O bago da uva: uma fábrica bioquímica complexa

O bago da uva: uma fábrica bioquímica complexa
Alunos:
•Ana Paulina
•Inês Coturela
•Rodrigo Silva
Responsáveis:
•Ana Cunha
•Hernâni Gerós
•Richard Gonçalves
•António Teixeira

Objectivos
• Preparar extractos celulares de bagos de uvas verdes e
maduras e dosear teor de proteína
• Determinar a actividade enzimática da MDH
• Dosear açúcares e ácidos orgânicos por HPLC
• Realizar curvas de resposta da fotossíntese à luz por
fluorometria de pulso de amplitude modelada (PAM)
• Observar cortes histológicos por microscopia de
epifluorescência
• Explicar algumas modificações bioquímicas e fisiológicas
que ocorrem durante o desenvolvimento do bago

Preparação de extractos celulares
Determinação
da [proteínas]
Medição de
actividades
enzimáticas
N2(l)
Determinação da
concentração de
açúcares e ácidos pelo
HPLC

Actividade da malato desidrogenase

Actividade da malato desidrogenase
Cuvete
Tampão Tris-HCl, pH 8
NADH
Extracto celular
Oxaloacetato

Actividade da malato desidrogenase
• Doseamento de [proteína]
pelo método de Bradford
[proteína] bago verde = 3,2 mg/ml
l = 595 nm

Actividade da malato desidrogenase
• Espectros de absorção do NADH e do NAD +

Actividade da malato desidrogenase
• Velocidade inicial da reacção
pH = 8,0
[oxaloacetato] = 10 mM
v i

Actividade da malato desidrogenase
• Gráfico de Michaelis-Menten

Actividade da malato desidrogenase
• Estimativa de parâmetros cinéticos por modelo matemático
K m = 118,2 mM oxaloacetato
V max =21 µmole de NAD+/min/mg de proteína

Doseamento de açúcares e ácidos por HPLC
Série de padrões de
concentrações
conhecidas
• Cromatogramas de padrões e extractos
bago verde
bago maduro

Doseamento de açúcares e ácidos por HPLC
Teor (mg/g peso fresco)
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Malato
verdes maduras
Teor (mg/g peso fresco)
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Açúcares
S G F S G F
verdes maduras

ETR
Curvas de resposta da fotossíntese à luz
Fluorometria de Pulso Amplitude Modulado (PAM)
120
100
80
60
40
20
0
Bago verde Folhas (madura/ senescente)
0 200 400 600 800 1000
PAR
ETR
120
100
80
60
40
20
0
0 200 400 600 800 1000
Órgão a (eficiência PSII) ETR r máx. (capacidade PSII)
Bago verde grande 0,593 83,7
Bago verde pequeno 0,538 73,0
Folha madura 0,726 100,1
Folha senescente 0,618 61,4
PAR

Microscopia
Microscopia

Microscopia

Conclusões
1. Foram obtidos extractos celulares de uvas verdes e de uvas maduras
2. No bago verde a concentração de ácido málico é muito elevado, sendo
residual no bago maduro
3. No bago maduro a concentração de açúcares é muito elevada, sendo
mínima no bago verde
4. Os principais açúcares acumulados no bago maduro são os
monossacarídeos glucose e frutose
5. A actividade da malato desidrogenase é compatível com a acumulação
do malato medida no bago verde
6. Tal como as folhas, o bago verde é fotossinteticamente activo
7. Folhas mais velhas têm actividade fotossintética inferior à dos bagos
verdes
8. A microscopia de fluorescência revelou a presença de clorofila
essencialmente numa zona externa do bago assim como nos tecidos
que envolvem a semente
9. O bago da uva é uma fábrica bioquímica complexa dado que
produz/acumula/metaboliza uma ampla variedade de compostos

Material e Equipamento
Bancada de Trabalho

Centrifuga

Pipetas automáticas

Balança de precisão
Medidor de pH

Microscópio de fluorescência