A.; SIMÕES,<br />
S.V.D.; MEDEIROS, R.M.T.; NOBRE, V.M.T. Neurohistologic and ultrastructural<br />
lesions in cattle experimentally intoxicated with the Plant Prosopis juliflora. Vet<br />
Pathol. v. 43, p. 695–701, 2006.<br />
TARDY, M. Astrocyte et Homeostasie. Méd. Sci. v. 8, p. 799–804, 1991.<br />
TARDY, M. Role of laminin bioavailability in the astroglial permissivity for neuritic<br />
outgrowth. Anais <strong>da</strong> Acad<strong>em</strong>ia Brasileira de <strong>Ciência</strong>s. v. 74, p. 683-690, 2002.<br />
WAGNER, H.; BLADT, S.; ZGAINSKI, E.M. Drogen analyse. In:<br />
Dünnschichtchromatographie Anlyse von Arzneidrogen, edition 1; Verlag, J.;<br />
Springer, J. Heidelberg New York Publishers, Berlin, 1983.<br />
38
WANG, Z.; LI, D.; LIANG, Y.; WANG, D.; CAI, N. Activation of astrocytes by<br />
advanced glycation end products: cytokines induction and nitric oxide release. Acta<br />
Pharmacol Sin. v. 23, p. 974-980, 2002.<br />
39
Juliprosina Juliprosopina<br />
Figura 1 – Estrutura química dos alcaloides piperidínicos juliprosina e juliprosopina,<br />
presentes na fração F32.<br />
40
Células Viáveis (%)<br />
Células Viáveis (%)<br />
Figura 2 – Análise do efeito dos alcaloides de P. julifora sobre viabili<strong>da</strong>de dos<br />
neurônios e células gliais através do teste do MTT. As células foram incuba<strong>da</strong>s <strong>em</strong><br />
condições controle (0,1% de DMSO) ou na presença de ETA (A) ou F32 (B) e<br />
viabili<strong>da</strong>de determina<strong>da</strong> após 24 horas do tratamento. Resultados expressos <strong>em</strong><br />
percentag<strong>em</strong> <strong>da</strong> absorbância <strong>em</strong> relação ao controle considerado como 100%. *p
G H<br />
Vacuolização <strong>em</strong><br />
Astrócitos (%)<br />
0 0,3 1,5 3<br />
ETA (µg/mL)<br />
Vacuolização <strong>em</strong><br />
Astrócitos (%)<br />
0 0,3 1,5<br />
F32 (µg/mL)<br />
Figura 3 - Análise do efeito dos alcaloides de P. juliflora na morfologia<br />
celular e indução de vacuolização de astrócitos <strong>em</strong> co-culturas de<br />
neurônios/células gliais através <strong>da</strong> coloração com o agente pancrônico de<br />
Rosenfeld. (A) Culturas <strong>em</strong> condições de controle ou após 24 h de<br />
tratamento com 1,5 µg/ mL de ETA (B), 3 µg/mL ETA (C), 1,5 µg/mL F32 (D e<br />
E), ou 3 µg/mL F32 (F). A seta indica o corpo celular de umneurônio; a ponta<br />
de seta Indica um neurônios com interrupções <strong>nos</strong> neuritos; o asterisco<br />
indica astrócito com vacuolização citoplasmática <strong>em</strong> neurites e vacúolos;<br />
objetiva 20x0,70, barra de escala = 10 µm. (G e H) Quantificação dos<br />
astrócitos <strong>em</strong> vacuolização nas co-culturas <strong>em</strong> condições de controle (0,1%<br />
de DMSO) e 24 h após tratamento com ETA (0,3-3 µg/mL) ou F32 (0,3-1,5<br />
µg/ml), os resultados estão expressos como uma percentag<strong>em</strong> <strong>da</strong> média<br />
razão de astrócitos possuindo vacúolo/astrócitos totais desvio padrão (SD);<br />
* p
Figura 4 – Análise do efeito dos alcaloides de P. juliflora na morfologia de astrócitos e<br />
expressão GFAP <strong>em</strong> co-culturas de neurônios/células gliais. Fotomicrografias de<br />
marcação imunocitoquímica de astrócitos expressando GFAP <strong>em</strong> condições de controle<br />
(A) e após 24 h de tratamento com 1,5 µg/mL F32 (B), 3 µg/ mL F32 (C), 1,5 µg / ml de<br />
ETA (D) ou 3 µg/ml de ETA (E). A cromatina nuclear de neurônios e células gliais foi<br />
cora<strong>da</strong> com Hoechst 33258. Objetiva 20x0,70; barra de escala = 10 µm. (F) ban<strong>da</strong>s<br />
imunorreativas <strong>da</strong> proteína GFAP foram identifica<strong>da</strong>s através de westernimunoblot <strong>em</strong><br />
extratos protéicos <strong>da</strong>s co-culturas 24 h após o tratamento com alcaloides; os resultados<br />
são representativos de três experiências independentes.<br />
43
Figura 5 – Análise do efeito dos alcaloides de P. juliflora na morfologia de neurônios e<br />
expressão β-III-tubulina <strong>em</strong> co-culturas de neurônios/células gliais. Foto micrografias de<br />
marcação imunocitoquímica de neurônios expressando β-III-tubulina <strong>em</strong> condições de controle<br />
(A) e após 24 h de tratamento com 3 µg/ml de ETA (B) ou 3 µg/mL F32 (C). A cromatina nuclear<br />
de neurônios e células gliais foi cora<strong>da</strong> com Hoechst 33258. Objetiva 20x0,70; barra de escala =<br />
10 µm.<br />
44
0 1,5 3<br />
ETA (µg/mL)<br />
0 1,5 3<br />
F32 (µg/mL)<br />
Figura 6 – Análise do efeito dos alcaloides de P. juliflora na ativação <strong>da</strong> microglia <strong>em</strong> coculturas<br />
de neurônios/células gliais após marcação imunocitoquímica <strong>da</strong> proteína OX-42 e<br />
coloração com Rosenfeld. Fotomicrografias de marcação imunocitoquímica de astrócitos<br />
expressando GFAP <strong>em</strong> condições de controle (A) e após 24 h de tratamento com 1,5 µg/ml de<br />
ETA (B) ou 1,5 µg/ mL F32 (C). Objetiva 20x0,70; barra de escala = 10 µm. Quantificação de<br />
células <strong>da</strong> microglia OX42 positvas <strong>em</strong> condições controle ou trata<strong>da</strong>s com 1,5 - 3 µg/ml de ETA<br />
(D) ou 1,5 - 3 µg/ mL F32 (E); *p
0 1,5 3<br />
ETA (µg/mL)<br />
0 1,5 3<br />
F32 (µg/mL)<br />
Figura 7 – Medi<strong>da</strong> <strong>da</strong> produção de nitrito (NaNO 2) no meio de cultura <strong>em</strong> condições de<br />
controle e após 24 h de tratamento com 1,5 - 3 µg/ml de ETA (A) ou F32 (B).<br />
Resultados expresso como media desvio-padrão; *p
Figura 8 – Análise por microscopia eletrônica de transmissão de modificações<br />
ultraestruturais induzi<strong>da</strong>s por alcaloides de P. juliflora <strong>em</strong> co-culturas de<br />
neurônios/células gliais. Fotomicrografias <strong>da</strong>s culturas <strong>em</strong> condições de controle<br />
(A) e após 24 h de tratamento com ou 3 µg/ml de ETA (B), 3 µg/ mL F32 (C e D).<br />
O asterisco branco (<strong>em</strong> B) indica mu<strong>da</strong>nças na morfologia mitocondrial. A seta<br />
(<strong>em</strong> C e D) indica desintegração ou encurtamento <strong>da</strong>s cristas mitocondriais. O<br />
asterisco negro (<strong>em</strong> D), indica vacúolos citoplasmáticos.<br />
47
4. ARTIGO CIENTÍFICO II<br />
Autofagia protege contra a morte celular induzi<strong>da</strong> por alcaloides <strong>da</strong> Prosopis juliflora<br />
<strong>em</strong> co-cultura de neurônios/células <strong>da</strong> gliais.<br />
RESUMO<br />
Prosopis juliflora (Swartz) DC é um arbusto nativo <strong>da</strong> América Central, norte <strong>da</strong><br />
América do Sul e <strong>da</strong>s ilhas do Caribe, que se tornaram frequentes invasoras <strong>em</strong><br />
regiões de todo o mundo. Esta planta t<strong>em</strong> sido usa<strong>da</strong> para alimentar animais e seres<br />
huma<strong>nos</strong>, no entanto, uma ação sinérgica dos alcaloides piperidínicos t<strong>em</strong> sido<br />
sugeri<strong>da</strong> como responsável por <strong>da</strong><strong>nos</strong> neurotóxicos observados <strong>em</strong> bovi<strong>nos</strong> e<br />
capri<strong>nos</strong> após intensa ingestão deste alimento. Neste estudo investigou-se o<br />
envolvimento de <strong>da</strong>no mitocondrial e autofagia no mecanismo de morte celular<br />
induzi<strong>da</strong> por alcaloides piperidínicos de folhas <strong>da</strong> P. juliflora utilizando 30 µg/mL de<br />
um extrato alcaloi<strong>da</strong>l (ETA) e 7,5 µg/mL de uma fração de alcaloides (F32) <strong>em</strong><br />
modelos de co-cultura de neurônio/células gliais. Foi d<strong>em</strong>onstrado que ETA e F32<br />
induziram redução <strong>nos</strong> níveis de ATP, perturbação do potencial de m<strong>em</strong>brana<br />
mitocondrial e aumento significativo no número de células LC3-positivas após 12h<br />
de exposição, aumento na ativação <strong>da</strong> caspase-3, após 16h de exposição, mu<strong>da</strong>nça<br />
drástica na morfologia de neurônios e células gliais e morte celular significativa após<br />
24 horas de exposição. Curiosamente, pré-incubação com bafilomicina aumentou a<br />
morte celular e alterações morfológicas induzi<strong>da</strong>s por ETA, e privação de soro fetal<br />
bovino reduziu a morte celular e alterações morfológicas induzi<strong>da</strong>s por F32. Em<br />
conclusão, estes resultados suger<strong>em</strong> que o mecanismo de morte neuronal e glial<br />
induzi<strong>da</strong> por alcaloides de P. juliflora envolve apoptose <strong>em</strong> resposta ao <strong>da</strong>no<br />
mitocondrial e inibição do fluxo <strong>da</strong> autofagia. Além disso, a autofagia parece ser um<br />
mecanismo importante de proteção contra a morte celular induzi<strong>da</strong> por alcaloides <strong>da</strong><br />
P. juliflora <strong>em</strong> co-cultura de neurônio/células <strong>da</strong> gliais.<br />
Palavras-chave: Prosopis juliflora; alcaloides piperidínicos; autofagia; apoptose;<br />
neurônios; células gliais.<br />
48
Autophagy protects against cell death induced by alkaloids from Prosopis juliflora in<br />
neuron/glia cells co-culture<br />
SUMMARY<br />
Prosopis juliflora (Swartz) DC is a shrub native to Central America, northern South<br />
America and the Caribbean islands, that have become frequent in other regions<br />
throughout the world. This plant has been used to feed animals and humans,<br />
however a synergic action of piperidine alkaloids have been suggested to be<br />
responsible for the neurotoxic <strong>da</strong>mage observed in cattle and goats after intensive<br />
ingestion of this feed. In this study we investigated the involv<strong>em</strong>ent of mitochondrial<br />
<strong>da</strong>mage and autophagy on mechanism of cell death induced by piperidine alkaloids<br />
from P. juliflora using 30 µg/mL of a total alkaloid extract (TAE) and 7.5 µg/mL of an<br />
alkaloid fraction (F32) in models of neuron/glial cell primary co-culture. We found that<br />
TAE and F32 induce reduction in ATP levels, disruption of mitochondrial m<strong>em</strong>brane<br />
potential and significant increase in number of LC3 positives cells after 12h of<br />
exposure, increase in caspase-3 activation after 16h, dramatic morphological<br />
changes on neuron and glial cells and a significant cell death after 24h of exposure.<br />
Interestingly, preincubation with bafilomycin increased the cell death and<br />
morphologic changes by TAE, and serum deprivation reduced the cell death induced<br />
and morphologic changes induced by F32. In conclusion, these results suggest that<br />
mechanism of neuron and glial cells death induced by alkaloids from P. juliflora<br />
involve apoptosis in response to mitochondrial <strong>da</strong>mage and autophagic flux<br />
inhibition. Moreover, autophagy se<strong>em</strong>s to be an important protective mechanism<br />
against the cell death induced by alkaloids from Prosopis juliflora in neuron/glia cells<br />
co-culture<br />
Key Words: Prosopis juliflora; Piperidine alkaloids; autophagy; apoptosis; neurons;<br />
glial cells.<br />
49
4.1. Introdução<br />
Prosopis juliflora (Swartz) DC é um arbusto nativo <strong>da</strong> América Central, norte<br />
<strong>da</strong> América do Sul e <strong>da</strong>s Ilhas do Caribe (BURKART, 1976), que se tornaram<br />
invasoras <strong>em</strong> outras regiões <strong>em</strong> todo o mundo como a Índia, sul <strong>da</strong> África, Oriente<br />
Médio, Paquistão e Havaí (EUA) (PASIECZNIK et al., 2001). No Brasil, esta planta<br />
foi introduzi<strong>da</strong> na déca<strong>da</strong> de 1940 e suas vagens têm sido usa<strong>da</strong>s para a<br />
alimentação de gado leiteiro e de corte, ovi<strong>nos</strong>, capri<strong>nos</strong>, suí<strong>nos</strong>, galinhas e eqüi<strong>nos</strong><br />
(MORENO et al., 2005; SILVA et al. 2002a,b; STEIN et al. 2005; ROSSI et al., 2009;<br />
MORENO et al., 2005; SILVA et al. 2002a,b; STEIN et al. 2005; ROSSI et al., 2009).<br />
Também têm sido usa<strong>da</strong>s para o consumo humano, na elaboração de pães,<br />
biscoitos, geléias, doces, e bebi<strong>da</strong> substituta do café (VIEIRA et al, 1995; CHOGE et<br />
al, 2007).<br />
Esta planta contém esteroides, alcaloides, cumarinas, flavonoides,<br />
sesquiterpe<strong>nos</strong> e ácido esteárico (ALMARAZ-ABARCA et al., 2007). Extratos <strong>da</strong>s<br />
vagens e folhas de algaroba têm d<strong>em</strong>onstrados vários efeitos farmacológicos, tais<br />
como anti-bacteriano (AQEEL AHMAD et al., 1989; AQEEL AHMAD et al., 1986;<br />
AQEEL AHMAD et al., 1995 ; KANTHASAMY et al., 1989; CA-CERES et al., 1995;<br />
AL-SHAKH-HAMED & AL-JAMMAS, 1999; SATISH et al., 1999), antifúngica (AQEEL<br />
AHMAD et al., 1989a; KANTHASAMY et al., 1989; KAUSHIK et al., 2002),<br />
estimulantes do sist<strong>em</strong>a imunitário (AQEEL AHMAD et al., 1992), inibidores <strong>da</strong><br />
acetilcolinesterase, inibidores <strong>da</strong> butirilcolinesterase com ativi<strong>da</strong>de de bloqueio de<br />
canais de Ca 2+ (CHOUDHARY et al., 2005) e efeito anti-helmintico (BATATINHA et<br />
al., 2011). Estas proprie<strong>da</strong>des têm sido atribuí<strong>da</strong>s aos alcaloides piperidínicos que<br />
têm a sua estrutura compostas por dois anéis piperidínicos, que são ligados a uma<br />
porção indolizidínica através de duas cadeias alifáticas (AHMAD & MOHAMMAD et<br />
al, 1979; AHMAD et al, 1985, AHMAD et al, 1986; AHMAD et al, 1989). Os principais<br />
alcaloides biologicamente ativos juliprosina e juliprosopina apresentam os grupos<br />
químicos funcionais (carbonila e os radicais hidroxila) <strong>em</strong> carbo<strong>nos</strong> 3 e 3' dos anéis<br />
piperidínicos ou no carbono 3''' do anel indolizidínico, respectivamente (NAKANO et<br />
al, 2004; CHOUDHARY et al. , 2005). A ação sinérgica dos alcaloides piperidínicos<br />
têm sido sugeri<strong>da</strong> como responsável pelo <strong>da</strong>no neurotóxico observado <strong>em</strong> bovi<strong>nos</strong> e<br />
capri<strong>nos</strong>, após a ingestão intensiva de Prosopis juliflora (TABOSA et al, 2000a;<br />
50
TABOSA et al, 2000b; SILVA et al 2007; CÂMARA et al., 2009; SILVA et al., 2012).<br />
Tabosa et al., (2000b) observaram que a ativi<strong>da</strong>de tóxica <strong>em</strong> animais de laboratório<br />
está quimicamente relacionado com os alcaloides piperidínicos, dentre eles a<br />
juliprosopina e a juliprosina, presentes nas vagens desta legumi<strong>nos</strong>a. No primeiro<br />
capítulo desta <strong>tese</strong>, d<strong>em</strong>onstramos que uma fração (F32) composta pelos alcaloides<br />
piperidínicos juliprosopina, como constituinte majoritário, e <strong>em</strong> menor quanti<strong>da</strong>de<br />
juliprosina, amplificou efeitos neurotóxicos induzidos por um extrato alcaloi<strong>da</strong>l (ETA)<br />
<strong>em</strong> neurônios e células gliais in vitro. Estes efeitos são caracterizados por<br />
astrogliose, microgliose, interrupção na expressão de proteínas do citoesqueleto,<br />
<strong>da</strong><strong>nos</strong> mitocondriais e indução de autofagia (SILVA et al, 2012). No entanto, o<br />
envolvimento destas alterações celulares e no mecanismo de morte induzi<strong>da</strong> por<br />
estes alcaloides ain<strong>da</strong> não foi caracterizado. Neste sentido, este estudo v<strong>em</strong><br />
investigar o envolvimento do <strong>da</strong>no mitocondrial e autofagia no mecanismo de morte<br />
celular induzi<strong>da</strong> por alcaloides piperidínicos <strong>da</strong> P. juliflora usando um extrato<br />
alcaloide total (ETA) e a fração F32 <strong>em</strong> modelos de co-cultura de neurônios/células<br />
gliais.<br />
4.2 Material e métodos<br />
Co-culturas primárias de neurônios/células gliais<br />
Culturas primárias <strong>da</strong>s células <strong>da</strong> glia foram prepara<strong>da</strong>s de acordo com<br />
método descrito por Cookson & Pentreath (1994). Resumi<strong>da</strong>mente, os h<strong>em</strong>isférios<br />
cerebrais de ratos Sprague-Dawley de um dia de i<strong>da</strong>de pós-natal foram isolados<br />
assepticamente e as meninges foram r<strong>em</strong>ovi<strong>da</strong>s com auxilio de lupa para posterior<br />
dissecção do tecido cortical. Em segui<strong>da</strong>s, as células foram suspensas <strong>em</strong> meio<br />
DMEM/HAM-F12 (Cultilab, SP, Brasil), supl<strong>em</strong>entado com 100 UI/mL de penicilina<br />
G, estreptomicina 100 µg/mL, 2 mM de L-glutamina, 0,011 g/L de piruvato, 10% de<br />
SFB, 3,6 mg/L Hepes e 33 mM de glicose (Cultilab, SP, Brasil) e cultiva<strong>da</strong>s <strong>em</strong><br />
placas de 100 milímetros Ø <strong>em</strong> uma atmosfera úmi<strong>da</strong> com 5% de CO2 a 37° C. O<br />
meio de cultura foi mu<strong>da</strong>do a ca<strong>da</strong> dois dias, e as células foram cultiva<strong>da</strong>s durante<br />
15 dias, para ser<strong>em</strong> então tripsiniza<strong>da</strong>s (tripsina-EDTA) e plaquea<strong>da</strong>s a uma<br />
densi<strong>da</strong>de de 670 células/mm 2 e mantidos por 48 h <strong>em</strong> uma atmosfera úmi<strong>da</strong> com<br />
5% de CO2 a 37° C para estabilização <strong>da</strong> cultura. Neste momento, neurônios de<br />
h<strong>em</strong>isférios cerebrais de <strong>em</strong>briões de ratos Sprague-Dawley com 15-18 dias de<br />
i<strong>da</strong>de gestacional, foram obtidos através do mesmo método descrito acima para a<br />
51
cultura <strong>da</strong> glia. As células neuronais <strong>em</strong> suspensão no meio DMEM/HAM-F12<br />
supl<strong>em</strong>entado foram s<strong>em</strong>ea<strong>da</strong>s sobre a monocama<strong>da</strong> astroglial numa proporção de<br />
1:2 células gliais (335 células/mm 2 ). As células gliais e neuronais juntas foram<br />
incuba<strong>da</strong>s <strong>em</strong> atmosfera úmi<strong>da</strong> com 5% de CO2 a 37° C durante 8 dias, quando os<br />
tratamentos foram realizados.<br />
Alcaloides e tratamentos<br />
O extrato de alcaloide foi obtido através do método ácido/base de extração<br />
modificado, tal como descrito por Ott-Longoni et al. (1980), com algumas<br />
modificações (SILVA et al, 2007). A fração F32 composta por dois alcaloides<br />
piperidínicos juliprosopina e juliprosina foi obti<strong>da</strong> por cromatografia <strong>em</strong> coluna de<br />
sílica gel utilizando clorofórmio/metanol (99:1 a 1:1) como fase móvel (SILVA et al,<br />
2007). Para os tratamentos, o ETA e a F32 foram dissolvidos <strong>em</strong> dimetilsulfóxido<br />
(DMSO, Sigma, St. Louis, MO), para gerar soluções de estoque <strong>em</strong> concentrações<br />
de 30 mg/mL, que foram armazena<strong>da</strong>s a -20° C. As células foram trata<strong>da</strong>s com<br />
concentrações próximas aos valores de EC50 determinados no primeiro capítulo<br />
testa <strong>tese</strong>, 30μg/mL de ETA ou F32 de 7,5μg/mL, por um período de 12 - 24 h. O<br />
grupo do controlo negativo foi tratado com DMSO diluídos <strong>em</strong> meio de cultura, o<br />
maior volume equivalente usado <strong>nos</strong> grupos tratados (0,1%) e não mostrou nenhum<br />
efeito significativo <strong>nos</strong> parâmetros analisados <strong>em</strong> comparação com células que não<br />
receberam diluentes.<br />
Medição de ATP<br />
Após 12h de exposição aos alcaloides, os níveis de ATP <strong>em</strong> co-cultura foram<br />
mensurados usando o Kit Cell-Titer-Glo ® Luminescent Cell Viability Assay (Promega,<br />
Madison, WI, USA). Para tanto, as células após tratamentos foram tripsiniza<strong>da</strong>s e<br />
transferi<strong>da</strong>s para placas de 96 poços, adotando-se oito replicatas por condição<br />
experimental. Um volume de 100 μl do reagente Kit Cell-Titer-Glo foi adicionado <strong>em</strong><br />
ca<strong>da</strong> poço, e após 10 min, o sinal de luminescência foi mensurado usando um leitor<br />
de ELISA a 562 nm. Possíveis diferenças entre o número de células presentes <strong>em</strong><br />
ca<strong>da</strong> poço foi normaliza<strong>da</strong> por dosag<strong>em</strong> de proteínas pelo Kit BSA. Os resultados<br />
foram expressos na razão de µg de ATP por µg de proteína.<br />
52
Determinação do potencial de m<strong>em</strong>brana mitocondrial<br />
O JC-1 (iodeto de 5, 5´, 6, 6´-tetracloro-1, 1´, 3, 3´-tetraetilbenzimi<strong>da</strong>zolil-<br />
carbocianina) é um corante catiônico, que ao corar células com potencial de<br />
m<strong>em</strong>brana mitocondrial normal, se apresenta na forma monomérica no citoplasma e<br />
na forma de agregados nas mitocondriais. Entretanto na visualização de células que<br />
tiveram alteração no potencial de m<strong>em</strong>brana mitocondrial é percebi<strong>da</strong> apenas a sua<br />
marcação na forma monomérica. Após tratamentos de 12 h, as células foram<br />
incuba<strong>da</strong>s com solução de 1,5 µg/mL do corante JC-1 <strong>em</strong> PBS <strong>em</strong> ambiente escuro,<br />
por 40 min e posteriormente lava<strong>da</strong>s com PBS e observa<strong>da</strong>s <strong>em</strong> microscopia<br />
confocal, pela qual foram avalia<strong>da</strong>s as intensi<strong>da</strong>des de fluorescência monomérica<br />
verde a 488 nm (excitação) e 510–525 nm (<strong>em</strong>issão) e <strong>da</strong> fluorescência de<br />
agregados vermelho a 543 nm (excitação) e 570 nm (<strong>em</strong>issão).<br />
Tranfecção com plasmídio GFP-LC3<br />
Para detecção de autofagossomos, as co-culturas de neurônios/células gliais<br />
foram transfecta<strong>da</strong>s com o plasmídeo GFP-LC3 (gentilmente cedido por Zsolt<br />
Tallocky PhD, Columbia University Medical Center). Para formar o complexo de<br />
transfecção, foram utilizados 2 µL de reagente de transfecção HD Fugene (Roche<br />
Diagnóstico) e 0,5 µg de DNA plasmídial GFP-LC3 <strong>em</strong> 25 µL de volume total do<br />
meio de ca<strong>da</strong> placa, manti<strong>da</strong>s no escuro durante 15 min. Em segui<strong>da</strong>, o complexo<br />
de transfecção <strong>em</strong> 150 µL de meio de cultura foi adicionado a ca<strong>da</strong> placa e incubou-<br />
se durante 24 h. Em segui<strong>da</strong>, o meio de cultura foi mu<strong>da</strong>do e as células foram<br />
cultiva<strong>da</strong>s durante mais 24 horas antes do tratamento com ETA e F32.<br />
Microscopia confocal<br />
Lamínulas foram monta<strong>da</strong>s <strong>em</strong> lâminas com líquido de montag<strong>em</strong> (Dako,<br />
Carpinteria, CA) e manti<strong>da</strong>s no escuro a 4° C. O modelo de microscópio Confocal<br />
LSM-410 (Axiovert-100; Zeiss, Gottingen, Al<strong>em</strong>anha) foi utilizado para analisar as<br />
células. A iluminação <strong>da</strong> amostra foi realiza<strong>da</strong> por meio de um laser de He-Ne com<br />
excitação a 543 nm e um filtro de <strong>em</strong>issão a 560 nm.<br />
Ativação de Caspase 3<br />
Após 16h de tratamento, as células foram soltas com tripsina e centrifuga<strong>da</strong>s<br />
a 3000 rpm durante 5 min. O sedimento foi ressuspenso <strong>em</strong> tampão RIPA (Tris-HCl<br />
53
50 mM, pH: 7,4; NaCl 150 mM, 1% NP40, com coquetel de inibidores de protease<br />
1μL/mL), e nova centrifugação após 30 min de incubação a 14000 rpm, durante 30<br />
min. Em segui<strong>da</strong> o sobrena<strong>da</strong>nte contendo a proteína total foi recuperado. A<br />
proteína total foi quantifica<strong>da</strong> por reagente BSA. Para a análise, 100 µg de proteína<br />
foi deposita<strong>da</strong> <strong>em</strong> gel de <strong>em</strong>pilhamento (4% de poliacrilami<strong>da</strong>) e corri<strong>da</strong>s <strong>em</strong> gel a<br />
10% de poliacrilami<strong>da</strong>. A eletroforese foi realiza<strong>da</strong> a 110 V durante 90 min. As<br />
proteínas foram transferi<strong>da</strong>s para uma m<strong>em</strong>brana de fluoreto de polivinilideno<br />
(PVDF, Immobilon-P, Millipore), a 100 V durante 1 h. O depósito igualitário <strong>da</strong><br />
quanti<strong>da</strong>de de proteína foi confirmado por coloração <strong>da</strong>s m<strong>em</strong>branas com vermelho<br />
Ponceau (Sigma). Em segui<strong>da</strong>, as m<strong>em</strong>branas foram bloquea<strong>da</strong>s durante 1 h à<br />
t<strong>em</strong>peratura ambiente, <strong>em</strong> 20 mmol/L Tris-solução salina tampona<strong>da</strong> (pH 7,5),<br />
contendo 0,05% de Tween 20 (TBS-T) e 5% de leite desnatado <strong>em</strong> pó.<br />
Subsequent<strong>em</strong>ente, as m<strong>em</strong>branas foram incuba<strong>da</strong>s com anticorpo de coelho anti-<br />
caspase 3 (1:1000, Santacruz, sc-7148), diluído <strong>em</strong> TBS-T contendo 1% de leite<br />
desnatado <strong>em</strong> pó, durante to<strong>da</strong> a noite. Anticorpo de cabra conjugado com fosfatase<br />
alcalina anti-IgG de coelho (1:5000 <strong>em</strong> TBS-T, Bio-Rad) foi usado como um<br />
anticorpo secundário. Ban<strong>da</strong>s imunorreativas foram visualiza<strong>da</strong>s utilizando o kit de<br />
substrato de AP-conjuga<strong>da</strong> (Bio-Rad), de acordo com as instruções do fabricante. A<br />
quantificação foi obti<strong>da</strong> por densitometria de varredura (ScanJet 4C, Hewlett<br />
Packard) e analisados com o software ImageJ 1.33u (Wayne Rasband, National<br />
Institutes of Health, EUA).<br />
Viabili<strong>da</strong>de celular<br />
A viabili<strong>da</strong>de celular foi avalia<strong>da</strong> através <strong>da</strong> integri<strong>da</strong>de <strong>da</strong> m<strong>em</strong>brana<br />
plasmática utilizando o método <strong>da</strong> exclusão ao Azul de Tripan. Tanto as células<br />
aderentes quanto as flutuantes, <strong>em</strong> placas de 35 mm de Ø (TPP Suíça), foram<br />
colhi<strong>da</strong>s após tripsinização (0,025% de tripsina, EDTA 0,50%) e centrifuga<strong>da</strong>s<br />
durante 5 minutos a 3000 rpm. As células foram suspensas <strong>em</strong> 200 µL de PBS e<br />
cora<strong>da</strong>s com Azul de Tripan, a uma concentração final de 0,1% (v / v). Oito placas<br />
replicatas foram usa<strong>da</strong>s para ca<strong>da</strong> análise. As células viáveis e<br />
não-viáveis (azuis) foram determina<strong>da</strong>s após 24 h de exposição a 30 μg/mL de ETA<br />
ou 7,5 μg/mL de F32 através <strong>da</strong> contag<strong>em</strong> do número de células <strong>em</strong> 10 µL de<br />
suspensão para ca<strong>da</strong> experimento. Os resultados obtidos foram expressos como a<br />
média ± desvio padrão (DP). Os efeitos de inibição ou indução de autofagia na<br />
54
viabili<strong>da</strong>de celular <strong>em</strong> co-culturas expostas a 30 µg/mL de TAE ou 7,5 µg/mL de F32,<br />
durante 24 horas foram analisados por meio de pré-incubação com 1 µM<br />
bafilomicina (inibidor de autofagia) durante 2 h, ou pré-incubação com meio de<br />
cultura s<strong>em</strong> soro fetal bovino durante 1 h (indução de autofagia).<br />
Determinação de alterações morfológicas<br />
As alterações morfológicas foram analisa<strong>da</strong>s e fotografa<strong>da</strong>s <strong>em</strong> um<br />
microscópio óptico de contraste de fase e usando uma câmera digital. O<br />
experimento foi realizado <strong>em</strong> placas de 3,5 Ø (TPP Suíça). Os efeitos de inibição ou<br />
indução de autofagia na morfologia <strong>da</strong>s células expostas a<br />
30 µg/mL de ETA ou 7,5 µg/mL de F32 durante 24 horas, foram analisados por uso<br />
de pré-incubação com um bafilomicina 1 µM durante 2 horas, para inibir a autofagia<br />
ou a pré-incubação com meio s<strong>em</strong> soro fetal bovino durante 1 h para induzir<br />
autofagia.<br />
Análises estatísticas<br />
Os resultados foram expressos <strong>em</strong> média ± desvio-padrão. One-way ANOVA<br />
seguido pelo teste de Student-Newmann-Keuls foram utilizados para determinar as<br />
diferenças estatísticas entre os grupos que difer<strong>em</strong> <strong>em</strong> apenas um parâmetro. Teste<br />
t de Student foi utilizado para as comparações entre dois grupos. Valores de p
Verificou-se que a exposição à 30 µg/mL de ETA ou 7,5μg/mL de F32, por 16<br />
h, induzidiu apoptose por aumento <strong>da</strong> expressão <strong>da</strong> caspase-3 ativa <strong>em</strong> co-culturas<br />
de neurônios/células gliais <strong>em</strong> comparação com a expressão de caspase-3 ativa de<br />
células <strong>em</strong> condições controle (DMSO a 0,1%) (Fig. 3).<br />
A formação autofagossomos foi analisa<strong>da</strong> <strong>em</strong> co-culturas de<br />
neurônios/células gliais transfecta<strong>da</strong>s com plasmídeos codificado para LC3-GFP,<br />
que produz fluorescência verde. A incubação de células transfecta<strong>da</strong>s com 30 µg/mL<br />
de ETA (7,948 ± 3,981%) ou 7,5 µg/mL de F32 (29,51 ± 10,55%), durante 12h,<br />
induziu a formação de vacúolos autofágicos (Fig. 4). Nenhum número significativo de<br />
células positivas com vacúolos autofágicos foi visualizado <strong>em</strong> células expostas ao<br />
veículo DMSO a 0,1%.<br />
Para estu<strong>da</strong>r a relação entre vacúolos autofágicos na morte celular induzi<strong>da</strong><br />
pelos alcaloides, co-culturas de neurônios/células gliais foram pré-incuba<strong>da</strong>s com 1<br />
µM de bafilomicina (um inibidor <strong>da</strong> V-ATPase), durante 2 h, ou pré-incuba<strong>da</strong>s<br />
durante 1 h na ausência de soro fetal bovino, para induzir autofagia. As células vivas<br />
e mortas foram conta<strong>da</strong>s <strong>em</strong> microscópio de contraste de fase após coloração com<br />
azul tripan (Fig. 5). Uma redução significativa na viabili<strong>da</strong>de <strong>da</strong>s células foi<br />
observa<strong>da</strong> <strong>em</strong> células incuba<strong>da</strong>s durante 24 h com 30 µg/mL de ETA ou 7,5 µg/mL<br />
de F32. Este teste de viabili<strong>da</strong>de celular, também revelou que a pré-incubação com<br />
1 µM de bafilomicina aumentou a morte celular induzi<strong>da</strong> por ETA, devido à inibição<br />
autofagia (A-). Enquanto que a privação de soro reduziu a morte celular por F32,<br />
devido à indução <strong>da</strong> autofagia (A+). Para esclarecer um possível efeito protetor <strong>da</strong><br />
autofagia induzi<strong>da</strong>, também investigamos a morfologia de neurônios e células gliais<br />
<strong>em</strong> co-culturas pré-incuba<strong>da</strong>s com 1 µM de bafilomicina, durante 2 h, ou pré-<br />
incubados na ausência de soro fetal bovino, durante 1 h. A morfologia foi analisa<strong>da</strong> e<br />
fotografa<strong>da</strong>s <strong>em</strong> um microscópio óptico de contraste de fase e imagens registra<strong>da</strong>s<br />
<strong>em</strong> câmara digital (Fig. 6). Observou-se <strong>em</strong> co-culturas nas condições controle<br />
(0,1% de DMSO, 0,1% de DMSO + 1 uM bafilomycin ou 0,1% de DMSO + privação<br />
de soro), neurônios possuindo dois ou mais neuritos sobre uma monocama<strong>da</strong> de<br />
astrócitos (Fig. 6 A, B, C ). No entanto co-culturas de neurônios/células gliais<br />
expostas a alcaloides (30μg/mL de ETA ou 7,5 μg/mL de F32) durante 24 h mostrou<br />
56
alterações estruturais <strong>nos</strong> astrócitos e perturbações na rede de neuritos (Fig. 6 D; G:<br />
seta indica uma célula neuronal corpo; asterisco indica astrócitos com alterações<br />
morfológicas). As mu<strong>da</strong>nças morfológicas de astrócitos foram mais intensas <strong>em</strong> co-<br />
culturas previamente incuba<strong>da</strong>s com bafilomicina e apresentou uma grande<br />
quanti<strong>da</strong>de de astrócitos com características morfológicas de células mortas (Fig. 6<br />
E, H: ponta de seta indica um astrócito morto; asterisco indica astrócitos com<br />
alterações morfológicas). Por outro lado, as alterações morfológicas <strong>em</strong> astrócitos e<br />
perturbações na rede de neuritos <strong>em</strong> co-culturas pré-incuba<strong>da</strong>s na ausência de soro<br />
fetal bovino foi me<strong>nos</strong> intensa. Tal forma que nesta condição, ain<strong>da</strong> havia alguns<br />
neurônios apresentando um único neurito (Fig. 6 F; I).<br />
4.4. Discussão<br />
Lesões neurohistológicas e ultraestruturais de bovi<strong>nos</strong> experimentalmente<br />
intoxicados com Prosopis juliflora foram caracteriza<strong>da</strong>s por vacuolização e inchado<br />
<strong>em</strong> mitocôndrias, com cristas mitocondriais desorienta<strong>da</strong>s, desintegra<strong>da</strong>s e<br />
desloca<strong>da</strong>s perifericamente <strong>em</strong> neurônios do núcleo motor de nervos crania<strong>nos</strong><br />
(TABOSA et al., 2006). Em <strong>nos</strong>sos estudos anteriores, foi d<strong>em</strong>onstrado que doses<br />
subtóxicas de extrato de alcaloides (ETA) induziram alteração na forma e tamanho<br />
mitocondrial e F32 induziu desintegração de cristas mitocôndrias <strong>em</strong> co-culturas de<br />
neurônios/células gliais (Primeiro capítulo desta Tese). Neste estudo, foi<br />
d<strong>em</strong>onstrado que o tratamento de co-culturas de neurônios/células gliais com 30<br />
µg/mL de ETA ou 7,5 µg/mL de F32, por 12 h, inibe o metabolismo mitocondrial e<br />
induz uma per<strong>da</strong> no potencial de m<strong>em</strong>brana mitocondrial. Ain<strong>da</strong>, mostramos que<br />
ETA e F32 induziu ativação de caspase-3 após 16 h de incubação e morte celular<br />
<strong>em</strong> 24 h de incubação, sugerindo que os alcaloides de P. juliflora induz<strong>em</strong> uma<br />
morte celular com características iniciais de apoptose. Esta deve estar relaciona<strong>da</strong><br />
com o <strong>da</strong>no mitocondrial mostrado nas células após 12 h de exposição, uma vez que<br />
estudos têm d<strong>em</strong>onstrado que as caspases 3 e 7 são mediadores críticos de de<br />
apoptose por acometimentos mitocondriais (LAKHANI et al., 2006). Além disso, as<br />
mitocôndrias des<strong>em</strong>penham um papel fun<strong>da</strong>mental <strong>em</strong> desencadear a morte celular<br />
por apoptose, uma vez que a sobrecarga de cálcio mitocondrial (Ca 2+ ) é uma <strong>da</strong>s<br />
formas pró-apoptóticas para induzir o inchaço <strong>da</strong>s mitocôndrias, com perturbação ou<br />
ruptura <strong>da</strong> m<strong>em</strong>brana exterior, e por sua vez a liberação de fatores mitocondriais<br />
apoptóticos para o citossol (GIORGI et al., 2012).<br />
57
É sabido que intoxicação de animais por P. juliflora induz vacuolização<br />
citoplasmática <strong>em</strong> neurônios (TABOSA et al, 2000a; TABOSA et al, 2006; CÂMARA<br />
et al., 2009). Nossos estudos anteriores caracterizaram in vitro os vacúolos<br />
citoplasmáticos induzidos por alcaloides piperidínicos <strong>da</strong> P. juliflora, como vacúolos<br />
autofágicos (Primeiro capítulo desta Tese). No presente estudo, mostramos que ETA<br />
e F32 induziram <strong>em</strong> co-culturas transfecta<strong>da</strong>s com GFP-LC3 um aumento<br />
significativo no número de células com vacúolos autofágicos. A proteína LC3 t<strong>em</strong><br />
sido usa<strong>da</strong> como um marcador específico para a quantificação de autofagossomos e<br />
a sobre-expressão de GFP-LC3 é um método de avaliação b<strong>em</strong> aceito, simples e<br />
específico que não perturba o número de autofagossomos pela metodologia<br />
(TANIDA & WAGURI, 2010). Sabe-se que a autofagia des<strong>em</strong>penha um papel<br />
importante na eliminação <strong>da</strong>s organelas <strong>da</strong>nifica<strong>da</strong>s, tais como a mitocôndria e<br />
constitu<strong>em</strong> proteção contra a morte celular programa<strong>da</strong> induzi<strong>da</strong> por disfunção<br />
mitocondrial <strong>em</strong> células neuronais (PARIS et al., 2011). Esta ocorre <strong>em</strong> vários<br />
passos como se segue: a formação de fagóforos, formação de autofagossomos<br />
maduros, alvo e tráfico de autofagossomos para lisossomos, formação de<br />
autolisossomos por fusão entre autofagossomos e lisossomos, e, finalmente, a<br />
degra<strong>da</strong>ção dos corpos autofágicos dentro dos lisossomos (YAMAMOTO et al. ,<br />
2010). Além disso, sabe-se que os vários passos <strong>da</strong> autofagia pod<strong>em</strong> ser<br />
monitorados por movimento do GFP-LC3 por microscopia de fluorescência, uma vez<br />
que o sinal fluorescente de GFP é mais sensível a pH ácido, que, implica que GFP-<br />
LC3 é consumido dentro de autolisossomos recém-formados (Para revisão ver<br />
KLIONSKY et al., 2012). Deste modo, o aumento do número de células expostas<br />
aos alcaloides de ETA e F32 acumulando GFP-LC3 é sugestivo de defeito na fusão<br />
de autofagossomos com lisossomos que pod<strong>em</strong> por sua vez inibir a eliminação de<br />
organelas <strong>da</strong>nifica<strong>da</strong>s, tais como mitocôndrias, e subsequente proteção contra a<br />
morte celular programa<strong>da</strong>. Nós ain<strong>da</strong> d<strong>em</strong>onstramos que a pré-incubação com<br />
bafilomicina aumentou a morte celular por ETA, e a privação de soro reduziu a morte<br />
celular induzi<strong>da</strong> por F32. No entanto, para ambos os tratamentos (ETA e F32)<br />
neurônios e células gliais apresentaram alterações morfológicas mais intensas<br />
quando as células foram pré-incuba<strong>da</strong>s com bafilomicina, ou me<strong>nos</strong> intensa quando<br />
pré-incuba<strong>da</strong>s com a privação de soro. Bafilomicina A1 é um inibidor de H + -ATPase<br />
vacuolar, que suprime macroautofagia, impedindo a acidificação dos lisossomos e<br />
58
perturbação na sequência <strong>da</strong> fusão entre autofagossomos e lisossomos<br />
(DEGTYAREV et al, 2008; WU et al, 2009). Por outro lado, o estresse nutricional<br />
induzido por privação de soro, ativa autofagia (TRONCOSO et al, 2012; YANG el al,<br />
2008). Além disso, foi d<strong>em</strong>onstrado que autofagia pode ser ativa<strong>da</strong> <strong>em</strong> células<br />
neuronais <strong>em</strong> resposta a lesões e sugeri<strong>da</strong> ter um papel na proteção de células<br />
contra as doenças neurodegenerativas (SARKAR et al, 2007; PARIS et al., 2011).<br />
Autofagia e apoptose não são vias exclusivas, elas poderiam ocorrer <strong>em</strong> sinergia,<br />
onde ambas as vias são interliga<strong>da</strong>s. É possível que tanto a parte de apoptose e<br />
quanto autofagia se forme de um mesmo mecanismo, onde a autofagia atua como<br />
um antagonista para bloquear a apoptose e promover a sobrevivência <strong>da</strong> célula<br />
(EISENBERG-LERNER et al., 2009).<br />
Em conclusão, <strong>nos</strong>sos resultados suger<strong>em</strong> que o mecanismo de morte<br />
induzi<strong>da</strong> <strong>em</strong> neurônios e células gliais por alcaloides <strong>da</strong> P. juliflora envolve apoptose<br />
<strong>em</strong> resposta ao <strong>da</strong>no mitocondrial e inibição do fluxo <strong>da</strong> autofagia. Além disso, a<br />
autofagia induzi<strong>da</strong> protege estas células contra a morte celular programa<strong>da</strong>.<br />
4.5 Agradecimentos<br />
Este trabalho foi financiado pelo CNPq (Conselho Nacional de<br />
Desenvolvimento Científico e Tecnológico) e FONDECYT 1100165.<br />
59
4.6 Referencias<br />
AHMAD, V.U. Natural Product Ch<strong>em</strong>istry. In: Atta-Ur-Rahman Springer-Verlag<br />
Berlin editors. Ch<strong>em</strong>ical constituents of some medicinal plants of Pakistan. p.8-11,<br />
1986<br />
AHMAD, V.U.; MOHAMMAD, Z.G. Studies on the structure of Juliflorine. Journal<br />
Ch<strong>em</strong>istry Soc. Pakistan, v.1, n.2, p.137-138, 1979.<br />
AHMAD, V.U.; QAZI, S. Studies on the structure of julifloricine. Journal Ch<strong>em</strong>istry<br />
Soc. Pakistan. v.7, n.4, p. 347-350,1985.<br />
AHMAD, V.U.; SULTANA, A.; QAZI, S. Alkaloids from the leaves of Prosopis juliflora.<br />
Journal of Natural Products, v.52, n.3, p.497-501, 1989.<br />
ALMARAZ-ABARCA, N.; CAMPOS, M.G.; ÁVILA-REYES, J.A.; NARANJO-<br />
JIMÉNEZ, N.; CORRAL, H.; GONZÁLEZ-VALDEZ, L.S. Antioxi<strong>da</strong>nt activity of<br />
polyphenolic extract of monofloral honeybee-collected pollen from mesquite<br />
(Prosopis juliflora, Legumi<strong>nos</strong>ae). Journal of Food Composition and Analysis, v.<br />
20, n. 2, p. 119–124, 2007.<br />
AL-SHAKH-HAMED, W.M.A.; AL-JAMMAS, M.A. The antimicrobial activity of<br />
alkaloi<strong>da</strong>l fraction of Prosopis juliflora. Iraqi J. Vet Sci. v.12, p.281-287, 1999.<br />
AQEEL AHMAD; AHMAD, V.; KHALID, S. M.; SIDDIQUI, S. A.; KHAN, K. A. Study of<br />
the antibacterial therapeutic efficacy of juliflorine, julifloricine and a benzene insoluble<br />
alkaloi<strong>da</strong>l fraction of Prosopis juliflora. J of Islamic Acad of Sci, v. 8, p.131-136,<br />
1995.<br />
AQEEL AHMAD; KHAN, K.A.; AHMAD, V.U.; QAZI, S..Antibacterial activity of<br />
juliflorine isolated from Prosopis juliflora. Planta Medica, v.1, p.285-288, 1986a.<br />
AQEEL AHMAD; KHURSHEED, A.K.; SABIHA, Q.; VIQARUDDIN, A. Antifungial<br />
activity of some hydrosoluble Prosopis juliflora alkaloids. Fitoterapia. v.60, p.86-89,<br />
1989.<br />
60
AQEEL AHMAD; KHURSHEED, A.K.; VIQARUDDIN, A.; SABIHA, Q. Antimicrobial<br />
activity of julifloricine isolated from Prosopis juliflora. Arzneim. - Forsch./ Drug Res.<br />
v.39, p.652-655,1989.<br />
BATATINHA, M.J..M; , ALMEIDA, G.N.;, DOMINGUES, L.F.; SIMAS, M.M.S.; ,<br />
BOTURA, M.B.; CRUZ, A.C.F. G.; ALMEIDA, M.A.O. Efeitos dos extratos aquoso e<br />
metanólico de algaroba sobre culturas de larvas de n<strong>em</strong>atódeos gastrintestinais de<br />
capri<strong>nos</strong>. Ci. anim. bras. v.12, n.3, p. 514-519, 2011.<br />
BURKART, A.A.. Monograph of the genus Prosopis (Legumi<strong>nos</strong>ae subfam.<br />
Mimosoideae). Journal of the Arnold Arboretum, v.57, n.4, p.450-525, 1976.<br />
CÁ-CERES, A.; MENÉNDEZ, H.; MÉNDEZ, E.; COHOBÓN, E.; SAMAYOA, B.E.;<br />
JAUREGUI, E. Antigonorrhoeal activity of plants used in Guat<strong>em</strong>ala for the treatment<br />
of sexually transmitted diseases. J Ethnopharmacol, v.48, p.85-88, 1995.<br />
CÂMARA, A.C.L.; COSTA, N.A.; RIET-CORREA F.; AFONSO, J.A.B.; DANTAS,<br />
A.F.M.; MENDONÇA, C.L.; SOUZA; M.I. Intoxicação espontânea por vagens de<br />
Prosopis juliflora (Leg. Mimosoideae) <strong>em</strong> bovi<strong>nos</strong> no Estado de Pernambuco. Pesq.<br />
Vet. Brás. v. 29, p. 233-240, 2009.<br />
CHOGE, S.K.; PASIECZNIK, N.M.; HARVEY, M.; WRIGHT, J.; AWAN, S.Z.;<br />
HARRIS, P.J.C. Prosopis pods as human food, with special reference to Kenya.<br />
Water SA, v.33, p. 419 – 424, 2007.<br />
CHOUDHARY, M.I.; NAWAZ, S.A.; ZAHEER-UL-HAQ AZIM, M.K.; GHAYUR, M.N.;<br />
LODHI, M.A.; JALIL, S.; KHALID, A.; AHMED, A.; RODE, B.M.; ATTA-UR-RAHMAN.;<br />
GILANI, A.U.; AHMAD, V.U. Juliflorine: a potent natural peripheral anionic-site-<br />
binding inhibitor of acetylcholinesterase with calcium-channel blocking potential, a<br />
leading candi<strong>da</strong>te for Alzheimer's disease therapy. Bioch<strong>em</strong> Biophys Res<br />
Commun. v.332, p.1171-1177, 2005.<br />
61
DEGTYAREV, M , DE MAZIÈRE, A. , ORR, C.; LIN, J.; LEE, B.B.; JANET Y. TIEN,<br />
J.Y.; WEI W. PRIOR, W.W.; DIJK, S.V.; WU, H.; GRAY, D.C.; DAVIS, D.P.; STERN,<br />
H.M.; MURRAY, L.J.; HOEFLICH, K.P; KLUMPERMAN, J , FRIEDMAN, L.S.; KUI<br />
LIN, K. Akt inhibition promotes autophagy and sensitizes PTEN-null tumors to<br />
lysosomotropic agents. The journal of cell biology, v. 183, p. 1, 2008.<br />
EISENBERG-LERNER, A., BIALIK, S., SIMON, H. U., AND KIMCHI, A. Life and<br />
death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between th<strong>em</strong>. Cell Death<br />
Differ. v. 16, p. 966–975, 2009.<br />
GIORGI, C.; BALDASSARI, F.; BONONI, A; BONORA, M.; DE MARCHI, E.;<br />
MARCHI, S.; MISSIROLI, S.; PATERGNANI, S.; RIMESSI, A.; SUSKI J.M.;<br />
WIECKOWSKI, M.R.; PAOLO PINTON. P. Mitochondrial Ca 2+ and apoptosis. Cell<br />
Calcium v. 52, p. 36– 43, 2012.<br />
KANTHASAMY, A.; SUBRAMANIAN, S.; GOVINDASAMY, S. Bacterici<strong>da</strong>l and<br />
fungici<strong>da</strong>l effects of Prosopis juliflora alkaloi<strong>da</strong>l fraction. Indian Drugs, v.26, p.390-<br />
394,1989.<br />
KAUSHIK, J.C.; SANJAY, A.; TRIPATHI, N.N. Antifungal properties of some plant<br />
extracts against the <strong>da</strong>mping-off fungi of forest nurseries. Indian J Forestry, v.25,<br />
p.359-361, 2002.<br />
KLIONSKY, D.J.; ABDALLA, F.C.; ABELIOVICH, H.; ABRAHAM, R.T. Guidelines for<br />
the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy, v. 8, n. 4,<br />
p. 1–100, 2012.<br />
LAKHANI SA; MASUD A; KUIDA K; PORTER GA JR; BOOTH CJ; MEHAL<br />
WZ; INAYAT I; FLAVELL RA. Caspases 3 and 7: key mediators of mitochondrial<br />
events of apoptosis. Science. v. 10, n. 311 (5762), p.847-851, 2006.<br />
MORENO, G.M.B.; CASTRO, K.J.; CAVALCANTE, M.A.B.; CIDRÃO, P.M.L.;<br />
CARNEIRO, H.A.V.; NEIVA, J.N.M. Consumo de matéria seca, ganho de peso e<br />
62
conversão alimentar de ovi<strong>nos</strong> alimentados com dietas orgânicas. Anais do 42ª<br />
reunião anual <strong>da</strong> socie<strong>da</strong>de brasileira de zootecnia, 2005.<br />
NAKANO, H.; NAKAJIMA, E.; FUJII, Y.; SHIGEMORI, H.; HASEGAWA, K. Growth<br />
inhibitory alkaloids from mesquite (Prosopis juliflora (Sw.) DC.) leaves.<br />
Phytoch<strong>em</strong>istry, v.65, n.5, p.587-591, 2004.<br />
OTT-LONGONI, R.; VISWANATHAN, N.; HESSE, M.. Die konstitution des Alkaloides<br />
Juliprosopin aus Prosopis juliflora A. DC. Helvetica Chimica Acta, v.63, p.2119-<br />
2129, 1980.<br />
PARIS, I.; MUÑOZ, P.; HUENCHUGUALA, S.; COUVE, E.; SANDERS, L.H.;<br />
GREENAMYRE, J.T.; CAVIEDES, P.; SEGURA-AGUILAR, J. Autophagy Protects<br />
Against Aminochrome-Induced Cell Death in Substantia Nigra-Derived Cell Line.<br />
Toxicological sciences. 121: 376–388, 2011.<br />
PASIECZNIK N.M., FELKER P., HARRIS P.J.C., HARSH L.N., CRUZ G., TEWARI<br />
J.C., CADORET K., AND MALDONADO L.J. The Prosopis juliflora – Prosopis palli<strong>da</strong><br />
Complex: A Monograph. HDRA, Coventry, UK. 162p, 2001.<br />
ROSSI, B.; CARRER, C.R.O.; CURY, B.; BRITO, C.A.M.F.; PIRES, J.M.; MARÇOLA,<br />
P.L.; COSTA CARRER,C.C. Utilização <strong>da</strong> vag<strong>em</strong> de Prosopis juliflora d.c na<br />
alimentação de ruminantes. Associaçao Brasileira de Zootecnia, 2009.<br />
SARKAR, S.; DAVIES, E.J.; HUANG, Z.; TUNNACLIFFE, A.; RUBINSZTEIN, D.C.<br />
Trehalose, a Novel mTOR-independent Autophagy Enhancer, Accelerates the<br />
Clearance of Mutant Huntingtin and α-Synuclein. The journal of biological<br />
ch<strong>em</strong>istry, v. 282, n. 8, p. 5641–5652, 2007.<br />
SATISH, S.; RAVEESHA, K.A.; JANARDHANA, G.R. Antibacterial activity of plant<br />
extracts on phytopathogenic Xanthomonas campestris pathovars. Let in Applied<br />
Microbiology, v.28, p. 145-147, 1999.<br />
63
SILVA, A.M.M.; SILVA, A.R.; PINHEIRO, A.M.; FREITAS, S.R.V.B.; SILVA, V. D.A.;<br />
SOUZA, C.S.; VELOSO, E.S.; ELBACHÁ, R.S.; COSTA, M.F.D.; COSTA, S.L.<br />
Alkaloids from Prosopis juliflora leaves induce glial activation, cytotoxicity and<br />
stimulate NO production. Toxicon, v.49, p.601-614, 2007.<br />
SILVA, J. H. V.; OLIVEIRA, J. N. C.; SILVA, E. L.; JORDÃO FILHO, J. ; RIBEIRO, M.<br />
L. G. Uso <strong>da</strong> farinha integral de vag<strong>em</strong> de algaroba (Prosopis juliflora (Sw) D.C.) na<br />
alimentação de codornas japonesas. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 31, n.3,<br />
p.1789-1795, 2002a.<br />
SILVA, J. H. V.; SILVA. E; L; JORDÃO FILHO, J.; TOLEDO, R. S.; ALBINO, L .F. T.;<br />
RIBEIRO, M. L. G. ; COUTO, H. P. Valores energéticos e efeitos <strong>da</strong> inclusão de<br />
farinha integral de vag<strong>em</strong> de algaroba (Prosopis juliflora (Sw.) D. C.) <strong>em</strong> rações de<br />
poedeiras comerciais. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 31, n.6, p. 2255 – 2264,<br />
2002b.<br />
SILVA, V.D.A; PITANGA, B.S; NASCIMENTO, R.P.; SOUZA; C.S.; COELHO, P.L.C.;<br />
MENEZES-FILHO, N.; SILVA, A.M.M.; COSTA, M.F.D; EL-BACHÁ, R.S.; VELOZO,<br />
E.S.; COSTA, S.L. Piperidine alkaloids from Prosopis juliflora leaves induce<br />
mitochondrial <strong>da</strong>mage and cytoplasmic vacuolation on co-cultured glial cells and<br />
neurons. Submeted to Toxicologic Pathology, 2012.<br />
STEIN, R.B.S.; TOLEDO, L.L.A.; ALMEIDA, F.Q.; ARNAUT, A.C.; PATITUCCI, L.T.;<br />
SOARES NETO, J.; COSTA, V.T.M. Uso do Farelo de Vag<strong>em</strong> de Algaroba (Prosopis<br />
juliflora (Swartz) D.C. <strong>em</strong> Dietas para Eqüi<strong>nos</strong>. Revista Brasileira de Zootecnia,<br />
v.34, n.4, p.1240-1247, 2005.<br />
TABOSA, I.M.; QUINTANS-JR, L.J; PAMPLONA, F.V; ALMEIDA, R.N.; CUNHA,<br />
E.V.L.DA; SILVA, M.S.DA; SOUZA, J.C.DA A; BARBOSA FILHO, J.M. Isolamento<br />
biomonitorado de alcaloides tóxicos de Prosopis juliflora (algaroba). Revista<br />
Brasileira de Farmacog<strong>nos</strong>ia, v. 9/10, p 11-22, 2000b.<br />
TABOSA, I.M.; RIET-CORREA, F.; BARROS, S.S.; SUMMERS, B. A.; SIMÕES, S.<br />
V.D.; MEDEIROS, R.M.T.; NOBRE, V.M.T. Neurohistologic and ultrastructural<br />
64
lesions in cattle experimentally intoxicated with the Plant Prosopis juliflora. Vet<br />
Pathol, v.43, p.695–701, 2006.<br />
TABOSA, I.M.; SOUZA, J.C.A.; GRAÇA, D.L.; BARBOSA-FILHO, J.M.; ALMEIDA,<br />
R.N.; RIET-CORREA, F. Neuronal vacuolation of the trig<strong>em</strong>inal nuclei in goats<br />
caused by ingestion of Prosopis juliflora pods (Mesquite beans). Vet and Human<br />
Toxico, v.42 n.3, p.155-158., 2000a.<br />
TRONCOSO R, VICENCIO JM, PARRA V, NEMCHENKO A, KAWASHIMA Y, DEL<br />
CAMPO A, TORO B, BATTIPROLU PK, ARANGUIZ P, CHIONG M, YAKAR<br />
S, GILLETTE TG, HILL JA, ABEL ED, LEROITH D, LAVANDERO S. Energy-<br />
preserving effects of IGF-1 antagonize starvation-induced cardiac autophagy.<br />
Cardiovasc Res. v. 1; n. 93(2); p 320-329, 2012.<br />
WU, Y.C.; WU, W.K.K.; LI, Y.; LI, L.Y.Z, J.; WONG, C.C.M.; LI, H.T.; SUNG, J.J.Y.;<br />
CHO, C.H. Inhibition of macroautophagy by bafilomycin A1 lowers proliferation and<br />
induces apoptosis in colon cancer cells. Bioch<strong>em</strong>ical and Biophysical Research<br />
Communications v. 382, p. 451–456, 2009.<br />
YAMAMOTO, M., SUZUKI, S. O., AND HIMENO, M. The effects of dynein inhibition<br />
on the autophagic pathway in glioma cells. Neuropathology. v 30, p. 1–6, 2010.<br />
YANG, Y.; XU, K.; KOIKE, T.; ZHENG, X..Transport of autophagosomes in neurites<br />
of PC12 cells during serum deprivation. Autophagy. v 4, n.2, p. 243-245, 2008.<br />
65
Figura 1 – Níveis de ATP por luminescência <strong>em</strong> condições<br />
controle (0.1% DMSO) ou na presença de 30 µg/mL ETA<br />
ou 7,5 µg/mL F32, for 12 h. *p
Figura 2 – Análise de alterações no potencial de<br />
m<strong>em</strong>brana mitocondrial por coloração com JC-1 <strong>em</strong> cocultura<br />
de neurônio/células gliais visualiza<strong>da</strong> por<br />
microscopia confocal. As figuras mostram células<br />
incuba<strong>da</strong>s na ausência (A - B, 0.1% DMSO) ou presença<br />
de 30µg/mL de ETA (C - D) ou 7.5µg/mL de F32 (E - F),<br />
por 12 h. Em células saudáveis o JC-1 apresenta-se como<br />
um monômero no citossol (verde, B) e também como<br />
acúmulo de agregados na mitocôndria, que cora <strong>em</strong><br />
vermelho (A). Na per<strong>da</strong> de potencial de m<strong>em</strong>brana<br />
mitocondrial JC-1 não pode acumular-se dentro <strong>da</strong>s<br />
mitocôndrias (C - E).<br />
67
29 KDa<br />
17 KDa<br />
Cont.<br />
Pró-caspase 3<br />
Caspase-3 cliva<strong>da</strong><br />
Figura 3 - Ativação de caspase-3 <strong>em</strong> co-culturas de neurônios/células<br />
gliais <strong>em</strong> condições controle (0.1% DMSO) ou trata<strong>da</strong>s durante 16 h com<br />
30 µg/mL de ETA ou 7,5µg/mL de F32 foi determina<strong>da</strong> por análises de<br />
western blotting (A). A quantificação foi obti<strong>da</strong> por escaneamento e<br />
análise de densitometria usando o programa ImageJ 1.33u. O gráfico de<br />
barras representa a expressão relativa de caspase-3 cliva<strong>da</strong> (B).<br />
ETA<br />
F32<br />
68
D<br />
% de células LC3 (+) / DAPI (+)<br />
C o n t . E T A F 3 2<br />
Figura 4 - Determinação de vesículas de autofagossomos<br />
<strong>em</strong> co-culturas de neurônios/células gliais transfecta<strong>da</strong>s<br />
com GFP-LC3. Células transfecta<strong>da</strong>s foram trata<strong>da</strong>s com<br />
0.1% DMSO (A), 30µg/mL de ETA (B), 7,5µg/mL de F32<br />
(C), por 12h. A, B e C são amostras com luz incidindo com<br />
filtro de 543-nm de excitação e filtro de 560 nm de <strong>em</strong>issão<br />
para visualizar fluorescência verde. Em D, a quantificação<br />
do número de células DAPI (+) com vacúolos autofágicos<br />
(LC3+) (*p < 0.05; ***p < 0.001).<br />
69
A<br />
B<br />
% de cálulas viáveis<br />
% de células viáveis<br />
100<br />
50<br />
0<br />
100<br />
50<br />
0<br />
Cont<br />
Cont<br />
(Aut.-)<br />
Aut. (-)<br />
Aut. (+)<br />
Aut. (+)<br />
Figura 5 – O efeito <strong>da</strong> inibição ou indução de autofagia <strong>em</strong> células<br />
expostas a 30 µg/mL de ETA (A) ou 7,5 µg/mL de F32 (B) por 24 h<br />
foi analisado por pré-incubação por 2h com bafilomicina, que é<br />
um inibidor de V-ATPase “Aut.(-)” ou pré- incubação por 1h na<br />
ausência de soro fertal bovino no meio de cultura, como indutor de<br />
autofagia “Aut.(+)”. A viabili<strong>da</strong>de celular foi mensura<strong>da</strong> por<br />
contag<strong>em</strong> de células viáveis e mortas após coloração com Azul de<br />
Tripan. Em (A), um aumento significativo na quanti<strong>da</strong>de de células<br />
mortas foi observado quando as células foram pré-incuba<strong>da</strong>s com<br />
bafilomicina. Em (B) uma redução significante na morte celular<br />
observa<strong>da</strong> <strong>em</strong> células pré-incuba<strong>da</strong>s com meio s<strong>em</strong> soro, <strong>em</strong><br />
comparação com células apenas incuba<strong>da</strong>s com ETA e F32. A<br />
significância estatística foi avalia<strong>da</strong> usando ANOVA para<br />
múltiplas comparações e Newman-Keuls. Valores <strong>da</strong>s amostras<br />
controle foram fixados <strong>em</strong> 100 %; **p
A B C<br />
D E F<br />
*<br />
*<br />
G H I<br />
*<br />
*<br />
*<br />
*<br />
Figura 6 – Efeitos <strong>da</strong> inibição ou indução de autofagia na<br />
morfologia de neurônios e células gliais co-cultivados<br />
expostos a 30 µg/mL de ETA (D; E; F); 7,5 µg/mL de F32<br />
(G; H; I) ou condições controle (A; B; C) durante 24h, foi<br />
analisado e fotografado <strong>em</strong> um microscópio de contraste de<br />
fase e câmara digital. Para a inibição de autofagia, as<br />
células foram pré-incuba<strong>da</strong>s com 1µM de bafilomicina,<br />
durante 2h (B; E’ H). Para induzir autofagia , células foram<br />
pré-incuba<strong>da</strong>s com meio de cultura s<strong>em</strong> soro fetal bovino por<br />
1 h (C; F; I). Setas indicam corpos de neurônios; pontas de<br />
seta indicam astrócitos mortos; asteriscos indicam astrócitos<br />
com alterações morfológicas. Objetiva 40x0,70; barra de<br />
escala = 1 µm.<br />
*<br />
71
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS<br />
Os estudos apresentados nesta <strong>tese</strong> vêm contribuir para eluci<strong>da</strong>r os impactos<br />
neurológicos observados <strong>em</strong> animais intoxicados pelo consumo <strong>da</strong> Prosopis juliflora,<br />
uma planta de grande importância para a alimentação de animais e huma<strong>nos</strong> na<br />
região Nordeste do Brasil, no sentido <strong>em</strong> que caracterizamos os alcaloides<br />
juliprosopina e juliprosina como os componentes ativos <strong>da</strong> fração de maior<br />
toxici<strong>da</strong>de para células do sist<strong>em</strong>a nervoso central e correlacionamos efeitos in vitro,<br />
tais como ativação de células gliais, morte de neurônios, <strong>da</strong><strong>nos</strong> mitocondriais e<br />
vacuolização citoplasmática induzidos por estes alcaloides, com as lesões<br />
histológicas e ultraestruturais visualiza<strong>da</strong>s <strong>em</strong> bovi<strong>nos</strong> e capri<strong>nos</strong> intoxicados pela P.<br />
juliflora, conforme descrito na literatura. Ain<strong>da</strong> sugerimos a mitocôndria como a<br />
organela alvo destes alcaloides na célula, o que desencadeia um processo<br />
autofágico, de caráter protetor, que, no entanto apresenta-se interrompido pela<br />
própria ação destes alcaloides, conduzindo à célula à morte celular por apoptose.<br />
A eluci<strong>da</strong>ção dos impactos neurológicos gerados pelos alcaloides <strong>da</strong><br />
P. juliflora e ain<strong>da</strong>, o esclarecimento dos mecanismos de ação destes princípios<br />
ativos, assim como os mecanismos de inibição dos efeitos deletérios gerados pelos<br />
mesmos, servirão como norteadores para pesquisas aplica<strong>da</strong>s que vis<strong>em</strong> contribuir<br />
para a prevenção e tratamento de intoxicações animais por consumo de vagens <strong>da</strong><br />
P. juliflora. Com isso o fornecimento deste vegetal de alta quali<strong>da</strong>de nutricional como<br />
alimento para bovi<strong>nos</strong> e capri<strong>nos</strong>, poderá ser amplificado, o que solucionará<br />
probl<strong>em</strong>as econômicos do setor agropecuário, decorrentes de períodos de escassez<br />
de água que ocorre <strong>em</strong> algumas regiões do Brasil.<br />
72
6. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS<br />
ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A.H.; POBER, J.S. Imunologia Celular e Molecular. Livraria<br />
e Editora Revinter, 2003.<br />
ACHOUR S.B.; PASCUAL, O. Astrocyte–Neuron Communication: Functional<br />
consequences. Neuroch<strong>em</strong> Res. DOI 10.1007/s11064-012-0807-0, 2012.<br />
AGULHON, C.; SUN, M.; MURPHY, T.; MYERS, T.; LAUDERDALE, K.; FIACCO,<br />
T.A.. Calcium signaling and gliotransmission in normal vs.reactive astrocytes.<br />
Frontiers in Pharmacology. Neuropharmacology, v. 3, 2012.<br />
AHMAD, A.; KHAN, K.A; AHMAD, V.U. Immunomodulating effect of Juliflorine on the<br />
antibody response to listeria h<strong>em</strong>olysin preliminary report. Journal of Islamic<br />
Acad<strong>em</strong>y of Sciences, v.5, p.189-193, 1992.<br />
AHMAD, V.U. Natural Product Ch<strong>em</strong>istry. In: Atta-Ur-Rahman Springer-Verlag<br />
Berlin editors. Ch<strong>em</strong>ical constituents of some medicinal plants of Pakistan. p.8-11,<br />
1986.<br />
AHMAD, V.U.; MOHAMMAD, Z.G. Studies on the structure of Juliflorine. Journal<br />
Ch<strong>em</strong>istry Soc. Pakistan, v.1, n.2, p.137-138, 1979.<br />
AHMAD, V.U.; QAZI, S. Studies on the structure of julifloricine. Journal Ch<strong>em</strong>istry<br />
Soc. Pakistan. v.7, n.4, p. 347-350,1985.<br />
AHMAD, V.U.; SULTANA, A.; QAZI, S. Alkaloids from the leaves of Prosopis juliflora.<br />
Journal of Natural Products, v.52, n.3, p.497-501, 1989.<br />
ALMARAZ-ABARCA, N.; CAMPOS, M.G.; ÁVILA-REYES, J.A.; NARANJO-<br />
JIMÉNEZ, N.; CORRAL, H.; GONZÁLEZ-VALDEZ, L.S. Antioxi<strong>da</strong>nt activity of<br />
polyphenolic extract of monofloral honeybee-collected pollen from mesquite<br />
(Prosopis juliflora, Legumi<strong>nos</strong>ae). Journal of Food Composition and Analysis, v.<br />
20, n. 2, p. 119–124, 2007.<br />
ALOISI, F. Immune function of microglia. Glia, v. 36, n.2, p. 165-179, 2001.<br />
73
AL-SHAKH-HAMED, W. M. A.; AL-JAMMAS, M. A. The antimicrobial activity of<br />
alkaloi<strong>da</strong>l fraction of Prosopis juliflora. Iraqi Journal Veterinary Science, v. 12, p.<br />
281-287, 1999.<br />
APERIA, A., BERTORELLO, A., SERI, I. Dopamine causes inhibition of Na+-<br />
K+ATPase 686 activity in rat proximal convoluted tubule segments. Am.J.Physiol, v.<br />
252, p. 39–45, 1987.<br />
AQEEL AHMAD, A.; ALI KHAN K.; AHMAD V.U. QAZI S. Antibacterial activity of<br />
juliflorine isolated from Prosopis juliflora. Planta Medica, v.1, p. 285-288, 1986.<br />
AQEEL AHMAD; AHMAD, V.; KHALID, S. M.; SIDDIQUI, S. A.; KHAN, K. A. Study of<br />
the antibacterial therapeutic efficacy of juliflorine, julifloricine and a benzene insoluble<br />
alkaloi<strong>da</strong>l fraction of Prosopis juliflora. J of Islamic Acad of Sci, v. 8, p.131-136,<br />
1995.<br />
AQEEL AHMAD; KHAN, K.A.; AHMAD, V.U.; QAZI, S. Antibacterial activity of<br />
juliflorine isolated from Prosopis juliflora. Planta Medica, v.1, p.285-288, 1986a.<br />
AQEEL AHMAD; KHURSHEED, A.K.; SABIHA, Q.; VIQARUDDIN, A. Antifungial<br />
activity of some hydrosoluble Prosopis juliflora alkaloids. Fitoterapia. v.60, p.86-89,<br />
1989b.<br />
AQEEL AHMAD; KHURSHEEDM, A.K.; SABIHA, Q.; VIQARUDDIN, A. Antifungial<br />
activity of some hydrosoluble Prosopis juliflora alkaloids. Fitoterapia, v. 60, p. 86-89,<br />
1989.<br />
AQUEEL AHMAD; KHURSHEED, A.K.; VIQARUDDIN, A. Toxicological studies of<br />
the antimicrobial alkaloid juliflorine. Arzneimittelforschung. v. 41; n. 2; p. 151-154,<br />
1991.<br />
ARDUINO, D, M.; ESTEVES, R.; CARDOSO, S. Mitochondrial Fusion/Fission,<br />
Transport and Autophagy in Parkinson’s Disease: When Mitochondria Get Nasty.<br />
Parkinson’s Disease. Article. ID 767230, 2011.<br />
74
AZEVEDO, G. Algaroba. Rio de Janeiro: Serviço de Informação Agrícola, 31p. SIA,<br />
843), 1961.<br />
AZEVEDO, G. de. Algaroba. Natal, RN: [s.n}, 13p, 1955.<br />
BACA, S.F.; VALLENAS, A.; NOVOA, C. Estudio experimental de la “Coquera” en<br />
capri<strong>nos</strong>. Revta Fac Med Vet. v. 18, p. 131-159, 1967.<br />
BARROS, N. A. M. T.; QUEIRÓZ FILHO, J. L. Efeitos <strong>da</strong> substituição progressiva do<br />
melaço por vagens de algaroba (Prosopis juliflora (S.w.) D.C. na alimentação de<br />
ruminantes. In: SIMPÓSIO BRASILEIRO SOBRE ALGAROBA, Natal, Rio Grande<br />
do Norte, 1982. Anais. Natal: EMPARN,<br />
p. 385 – 407, 1982.<br />
BASTOS, J.R.; FAÇANHA, S.C. Análise química de produtos não convencionais<br />
para a elaboração de rações para piscicultura. Ciên Agron., v.6, p. 49-52, 1985.<br />
BATATINHA, M.J..M; , ALMEIDA, G.N.;, DOMINGUES, L.F.; SIMAS, M.M.S.; ,<br />
BOTURA, M.B.; CRUZ, A.C.F. G.; ALMEIDA, M.A.O. Efeitos dos extratos aquoso e<br />
metanólico de algaroba sobre culturas de larvas de n<strong>em</strong>atódeos gastrintestinais de<br />
capri<strong>nos</strong>. Ci. anim. bras. v.12, n.3, p. 514-519, 2011.<br />
BATATINHA, M.J.M. Untersuchungen über toxische Einflüsse von Prosopis juliflora<br />
Sw.D.C (Algarobeira) auf Zellkulturen sowie auf die Pansenfermentation beim Rind<br />
(in vitro) [Tese]. Hannover: Veterinary Medicine University; 1997.<br />
BURKART, A.A.. Monograph of the genus Prosopis (Legumi<strong>nos</strong>ae subfam.<br />
Mimosoideae). Journal of the Arnold Arboretum, v.57, n.4, p.450-525, 1976.<br />
BUTOVSKY, O.; BUKSHPAN, S.; KUNIS, G.; JUNG, S.; SCHWARTZ, M. Microglia<br />
can be induced by IFN-γ or IL-4 to express neural or dendritic-like markers.<br />
Molecular and Cell Neurosc, v.35, p. 490-500, 2007.<br />
75
CÁ-CERES, A.; MENÉNDEZ, H.; MÉNDEZ, E.; COHOBÓN, E.; SAMAYOA, B.E.;<br />
JAUREGUI, E. Antigonorrhoeal activity of plants used in Guat<strong>em</strong>ala for the treatment<br />
of sexually transmitted diseases. J Ethnopharmacol, v.48, p.85-88, 1995.<br />
CAJAL, S.R. Histology of the Neurons Syst<strong>em</strong> of Man and Vertebrates. Oxford<br />
University Press, 1995.<br />
CÂMARA, A.C.L.; COSTA, N.A.; RIET-CORREA F.; AFONSO, J.A.B.; DANTAS,<br />
A.F.M.; MENDONÇA, C.L.; SOUZA; M.I. Intoxicação espontânea por vagens de<br />
Prosopis juliflora (Leg. Mimosoideae) <strong>em</strong> bovi<strong>nos</strong> no Estado de Pernambuco. Pesq.<br />
Vet. Brás. v. 29, p. 233-240, 2009.<br />
CHANG, R. C.C.; CHIU1, KIN.; HO, Y.S.; SO, K.FA. Modulation of Neuroimmune<br />
Responses on Glia in the Central. Cellular & Molecular Immunology. v. 6, p. 317-<br />
326, 2009.<br />
CHANG, R.C.C.; HUDSON, P.; WILSON, B.; HADDON, L.; HONG, J.S. Influence of<br />
neurons on lipopolysaccharide-stimulated production of nitric oxide and tumor<br />
necrosis factor-a by cultured glia. Brain Research, v. 853, p. 236–244, 2000.<br />
CHOGE, S.K.; PASIECZNIK, N.M.; HARVEY, M.; WRIGHT, J.; AWAN, S.Z.;<br />
HARRIS, P.J.C. Prosopis pods as human food, with special reference to Kenya.<br />
Water SA, v.33, p. 419 – 424, 2007.<br />
CHOUDHARY, M.I.; NAWAZ, S.A.; ZAHEER-UL-HAQ AZIM, M.K.; GHAYUR, M.N.;<br />
LODHI, M.A.; JALIL, S.; KHALID, A.; AHMED, A.; RODE, B.M.; ATTA-UR-RAHMAN.;<br />
GILANI, A.U.; AHMAD, V.U. Juliflorine: a potent natural peripheral anionic-site-<br />
binding inhibitor of acetylcholinesterase with calcium-channel blocking potential, a<br />
leading candi<strong>da</strong>te for Alzheimer's disease therapy. Bioch<strong>em</strong> Biophys Res<br />
Commun. v.332, p.1171-1177, 2005.<br />
76
COMBES, V.; GUILLEMIN, G.J; CHAN-LING, T.; HUNT, N.H.; GRAU, G.E.R. The<br />
crossroads of neuroinflammation in infectious diseases: endothelial cells and<br />
astrocytes. Trends in Parasitology. 28,8, 2012.<br />
COOKSON, M.R.; PENTREATH, V.W. Alterations in the glial fibrillary acidic protein<br />
content of primary astrocyte cultures for evaluation of glial cell toxicity. Toxicol. In<br />
vitro, v.8, p.351-359, 1994.<br />
COOKSON, M.R.; MCCLEAN, R.; WILLIAMS, S.P.; DAVENPORT-JONES, J.; EGAN<br />
C, O’HARE, S. Use of astrocytes for in vitro neurotoxicity testing. Toxicol. In vitro;<br />
v.8, n.4, p.817-819, 1994.<br />
COSTA, S.L.; PLANCHENAULT, T.; CHARRIERE-BERTRAND, C.; MOUCHEL, Y.;<br />
FAGES, C.; SHARON, J.; LEFRANÇOIS, T.; BARLOVATZ-MEIMON, G., TARDY, M.<br />
Astroglial permissivity for neurotic outgrowth in neuron-astrocyte cocultures depends<br />
on regulation of lamini bioavailability. Glia. v. 37, p. 105–113, 2002.<br />
COTRAN, R.S.; KUMAR, V.; COLLINS, T. Cellular pathology I: cell injury and cell<br />
death. In Robbin’s Pathologic Basis of Disease, edition 6; Cotran, R.S.; Kumar, V.;<br />
Collins, T. Saunders, Philadelphia, p. 1–29, 1999.<br />
COYLE, J.T.; SCHWARCZ, R. Mind glue: implications of glial cell biology for<br />
psychiatry. Arch Gen Psychiatry. v. 57, p. 90-93, 2000.<br />
DAETWYLER, P.; OTT-LONGONI, R.; SCHÖPP, E.; HESSE, M. Über Juliprosin, ein<br />
weiteres Alkaloid aus Prosopis juliflora A. DC. Helvetica Chimica Acta, v.64,<br />
p.1959-1963,1981.<br />
DAWSON, T.M.; SNYDER, S.H. Gases as biological messengers: nitric oxide and<br />
carbon monoxide in the brain. J. Neurosci. v. 14, p. 5147-5159, 1994.<br />
DEGTYAREV, M , DE MAZIÈRE, A. , ORR, C.; LIN, J.; LEE, B.B.; JANET Y. TIEN,<br />
J.Y.; WEI W. PRIOR, W.W.; DIJK, S.V.; WU, H.; GRAY, D.C.; DAVIS, D.P.; STERN,<br />
H.M.; MURRAY, L.J.; HOEFLICH, K.P; KLUMPERMAN, J , FRIEDMAN, L.S.; KUI<br />
77
LIN, K. Akt inhibition promotes autophagy and sensitizes PTEN-null tumors to<br />
lysosomotropic agents. The journal of cell biology, v. 183, p. 1, 2008.<br />
DICKSON DW, LEE, SC, MATTIACE LA; YEN SH, BROSNAN C. Microglia and<br />
cytokines in neurological disease, with special reference to AIDS and Alzheimer’s<br />
disease. Glia, v. 7, p. 75–83, 1993.<br />
DIMAYUGA, F.O.; WANG, C., CLARK, J.M.; DIMAYUGA, E.R.; DIMAYUGA, V.M.;<br />
BRUCE-KELLER, A.J. SOD1 overexpression alters ROS production and reduces<br />
neurotoxic inflammatory signaling in microglial cells. Journal of Neuroimmunology.<br />
v. 182, p. 89–99, 2007.<br />
DOLLAHITE, J.W.; ANTHONY, W.V. Malnutrition in cattle on an unbalanced diet of<br />
mesquite beans. Texas Agri. Exp. Station, v. 11, p. 209-212, 1957.<br />
DRINGEN, R.; PAWLOWSKI, P.G.; HIRRLINGER, J. Peroxide detoxification by brain<br />
cells. J. Neurosc. Res., v.79, p.157-165, 2005.<br />
EISENBERG-LERNER, A., BIALIK, S., SIMON, H. U., AND KIMCHI, A. Life and<br />
death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between th<strong>em</strong>. Cell Death<br />
Differ. v. 16, p. 966–975, 2009.<br />
FESTJENS, N.; VANDEN BERGHE, T.; VANDENABEELE, P. Necrosis, a well-<br />
orchestrated form of cell d<strong>em</strong>ise: signaling cascades, important mediators and<br />
concomitant immuneresponse, Biochim. Biophys. Acta., v. 1757, p. 1371–1387,<br />
2006.<br />
FIELD, R.D.; STEVENS-GRAHAM, B. New Insights into Neuron-Glia<br />
Communication. Science, v.298, p. 556 – 562, 2002.<br />
FIGUEIREDO, L.J.C.; FERREIRA, M.M.; TÁVORA, J.P.F.; DANTAS, J. SIMÕES,<br />
S.D. Estudo clínico e anátomopatológico <strong>da</strong> doença "cara torta" <strong>em</strong> bovi<strong>nos</strong> no<br />
nordeste brasileiro. Arq. Med. Vet. – UFBA. v.18, p. 175-183, 1995.<br />
FÜNFSCHILLING, U.; SUPPLIE, L.M.; MAHAD, D.; BORETIUS, S.; SAAB, A.S.;<br />
EDGAR, J; BRINKMANN, B.; KASSMANN, C.M; TZVETANOVA, I.D.; MÖBIUS, W.;<br />
78
DIAZ, F.; MEIJER, D.; SUTER, U.; HAMPRECHT, B.; SEREDA, M.W.; MORAES,<br />
C.T.; FRAHM, J.; GOEBBELS, S; NAVE, K.A. Glycolytic oligodendrocytes maintain<br />
myelin and long-term axonal integrity. Nature. 485, 517–521, 2012.<br />
GARIBALDI, C., Prosopis juliflora (Sw.) DC., Department of Botany, University of<br />
Panamá, Panamá, p. 657-659 (site: www.rngr.net/Publications). 2003.<br />
GEBICKE-HAERTER, P.J. Microglia in Neurodegeneration: Molecular Aspects.<br />
Microsc. Res. Tech. v. 54, p. 47–58, 2001.<br />
GEHRMANN, J.; MATSUMOTO, Y.; KREUTZBERG, G.W. Microglia: intrinsic<br />
immuneffector cell of the brain. Brain Research Reviews, v. 20, p.269-287, 1995.<br />
GIORGI, C.; BALDASSARI, F.; BONONI, A; BONORA, M.; DE MARCHI, E.;<br />
MARCHI, S.; MISSIROLI, S.; PATERGNANI, S.; RIMESSI, A.; SUSKI J.M.;<br />
WIECKOWSKI, M.R.; PAOLO PINTON. P. Mitochondrial Ca 2+ and apoptosis. Cell<br />
Calcium. v. 52, p. 36– 43, 2012.<br />
GIULIAN D, LEARA J, LI J, KEENEN C. Phagocytic microglia release cytokines and<br />
cytotoxins that regulate the survival of astrocytes and neurons in culture.<br />
Neuroch<strong>em</strong>. Int. v. 25, p. 227-232, 1994.<br />
GOLSTEIN, P., KROEMER, G. Cell death by necrosis: towards a molecular<br />
definition. Trends Bioch<strong>em</strong>. Sci. v. 32, p. 37–43, 2007.<br />
GOMES, P. A algarobeira. Rio de Janeiro:Ministério <strong>da</strong> Agricultura, Serviço de<br />
GOZUACIK, D.; KIMCHI, A. Autophagy and cell death. Curr. Top. Dev. Biol., v. 78,<br />
p. 217–245, 2007.<br />
HAAG, H.P.; MEDEIROS, A.A.; FRANÇA, A.F.S. Desnutrição de macronutrientes <strong>em</strong><br />
plantas de algaroba. IPEF, p.53-55,1986.<br />
HARRY,G.J.; YLER,K.; D’HELLENCOURT, C. L.; TILSON, H.A.; MAIER,W. E.<br />
Morphological alterations and elevations in tumor necrosis factor-a, interleukin (IL)-<br />
79
1a, and IL-6 in mixed glia cultures following exposure to trimethylt in: modulation by<br />
proinflammatory cytokine recombinant proteins and neutralizing antibodies.<br />
Toxicol.Appl.Pharmacol. v. 180, p. 205–218, 2002.<br />
HENICS, T.; WHEATLEY, D.N. Cytoplasmic vacuolation, a<strong>da</strong>ptation and cell death:<br />
A view on new perspectives and features. Biology of the Cell. v. 91, p. 485-498,<br />
1999.<br />
HUGHES, J.B.; SILVA, V.D.A.; SILVA, A.R.; SOUZA, C.S.; SILVA, A.M.M.;<br />
VELOSO, E.S.; BATATINHA, M.J.M.; COSTA, M.F.D.; TARDY, M.; ELBACHÁ, R.S.;<br />
COSTA, S.L. Cytotoxicity effect of alkaloi<strong>da</strong>l extract from Prosopis juliflora Sw. D.C.<br />
(Algaroba) pods on glial cells. Brazilian Journal of Veterinary Research and<br />
<strong>Animal</strong> Science, v. 43, p. 50-58, 2006.<br />
HUGHES, J.B.; SOUSA, J.S.; BARRETO, R.A.; SILVA, A.R.; SOUZA, C.S. SILVA,<br />
V.D.A. SILVA, B.M.P.; FREITAS, S.R.V.B.; COSTA, M.F.D.; EL-BACHÁ, R.S.;<br />
BATATINHA, M.J.M.; TARDY, M.; VELOZO, E.S. AND COSTA, S.L. Cytotoxic<br />
effects of an extract containing alkaloids obtained from Prosopis juliflora Sw. D.C.<br />
(Algaroba) pods on glioblastoma cells. Rev. Bras. Saúde Prod. An. v. 6, p. 31-41,<br />
2005.<br />
ISOBE, I.; MAENO,Y.; NAGAO, M.;IWASA, M.; KOYAMA, H.; SEKO-<br />
NAKAMURA,Y.; MONMA-OHTAKI, J. Cytoplasmic vacuolation in cultured rat<br />
astrocytes induced by an organophosphorus agent requires extracellular signal-<br />
regulated kinase activation. Toxicology and Applied Pharmacology. v. 193, p.<br />
383–392, 2003.<br />
KANDEL, E.R. Nerve cells and behavior. In: Kandel ER, Schwartz JH, Jessell TM,<br />
editors. Principles of neural science. 4 ed. New York; 2000.<br />
KANTHASAMY, A.; SUBRAMANIAN, S.; GOVINDASAMY, S. Bacterici<strong>da</strong>l and<br />
fungici<strong>da</strong>l effects of Prosopis juliflora alkaloi<strong>da</strong>l fraction. Indian Drugs, v.26, p.390-<br />
394,1989.<br />
80
KAUSHIK, J.C.; SANJAY, A.; TRIPATHI, N.N. Antifungal properties of some plant<br />
extracts against the <strong>da</strong>mping-off fungi of forest nurseries. Indian J Forestry, v.25,<br />
p.359-361, 2002.<br />
KILLIAN, S.; MCMICHAEL, J. The human allergens of mesquite (Prosopis juliflora).<br />
Clinical and Molecular Allergy, v.2, 2004.<br />
KIRCHHOFF, F.; DRINGEN, R.; GIAUME, C. Pathways of neuron-astrocyte<br />
interactions and their possible role in neuroprotection. Eur Arch Psychiatry Clin<br />
Neuros, v.25, p.159-169, 2001.<br />
KLIONSKY, D.J.; ABDALLA, F.C.; ABELIOVICH, H.; ABRAHAM, R.T. Guidelines for<br />
the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy, v. 8, n. 4,<br />
p. 1–100, 2012.<br />
KRIEGSTEIN, A.; GÖTZ, M. Radial glia diversity: a matter of cell fate. Glia, v.43,<br />
p.37-43, 2003.<br />
LAKHANI SA; MASUD A; KUIDA K; PORTER GA JR; BOOTH CJ; MEHAL<br />
WZ; INAYAT I; FLAVELL RA. Caspases 3 and 7: key mediators of mitochondrial<br />
events of apoptosis. Science. v. 10, n. 311 (5762), p.847-851, 2006.<br />
LAKSHMI, B.S.; NAIDU, K.C.; MURTHY, Y.L.N.; BOBBARALA, V.; PANDIT, N. Bio-<br />
efficacy of some medicinal plants against pathogens of cereal crops and<br />
phytoch<strong>em</strong>ical examination of Prosopis juliflora (SW) Dc. Journal of Pharmacy<br />
Research, v. 3, p. 356-360, 2010.<br />
LENT, R. As uni<strong>da</strong>des do Sist<strong>em</strong>a Nervoso: Forma e Função de Neurônios e<br />
Gliócitos. In: Nova Atheneu editora. C<strong>em</strong> Bilhões de Neurônios, Conceitos<br />
Fun<strong>da</strong>mentais de Neurociências, São Paulo. p.65-95, 2005.<br />
LIEM, R.K.; MESSING, A. Dysfunctions of neuronal and glial intermediate filaments<br />
in disease. J. Clin. Invest. v. 119, p. 1814-1824, 2009.<br />
81
LIMA, P.C.F.; SILVA, M.A. Ocorrência sub-espontânea de uma algaroba no nordeste<br />
do Brasil. Boletim de Pesquisa Florestal, p.91-95, 1991.<br />
MACHADO, G.F.; FIGUEIREDO, F. Revisão: Filamentos intermediários. Medicina,<br />
Ribeirão Preto, v. 29, p. 104-113, 1996.<br />
MAHGOUB, O.; KADIM, I. T.; JOHNSON, E. H.; SRIKANDAKUMAR, A.; AL-SAQRI,<br />
N. M.; AL-ABRI, A. S.; RITCHIE, A. The use of a concentrate containing Meskit<br />
(Prosopis juliflora) pods and <strong>da</strong>te palm byproducts to replace commercial<br />
concentrate in diets of Omani sheep. <strong>Animal</strong> Feed Science and Technology, v.<br />
120, p. 33 -41, 2005.<br />
MANNING, P.; COOKSON, M.R.; MCNEIL, C.J.; FIGLEWICZ, D.; SHAW, P. J. Brain<br />
Research, v. 911, p. 203–210, 2001.<br />
MEAD, C.; PENTREATH, V.W. Hypertrophy and increased glial fibrillary acidic<br />
protein are coupled to increased protection against cytotoxicity in glioma cell lines.<br />
Toxic In vitro, v.12, p.141-152, 1998.<br />
MENDES, B.V. Potential offered by Prosopis Juliflora (SW) DC in the Brazilian S<strong>em</strong>i-<br />
arid region. In: The current state of knowlegde of Prosopis juliflora. 1986. Recife.<br />
Anais... Recife: II Internat. Conf. on Prosopis juliflora, 1986b.<br />
MENDES, B.V. Prosopis in Brazil. Characteristics of the S<strong>em</strong>i-Arid Zone of Brazil's<br />
Northeast. In: The current state of knowlegde of Prosopis juliflora. 1986, Recife.<br />
Anais... Recife: II Internat. Conf. on Prosopis juliflora, 1986a.<br />
MEYER, R.P.; GEHLHAUS, M.; KNOTH, R.; VOLK, B. Expression and Function of<br />
Cytochrome P450 in Brain Drug Metabolism. Current Drug Metabolism, v. 8, p.<br />
297-306, 2007.<br />
MIN. Ministério <strong>da</strong> Integraçao Naciona.http://www.integracao.gov.br/pt/c/journal/<br />
view_article _content?groupId=10157&articleId=185861&version=1.0.<br />
82
MOISES, H.W.; ZOEGA, T.; GOTTESMAN, I.I. The glial growth factors deficiency<br />
and synaptic destabilization hypothesis of schizophrenia. BMC Psych., v. 2, p. 8,<br />
2002.<br />
MORENO, G.M.B.; CASTRO, K.J.; CAVALCANTE, M.A.B.; CIDRÃO, P.M.L.;<br />
CARNEIRO, H.A.V.; NEIVA, J.N.M. Consumo de matéria seca, ganho de peso e<br />
conversão alimentar de ovi<strong>nos</strong> alimentados com dietas orgânicas. Anais do 42ª<br />
reunião anual <strong>da</strong> socie<strong>da</strong>de brasileira de zootecnia, 2005.<br />
MOREST, D.K.; SILVER, J. Precursors of neurons, neuroglia, and ependymal cells in<br />
the CNS: what are they? Where are they from? How do they get where they are<br />
going?. Glia; v.43, p.6-18, 2003.<br />
MOSMAN, T. Rapid, colorimetric assay for cellular growth and survival: application to<br />
proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Meth. v. 65, p. 55–63, 1983.<br />
NAKANO, H.; NAKAJIMA, E.; FUJII, Y.; SHIGEMORI, H.; HASEGAWA, K. Growth<br />
inhibitory alkaloids from mesquite (Prosopis juliflora (Sw.) DC.) leaves.<br />
Phytoch<strong>em</strong>istry, v.65, n.5, p.587-591, 2004.<br />
NAKASE, T.; NAUS, C.C.G. Gap junctions and neurological disorders of the central<br />
nervous syst<strong>em</strong>. Biochimica et Biophysica Acta, v.1662, p.149-158, 2004.<br />
NICHOLSON, T.E.; DIBB, S.; RENTON, K.W. Nitric oxide mediates an LPS-induced<br />
depression of cytochrome P450 (CYP1A) activity in astrocytes. Brain Res. 1029,<br />
148–154. 2004.<br />
NONES, J.; STIPURSKY, J.; COSTA, S.L.; GOMES, F.C.A. Flavonoids and<br />
Astrocytes Crosstalking: Implications for Brain Development and Pathology.<br />
Neuroch<strong>em</strong> Res. v. 35, p. 955–966, 2010.<br />
O’CALLAGHAN, J.P. Assessment of neurotoxicity: use of glial fibrillary acidic protein<br />
as a biomarker. Biomed. Environ. Sci. v. 4, p. 197–206, 1991.<br />
83
Oliveira, A.S.; Pereira, R.A.; Lima, L.M.; Morais, A.H.A.; Melo, F.R; Franco, O.L.;<br />
Bloch Jr., C.; Grossi-de-As, M.F; Sales, M.P. Activity toward Bruchid Pest of a<br />
Kunitz-Type Inhibitor from Seeds of the Algaroba Tree (Prosopis juliflora D.C.).<br />
Pesticide Bioch<strong>em</strong>istry and Physiology, v. 72, p. 122–132, 2002.<br />
OTT-LONGONI, R.; VISWANATHAN, N.; HESSE, M.. Die konstitution des Alkaloides<br />
Juliprosopin aus Prosopis juliflora A. DC. Helvetica Chimica Acta, v.63, p.2119-<br />
2129, 1980.<br />
PARIS, I., PEREZ-PASTENE, C., COUVE, E., CAVIEDES, P., LEDOUX, S., AND<br />
SEGURA-AGUILAR, J. Copper dopamine complex induces mitochon-drial autophagy<br />
preceding caspase-independent apoptotic cell death. J. Biol. Ch<strong>em</strong>. v. 284, p.<br />
13306–13315, 2009.<br />
PARIS, I.; MUNOZ, P.; HUENCHUGUALA, S.; COUVE, E.; SANDERS, L.H.;<br />
GREENAMYRE, J.T.; CAVIEDES, P.; SEGURA-AGUILAR, J. Autophagy Protects<br />
Against Aminochrome-Induced Cell Death in Substantia Nigra-Derived Cell Line.<br />
Toxicological sciences. v. 121, n.2, p. 376–388, 2011.<br />
PASIECZNIK N.M., FELKER P., HARRIS P.J.C., HARSH L.N., CRUZ G., TEWARI<br />
J.C., CADORET K., AND MALDONADO L.J. The Prosopis juliflora – Prosopis palli<strong>da</strong><br />
Complex: A Monograph. HDRA, Coventry, UK. 162p, 2001.<br />
PEGADO, C.M.A.; ANDRADE, L.A.; FÉLIX, L.P.; PEREIRA, I.M. Efeitos <strong>da</strong> invasão<br />
biológica de algaroba - Prosopis juliflora (Sw.) DC. sobre a composição e a estrutura<br />
do estrato arbustivo-arbóreo <strong>da</strong> caatinga no Município de Monteiro, PB, Brasil. Acta<br />
Bot. Bras., v.20, 2006.<br />
PEREIRA JR., J.S. Nova delimitação do s<strong>em</strong>i-árido brasileiro. Biblioteca Digital.<br />
Camara dos Deputados. 2007.<br />
PINHEIRO, M. J. P.; PIRES, G. S.; COSTA, E. S.; FERNANDES, M. B.; ROSADO,<br />
C. A.S. Utilização <strong>da</strong> vag<strong>em</strong> de algaroba (Prosopis juliflora (S.w.) D. C. na<br />
alimentação de suí<strong>nos</strong> <strong>em</strong> terminação. In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE<br />
84
BRASILEIRA DE ZOOTECNIA, 23, 1986, Campo Grande, Mato Grosso do Sul.<br />
Anais. Campo Grande: SBZ, p. 53. 1986.<br />
PITANGA, B.P.S. ; NASCIMENTO, R.P.; SILVA, V.D.A. ; COSTA, S.L. The role of<br />
astrocytes in metabolism and neurotoxicity of the pyrrolizidine alkaloid monocrotaline,<br />
the main toxin of Crotalaria retusa. FrontiersinPharmacology | Neuropharmacology.<br />
v. 3, n. 144, 2012.<br />
QUINTANS-JÚNIOR, L.J.; ALMEIDA, R.N; BARBOSA-FILHO, J.M; DUARTE, J.C.;<br />
TABOSA, I.M. Toxici<strong>da</strong>de Agu<strong>da</strong> e Alterações Comportamentais induzi<strong>da</strong>s pela<br />
ração de Alcalóides Totais <strong>da</strong>s Vagens de Prosopis juliflora (Sw) D.C.<br />
(Legumi<strong>nos</strong>eae) <strong>em</strong> Roedores. Acta Farm. Bonaerense. v. 23, n. 1, p. 5-10 , 2004.<br />
RAJKOWSKA, G.; MIGUEL-HIDALGO, J.J.; MAKKOS, Z.; MELTZER, H.;<br />
OVERHOLSER, J.; STOCKMEIER, C. Layer-specific reductions in GFAP-reactive<br />
astroglia in the dorsolateral prefrontal cortex in schizophrenia. Schizophr. Res. v. 57,<br />
p. 127–138, 2002.<br />
RAMBOLD, A.S.; KOSTELECKY, B.; LIPPINCOTT-SCHWARTZ, J. Together we are<br />
stronger. Fusion protects mitochondria from autophagosomal degra<strong>da</strong>tion.<br />
Autophagy. v. 7, n. 12, p. 1–2, 2011.<br />
RATABOUL, P., VERNIER, P., FAUCON-BIGUET N. MALLET,J., POULAT,P.,<br />
PRIVAT, A. Modulation of GFAPmTNA levels following toxic lesions in the basal<br />
ganglia of the rat. Brain Res. v. 174, p. 283–308, 1989.<br />
RAVIKALA, K.; PATEL, A. M.; MURTHY, K. S.; WADHWANI, K. N. Growth efficiency<br />
in feedlot lambs on Prosopis juliflora based diets. Small Ruminant Research, v. 16,<br />
p. 227 -231, 1995.<br />
RÖHL, C., SIEVERS, J. Microglia is activated by astrocytes in trimethyltin<br />
intoxication. Toxicology and Applied Pharmacology. v. 204, p. 36-45, 2005.<br />
85
ROOHL, C.; ARMBRUST, E.; KOLBE, k.; LUCIUS, R.; MASER, E.; VENZ, S.<br />
GULDEN, M. Activated Microglia Modulate Astroglial Enzymes Involved in Oxi<strong>da</strong>tive<br />
and Inflammatory Stress and Increase the Resistance of Astrocytes to Oxi<strong>da</strong>tive<br />
Stress In Vitro. GLIA. v. 56, p. 1114–1126, 2008.<br />
ROSSI, B.; CARRER, C.R.O.; CURY, B.; BRITO, C.A.M.F.; PIRES, J.M.; MARÇOLA,<br />
P.L.; COSTA CARRER,C.C. Utilização <strong>da</strong> vag<strong>em</strong> de Prosopis juliflora d.c na<br />
alimentação de ruminantes. Associaçao Brasileira de Zootecnia, 2009.<br />
RYU, J.K.; TRAN, K.C.; MCLARNON, J.G. Depletion of neutrophils reduces neuronal<br />
degeneration and inflammatory responses induced by Quinolinic acid in vivo. GLIA.<br />
v. 55, p. 439–451, 2007.<br />
SALIMI, K.; HUMPEL, C. Down regulation of compl<strong>em</strong>ent receptor 3 and major<br />
histocompatibility complex I and II antigen-like immunoreactivity accompanies<br />
ramification in isolated rat microglia. Brain Res. v. 946, p. 283–289, 2002.<br />
SAMANTARAY, S.; KNARYAN, V.H.; GUYTON, M.K.; MATZELLE, D.D.; RAY, S.K.;<br />
BANIK, N.L. The parkinsonian neurotoxin rotenone activates calpain and caspase-3<br />
leading to motoneuron degeneration in spinal cord of Lewis rats. Neuroscience. v.<br />
146, p. 741-755, 2007.<br />
SAMOYLENKO, V., ASHFAQ ,M.K., JACOB, M.R., TEKWANI, B.L., KHAN, S.I.,<br />
MANLY, S.P., JOSHI, V.C., WALKER, L.A., MUHAMMAD, I. Indolizidine, antiinfective<br />
and antiparasitic compounds from Prosopis glandulosa var. glandulosa. J Nat Prod.<br />
v. 72, p. 92-8, 2009.<br />
SANTOS, R.V.; TERTULIANO, S.S.X. Crescimento de espécies arbóreas <strong>em</strong> solo<br />
salino-sódico tratado com ácido sulfúrico. Revista Bras de Eng Agríc Ambiental,<br />
v.2, n.2, p.239-242, 1998.<br />
SARKAR, S.; DAVIES, E.J.; HUANG, Z.; TUNNACLIFFE, A.; RUBINSZTEIN, D.C.<br />
Trehalose, a Novel mTOR-independent Autophagy Enhancer, Accelerates the<br />
86
Clearance of Mutant Huntingtin and α-Synuclein. The journal of biological<br />
ch<strong>em</strong>istry, v. 282, n. 8, p. 5641–5652, 2007.<br />
SATISH, S.; RAVEESHA, K.A.; JANARDHANA, G.R. Antibacterial activity of plant<br />
extracts on phytopathogenic Xanthomonas campestris pathovars. Let in Applied<br />
Microbiology, v.28, p. 145-147, 1999.<br />
SHANG, W.; LIU, W.; ZHAO, X.; SUN, Q.; BI, J.; CHI, Z. Expressions of glutathione<br />
S-transferase alpha, mu, and pi in brains of medically intractable epileptic patients.<br />
BMC Neuroscience. v.9, p. 67, 2008.<br />
SHEARMAN, M.S.; HAWTIN, S.R.; TAILOR, V.J. The intracellular component of<br />
cellular 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction<br />
is specifically inhibited by b-amyloid peptides. J. Neuroch<strong>em</strong>. v. 65, p. 218–227,<br />
1995.<br />
SHERRY, M.; SMITH, S.; PATEL, A.; HARRIS, P.; HAND, P.; TRENCHARD, L.;<br />
HENDERSON, J. RAPD and microsatellite transferability studies in selected species<br />
of Prosopis (section Algarobia) with <strong>em</strong>phasis on Prosopis juliflora and P. palli<strong>da</strong>.<br />
Journal of Genetics, v. 90, n. 2, 2011.<br />
SIEGEL, G.J.; AGRANOFF, B.W.; ALBERS, R.W.; FISHER, S.K.; UHLER, M.D. In:<br />
Editora Philadelphia. Basic Neuroch<strong>em</strong>istry: Molecular, Cellular, and Medical<br />
Aspects.1999.<br />
SILVA, A.M.M.; SILVA, A.R.; PINHEIRO, A.M.; FREITAS, S.R.V.B.; SILVA, V. D.A.;<br />
SOUZA, C.S.; VELOSO, E.S.; ELBACHÁ, R.S.; COSTA, M.F.D.; COSTA, S.L.<br />
Alkaloids from Prosopis juliflora leaves induce glial activation, cytotoxicity and<br />
stimulate NO production. Toxicon, v.49, p.601-614, 2007.<br />
SILVA, A.R.; PINHEIRO, A.M.; SOUZA, C.S.; FREITAS, S.R.V.B.;<br />
VASCONCELLOS, V.; EL-BACHÁ, R.S.: COSTA, M.F.D.: COSTA, S.L. The<br />
flavonoid rutin induces astrocyte and microglia activation and regulates TNF-alpha<br />
87
and NO release in primary glial cell cultures. Cell Biol Toxicol, v. 24, p. 75–86,<br />
2008.<br />
SILVA, L.F; LIMA, D.F; NASCIMENTO, C.B.S.N; LIMA, R.B.; FARIAS, G.G.M.<br />
Efeitos <strong>da</strong> farinha de algaroba (Prosopis juliflora) durante as fases de gestação e<br />
lactação <strong>em</strong> ratas Wistar. Acta Scientiarum. Biological Sciences Maringá, v. 25, no.<br />
2, p. 459-465, 2003<br />
SILVA, D.S. Substituição progressiva do farelo de trigo pela vag<strong>em</strong> <strong>da</strong> algaroba na<br />
alimentação de bovi<strong>nos</strong> <strong>em</strong> engor<strong>da</strong> [dissertação]. Areia (PB): Universi<strong>da</strong>de Federal<br />
<strong>da</strong> Paraíba, 1981.<br />
SILVA, J. H. V.; OLIVEIRA, J. N. C.; SILVA, E. L.; JORDÃO FILHO, J. ; RIBEIRO, M.<br />
L. G. Uso <strong>da</strong> farinha integral de vag<strong>em</strong> de algaroba (Prosopis juliflora (Sw) D.C.) na<br />
alimentação de codornas japonesas. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 31, n.3,<br />
p.1789-1795, 2002a.<br />
SILVA, J. H. V.; SILVA. E; L; JORDÃO FILHO, J.; TOLEDO, R. S.; ALBINO, L .F. T.;<br />
RIBEIRO, M. L. G. ; COUTO, H. P. Valores energéticos e efeitos <strong>da</strong> inclusão de<br />
farinha integral de vag<strong>em</strong> de algaroba (Prosopis juliflora (Sw.) D. C.) <strong>em</strong> rações de<br />
poedeiras comerciais. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 31, n.6, p. 2255 – 2264,<br />
2002b.<br />
SILVA, M.A. Taxonomy and distribution of the genus Prosopis L. In: The current state<br />
of knowlegde of Prosopis juliflora. 1986, Recife. Anais... Recife: II Internat. Conf. on<br />
Prosopis juliflora; p.177-185, 1986a.<br />
SILVA, S. Prospis juliflora (SW) DC in Brazil. In: The current state of knowlegde of<br />
Prosopis juliflora. 1986, Recife. Anais. Recife: II Internat. Conf. on Prosopis juliflora,<br />
1986b.<br />
SILVA, V.D.A; PITANGA, B.S; NASCIMENTO, R.P.; SOUZA; C.S.; COELHO, P.L.C.;<br />
MENEZES-FILHO, N.; SILVA, A.M.M.; COSTA, M.F.D; EL-BACHÁ, R.S.; VELOZO,<br />
E.S.; COSTA, S.L. Piperidine alkaloids from Prosopis juliflora leaves induce<br />
88
mitochondrial <strong>da</strong>mage and cytoplasmic vacuolation on<br />
co-cultured glial cells and neurons. Submeted to Toxicologic Pathology, 2012.<br />
2.2.2 SOFRONIEW, M.V.; HOWE, C.L.; MOBLEY, W.C. Nerve growth factor<br />
signaling, neuroprotection, and neural repair. Annu. Rev. Neurosci. v. 24, p.<br />
1217–281, 2001.<br />
2.2.2 SONDEREGGER, P.; LEMKIN, P.F.; NELSON, P.G. Diffencial modulation of<br />
the expression proteins by non-neuronal cells of the peripheral and central<br />
nervous syst<strong>em</strong>. The EMBO Journal. v.4, n.6, p.1395-1401, 1985.<br />
2.2.2 SPA – Secretaria de Produção <strong>Animal</strong> A algarobeira (Prosopis juliflora Sw,<br />
D.C.) no nordeste do Brasil, 1989.<br />
STEIN, R.B.S.; TOLEDO, L.L.A.; ALMEIDA, F.Q.; ARNAUT, A.C.; PATITUCCI, L.T.;<br />
SOARES NETO, J.; COSTA, V.T.M. Uso do Farelo de Vag<strong>em</strong> de Algaroba (Prosopis<br />
juliflora (Swartz) D.C. <strong>em</strong> Dietas para Eqüi<strong>nos</strong>. Revista Brasileira de Zootecnia,<br />
v.34, n.4, p.1240-1247, 2005.<br />
STREIT, W.J.; WALTER, S.A.; PENNEL, N.A. Reactive microgliosis. Progr.<br />
Neurobiol. v. 57, p. 563–581, 1999.<br />
TABOSA, I.M.; QUINTANS-JR, L.J; PAMPLONA, F.V; ALMEIDA, R.N.; CUNHA,<br />
E.V.L.DA; SILVA, M.S.DA; SOUZA, J.C.DA A; BARBOSA FILHO, J.M. Isolamento<br />
biomonitorado de alcaloides tóxicos de Prosopis juliflora (algaroba). Revista<br />
Brasileira de Farmacog<strong>nos</strong>ia, v. 9/10, p 11-22, 2000b.<br />
TABOSA, I.M.; RIET-CORREA, F.; BARROS, S.S.; SUMMERS, B. A.; SIMÕES, S.<br />
V.D.; MEDEIROS, R.M.T.; NOBRE, V.M.T. Neurohistologic and ultrastructural<br />
lesions in cattle experimentally intoxicated with the Plant Prosopis juliflora. Vet<br />
Pathol, v.43, p.695–701, 2006.<br />
TABOSA, I.M.; SOUZA, J.C.A.; GRAÇA, D.L.; BARBOSA-FILHO, J.M.; ALMEIDA,<br />
R.N.; RIET-CORREA, F. Neuronal vacuolation of the trig<strong>em</strong>inal nuclei in goats<br />
caused by ingestion of Prosopis juliflora pods (Mesquite beans). Vet and Human<br />
Toxico, v. 42, p. 155-158, 2000a.<br />
89
TARDY, M. Astrocyte et Homeostasie. Méd. Sci. v. 8, p. 799–804, 1991.<br />
TARDY, M. Role of laminin bioavailability in the astroglial permissivity for neuritic<br />
outgrowth. Anais <strong>da</strong> Acad<strong>em</strong>ia Brasileira de <strong>Ciência</strong>s. v. 74, p. 683-690, 2002.<br />
TRONCOSO R, VICENCIO JM, PARRA V, NEMCHENKO A, KAWASHIMA Y, DEL<br />
CAMPO A, TORO B, BATTIPROLU PK, ARANGUIZ P, CHIONG M, YAKAR<br />
S, GILLETTE TG, HILL JA, ABEL ED, LEROITH D, LAVANDERO S. Energy-<br />
preserving effects of IGF-1 antagonize starvation-induced cardiac autophagy.<br />
Cardiovasc Res. v. 1; n. 93(2); p 320-329, 2012.<br />
VIEIRA, L.R.; GERRA, N.B.; FREITAS, E.M. Sucedâneo do café de Prosopis juliflora<br />
D.C. Pesq. agropec. bras. v. 30, n. 1, p. 121-124, 1995.<br />
WAGNER, H.; BLADT, S.; ZGAINSKI, E.M. Drogen analyse. In:<br />
Dünnschichtchromatographie Anlyse von Arzneidrogen, edition 1; Verlag, J.;<br />
Springer, J. Heidelberg New York Publishers, Berlin, 1983.<br />
WANG, X.F.; CYNADER, M.S. Effects of astrocytes on neuronal attachment and<br />
survival shown in a serum-free co-culture syst<strong>em</strong>. Brain Research Protocols, v.4,<br />
p.209–216, 1999.<br />
WANG, Z.; LI, D.; LIANG, Y.; WANG, D.; CAI, N. Activation of astrocytes by<br />
advanced glycation end products: cytokines induction and nitric oxide release. Acta<br />
Pharmacol Sin. v. 23, p. 974-980, 2002.<br />
WU, Y.C.; WU, W.K.K.; LI, Y.; LI, L.Y.Z, J.; WONG, C.C.M.; LI, H.T.; SUNG, J.J.Y.;<br />
CHO, C.H. Inhibition of macroautophagy by bafilomycin A1 lowers proliferation and<br />
induces apoptosis in colon cancer cells. Bioch<strong>em</strong>ical and Biophysical Research<br />
Communications v. 382, p. 451–456, 2009.<br />
YAMAMOTO, M., SUZUKI, S. O., AND HIMENO, M. The effects of dynein inhibition<br />
on the autophagic pathway in glioma cells. Neuropathology. v 30, p. 1–6, 2010.<br />
90
YANG, Y.; XU, K.; KOIKE, T.; ZHENG, X..Transport of autophagosomes in neurites<br />
of PC12 cells during serum deprivation. Autophagy. v 4, n.2, p. 243-245, 2008.<br />
91
7. PRODUÇÃO BIBLIOGRAFICA<br />
7.1. Resumos publicados e apresentados <strong>em</strong> Eventos Científicos diretamente<br />
relacionados à Tese.<br />
SILVA, V. D. A.; PITANGA, B. P. S.; SILVA, ANA RITA ; SILVA, AMM; MENEZES<br />
FILHO, N.J. ; COSTA, M. F. D.; VELOZO, E. S.; ELBACHÁ, R. S.; COSTA, S.<br />
L. Effects of alkaloids extracted from leaves of Prosopis juliflora Swartz. D.C. on glial<br />
activation and on neurons viability. In: X Reunião Regional Nordeste Socie<strong>da</strong>de<br />
Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular e I Simpósio Latino Americano de<br />
NeuroquímicI Simpósio Latino Americano de Neuroquímica, 2010, Salvador. Anais<br />
do X Reunião Regional Nordeste Socie<strong>da</strong>de Brasileira de Bioquímica e Biologia<br />
Molecular e I Simpósio Latino Americano de NeuroquímicI Simpósio Latino<br />
Americano de Neuroquímica, 2010.<br />
SILVA, V. D. A.; MENDES, A.M.; PITANGA, B. P. S.; Souza, CS; MENEZES FILHO,<br />
N.J.; COSTA, M. F. D.; ELBACHÁ, R. S.; VELOZO, E. S.; COSTA, S. L. Cytotoxics<br />
alkaloids extrecteds from Prosopis juliflora leaves induce astroglial vacuolation and<br />
microglial activation on neuron/glia co-culture. In: XV Congresso <strong>da</strong> Socie<strong>da</strong>de<br />
Brasileira de Biologia Celular, XV Meeting Brazilian Society for Cell Biology, 2010,<br />
São Paulo. Anais do XV Congresso <strong>da</strong> Socie<strong>da</strong>de Brasileira de Biologia Celular, XV<br />
Meeting Brazilian Society for Cell Biology, 2010.<br />
SILVA, V. D. A.; PITANGA, B. P. S.; Souza, CS; Silva, Ana Rita; Silva,<br />
AMM; COSTA, M. F. D.; ELBACHÁ, R. S.; VELOZO, E. S.; Figueira, C.P.; COSTA,<br />
S. L.. Alkaloids extracted from leaves of Prosopis Juliflora Swart. D.C. induce glial<br />
activation and autophagic cell death on neuron/glial cell primary co-cultures. In: XL<br />
Reunião Anual <strong>da</strong> Socie<strong>da</strong>de Brasileira de Bioquimica e Biologia Molecular, 2011,<br />
Foz do Iguaçu. Anais <strong>da</strong> XL Reunião Anual <strong>da</strong> SBBq, 2011.<br />
SILVA, V. D. A. ; CUEVAS, C. ; MUNOZ, P. A. ; VELOZO, E. S. ; Segura-Aguilar, J.<br />
; COSTA, S. L. . Autophagy protects against cell death induced by alkaloids from<br />
Prosopis juliflora in neuron/glia cells co-culture.. In: XLI Annual Meeting of The<br />
92
Brazilian Bioch<strong>em</strong>istry and Molecular Biology Society, 2012, Foz do Iguaçú, PR.<br />
Anais <strong>da</strong> XLI Annual Meeting of The Brazilian Bioch<strong>em</strong>istry and Molecular Biology<br />
Society, 2012.<br />
7.2. Artigos publicados diretamente relacionados à <strong>tese</strong><br />
SILVA, V.D.A; PITANGA, B.P.S; NASCIMENTO, R.P ; SOUZA, C.S:; PAULO<br />
LUCAS C. COELHO, P.L.C; MENEZES-FILHO, N; SILVA, A.M.M; COSTA, M.F.D;<br />
EL-BACHA, R.S.; EUDES S.; VELOZO, E.S.;COSTA, S.L. Submetido para a revista<br />
Toxicologic Pathology.<br />
7.3. D<strong>em</strong>ais produção bibliográfica no período <strong>da</strong> Tese<br />
PITANGA, B. P. S.; NASCIMENTO, R.P.; SILVA, V. D. A. ; COSTA, S. L. . The Role<br />
of Astrocytes in Metabolism and Neurotoxicity of the Pyrrolizidine Alkaloid<br />
Monocrotaline, the Main Toxin of Crotalaria retusa. Front Pharmacol., v. 3, p. 1-7,<br />
2012.<br />
PITANGA, B. P. S. ; SILVA, V. D. A. ; Souza, CS ; JUNQUEIRA, H. ; FRAGOMENI,<br />
B.O.; NASCIMENTO, R.P.; Silva, Ana Rita; COSTA, M. F. D. ; ELBACHÁ, R.<br />
S.; COSTA, S. L. . Assessment of neurotoxicity of monocrotaline, an alkaloid<br />
extracted from Crotalaria retusa in astrocyte/neuron co-culture syst<strong>em</strong>.<br />
Neurotoxicology (Park Forest South), v. 32, p. 776-784, 2011.<br />
SILVA NETO, J. P.; BARRETO, R. A.; PITANGA, B. P. S. ; Souza, CS ; SILVA, V. D.<br />
A. ; Silva, Ana Rita ; VELOZO, E. S.; BATATINHA, M. J. M.; TARDY, M. ; RIBEIRO,<br />
C. S.; DIAS, M.F.; ELBACHÁ, R. S.; COSTA, S. L. . Genotoxicity and morphological<br />
changes induced by the alkaloid monocrotaline, extracted from Crotalaria retusa, in a<br />
model of glial cells. Toxicon (Oxford), v. 55, p. 105-117, 2010.<br />
93
8. ANEXOS<br />
A<br />
C<br />
Anexo 1: Em (A): algarobeiras <strong>em</strong> região s<strong>em</strong>i-ári<strong>da</strong> <strong>da</strong><br />
África; <strong>em</strong> (B): vagens de algaroba; <strong>em</strong> (C): farelo de<br />
algaroba para alimentação animal (fotos de Pasiecznik);<br />
<strong>em</strong> (D): bovino intoxicado por consumo <strong>da</strong> algaroba<br />
(Câmara et al., 2009).<br />
B<br />
D<br />
94