O bago da uva: uma fábrica bioquímica complexa
O bago da uva: uma fábrica bioquímica complexa
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O <strong>bago</strong> <strong>da</strong> <strong>uva</strong>: <strong>uma</strong> <strong>fábrica</strong> <strong>bioquímica</strong> <strong>complexa</strong><br />
Alunos:<br />
•Ana Paulina<br />
•Inês Coturela<br />
•Rodrigo Silva<br />
Responsáveis:<br />
•Ana Cunha<br />
•Hernâni Gerós<br />
•Richard Gonçalves<br />
•António Teixeira
Objectivos<br />
• Preparar extractos celulares de <strong>bago</strong>s de <strong>uva</strong>s verdes e<br />
maduras e dosear teor de proteína<br />
• Determinar a activi<strong>da</strong>de enzimática <strong>da</strong> MDH<br />
• Dosear açúcares e ácidos orgânicos por HPLC<br />
• Realizar curvas de resposta <strong>da</strong> fotossíntese à luz por<br />
fluorometria de pulso de amplitude modela<strong>da</strong> (PAM)<br />
• Observar cortes histológicos por microscopia de<br />
epifluorescência<br />
• Explicar alg<strong>uma</strong>s modificações <strong>bioquímica</strong>s e fisiológicas<br />
que ocorrem durante o desenvolvimento do <strong>bago</strong>
Preparação de extractos celulares<br />
Determinação<br />
<strong>da</strong> [proteínas]<br />
Medição de<br />
activi<strong>da</strong>des<br />
enzimáticas<br />
N2(l)<br />
Determinação <strong>da</strong><br />
concentração de<br />
açúcares e ácidos pelo<br />
HPLC
Activi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> malato desidrogenase
Activi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> malato desidrogenase<br />
Cuvete<br />
Tampão Tris-HCl, pH 8<br />
NADH<br />
Extracto celular<br />
Oxaloacetato
Activi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> malato desidrogenase<br />
• Doseamento de [proteína]<br />
pelo método de Bradford<br />
[proteína] <strong>bago</strong> verde = 3,2 mg/ml<br />
l = 595 nm
Activi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> malato desidrogenase<br />
• Espectros de absorção do NADH e do NAD +
Activi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> malato desidrogenase<br />
• Veloci<strong>da</strong>de inicial <strong>da</strong> reacção<br />
pH = 8,0<br />
[oxaloacetato] = 10 mM<br />
v i
Activi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> malato desidrogenase<br />
• Gráfico de Michaelis-Menten
Activi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> malato desidrogenase<br />
• Estimativa de parâmetros cinéticos por modelo matemático<br />
K m = 118,2 mM oxaloacetato<br />
V max =21 µmole de NAD+/min/mg de proteína
Doseamento de açúcares e ácidos por HPLC<br />
Série de padrões de<br />
concentrações<br />
conheci<strong>da</strong>s<br />
• Cromatogramas de padrões e extractos<br />
<strong>bago</strong> verde<br />
<strong>bago</strong> maduro
Doseamento de açúcares e ácidos por HPLC<br />
Teor (mg/g peso fresco)<br />
45<br />
40<br />
35<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
Malato<br />
verdes maduras<br />
Teor (mg/g peso fresco)<br />
45<br />
40<br />
35<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
Açúcares<br />
S G F S G F<br />
verdes maduras
ETR<br />
Curvas de resposta <strong>da</strong> fotossíntese à luz<br />
Fluorometria de Pulso Amplitude Modulado (PAM)<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
Bago verde Folhas (madura/ senescente)<br />
0 200 400 600 800 1000<br />
PAR<br />
ETR<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
0 200 400 600 800 1000<br />
Órgão a (eficiência PSII) ETR r máx. (capaci<strong>da</strong>de PSII)<br />
Bago verde grande 0,593 83,7<br />
Bago verde pequeno 0,538 73,0<br />
Folha madura 0,726 100,1<br />
Folha senescente 0,618 61,4<br />
PAR
Microscopia<br />
Microscopia
Microscopia
Conclusões<br />
1. Foram obtidos extractos celulares de <strong>uva</strong>s verdes e de <strong>uva</strong>s maduras<br />
2. No <strong>bago</strong> verde a concentração de ácido málico é muito elevado, sendo<br />
residual no <strong>bago</strong> maduro<br />
3. No <strong>bago</strong> maduro a concentração de açúcares é muito eleva<strong>da</strong>, sendo<br />
mínima no <strong>bago</strong> verde<br />
4. Os principais açúcares acumulados no <strong>bago</strong> maduro são os<br />
monossacarídeos glucose e frutose<br />
5. A activi<strong>da</strong>de <strong>da</strong> malato desidrogenase é compatível com a acumulação<br />
do malato medi<strong>da</strong> no <strong>bago</strong> verde<br />
6. Tal como as folhas, o <strong>bago</strong> verde é fotossinteticamente activo<br />
7. Folhas mais velhas têm activi<strong>da</strong>de fotossintética inferior à dos <strong>bago</strong>s<br />
verdes<br />
8. A microscopia de fluorescência revelou a presença de clorofila<br />
essencialmente n<strong>uma</strong> zona externa do <strong>bago</strong> assim como nos tecidos<br />
que envolvem a semente<br />
9. O <strong>bago</strong> <strong>da</strong> <strong>uva</strong> é <strong>uma</strong> <strong>fábrica</strong> <strong>bioquímica</strong> <strong>complexa</strong> <strong>da</strong>do que<br />
produz/acumula/metaboliza <strong>uma</strong> ampla varie<strong>da</strong>de de compostos
Material e Equipamento<br />
Banca<strong>da</strong> de Trabalho
Centrifuga
Pipetas automáticas
Balança de precisão<br />
Medidor de pH
Microscópio de fluorescência