Caroline Valente dissertação de mestrado - Universidade Federal ...

4.9 PREPARO DA SUSPENSÃO DE MITOCÔNDRIAS ROMPIDAS
Mitocôndrias foram isoladas de A. angustifolia, conforme descrito no item 4.3
e foram congeladas em nitrogênio líquido, até o momento da sua utilização. As
organelas foram rompidas por 4 ciclos de congelamento e descongelamento. Os
fragmentos de membrana foram utilizados para a avaliação da atividade de enzimas
de complexos da cadeia respiratória.
4.10 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE ENZIMAS DA CADEIA
RESPIRATÓRIA
Determinação da atividade de enzimas ligadas à cadeia respiratória foi
realizada em preparações de mitocôndrias rompidas como descrito no item anterior.
Os métodos espectrofotométricos foram desenvolvidos em espectrofotômetro
Hitachi, modelo U - 2001 UV/VIS equipado com impressora Epson LX 300.
A atividade do complexo NADH-Desidrogenase (EC 1.6.5.3 - NADH:
ferricianeto óxido-redutase) foi determinada pelo método espectrofotométrico
descrito por SINGER (1974). A reação ocorreu a 28ºC, em sistema de reação
constituído de: tampão Hepes 50 mmol.L -1 , pH 7,4, EDTA 2 mmol.L -1 , NADH 0,17
mmoL.L -1 , ferricianeto de potássio 0,6 mmol.L -1 , rotenona 1 μmol.L -1 e proteína
mitocondrial em concentração adequada (0,1 mg.mL -1 de proteína mitocondrial). A
reação foi monitorada a 420 nm e os resultados expressos em micromol de
ferricianeto reduzido. min -1 . mg -1 de proteína, considerando-se o coeficiente de
extinção molar do ferricianeto de 1.040 mol.L -1 . cm -1 (CREUTZ & SUTIN, 1973).
A atividade da NADH citocromo c redutase (EC 1.6.99.3 - NADH: Citocromo c
óxido redutase) foi avaliada pelo método descrito por SOMLO (1965), em sistema de
reação constituído de: tampão Hepes 50 mmol.L -1 , pH 7,4, EDTA 2 mmol.L -1 , NADH
50 μmol.L -1 , citocromo c (oxidado) 40 μmol.L -1 , NaCN 1 mmol.L -1 e proteína
mitocondrial em concentração adequada (0,1 mg.mL -1 de proteína mitocondrial). A
reação ocorreu a 28 o C e foi iniciada pela adição de NADH. A velocidade de redução
do citocromo c foi acompanhada a 550 nm e o resultado expresso em nmol de
citocromo c reduzido. min -1 . mg -1 de proteína mitocondrial, considerando-se a