Caroline Valente dissertação de mestrado - Universidade Federal ...

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estoques com as concentrações de Tris 0,5 mol.L -1 pH 10 e ácido capróico 0,4 mol.L 1 e a membrana foi ativada com metanol por 10 segundos, depois lavada 2 vezes com água destilada e colocado no tampão A2. A placa do ânodo foi molhada com tampão A1 e coberta com duas camadas de papel de filtro encharcadas com tampão A1. Sobre os 2 papeis filtros, foi colocado 1 camada de papel filtro encharcadas com tampão A2, depois foi colocado a membrana previamente molhada com tampão A2. Em seguida, o gel de poliacrilamida contendo as proteínas foi colocado sobre a membrana que estava encharcada com o tampão A2. Sobre o gel foram colocadas 3 camadas de papel filtro encharcados em tampão C. Uma pipeta de vidro foi utilizada para retirar as bolhas de ar e o excesso de tampão foi retirado com um papel de filtro. A placa do cátodo foi colocada sobre as folhas do papel filtro e o sistema foi ligado. Após a transferência da membrana de PVDP Hybond TM P foi então incubada por 12 horas a 4°C, durante a noite, em tampão TBST (Tris 2,42 g.L -1 pH 7,6, NaCl 8 g.L -1 e tween 20 1 mL.L -1 ), contendo 5% de leite em pó desnatado (Molico) com a finalidade de bloquear sítios reativos da membrana. Após esse período a membrana foi tratada com o anticorpo primário (AtPUMP) diluído 1:1000 em tampão TBST-1% leite. Para o anticorpo anti-AtPUMP, extratos celulares totais de E. coli sonicados foram utilizados para bloquear interações inespecíficas do anticorpo com outras proteínas. A incubação do anticorpo com a membrana foi feita sob leve agitação por 5 horas à temperatura ambiente. Após incubação, a membrana foi lavada 3 vezes, durante 15 , 5 e 5 minutos cada, com tampão TBST. Após a lavagem, a membrana foi incubada por 2 horas à temperatura ambiente, sob leve agitação, com o anticorpo secundário anti-IgG de coelho conjugado com a peroxidase (HRP) diluído 1:5000 em tampão TBST-1% leite. Após incubação a membrana foi lavada 4 vezes sob agitação, durante 15, 5, 5 e 5 minutos cada, com tampão TBST. A detecção das proteínas reconhecidas pelo anticorpo foi feita através da reação da peroxidase por quimioluminescência (sistema ECL Plus, GE Healthcare) de acordo com as orientações do fabricante. A revelação da membrana foi feita em câmara escura e o resultado foi registrado utilizando uma câmera CCD, em um sistema acoplado vídeo- imagem (UVP).
4.9 PREPARO DA SUSPENSÃO DE MITOCÔNDRIAS ROMPIDAS Mitocôndrias foram isoladas de A. angustifolia, conforme descrito no item 4.3 e foram congeladas em nitrogênio líquido, até o momento da sua utilização. As organelas foram rompidas por 4 ciclos de congelamento e descongelamento. Os fragmentos de membrana foram utilizados para a avaliação da atividade de enzimas de complexos da cadeia respiratória. 4.10 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE ENZIMAS DA CADEIA RESPIRATÓRIA Determinação da atividade de enzimas ligadas à cadeia respiratória foi realizada em preparações de mitocôndrias rompidas como descrito no item anterior. Os métodos espectrofotométricos foram desenvolvidos em espectrofotômetro Hitachi, modelo U - 2001 UV/VIS equipado com impressora Epson LX 300. A atividade do complexo NADH-Desidrogenase (EC 1.6.5.3 - NADH: ferricianeto óxido-redutase) foi determinada pelo método espectrofotométrico descrito por SINGER (1974). A reação ocorreu a 28ºC, em sistema de reação constituído de: tampão Hepes 50 mmol.L -1 , pH 7,4, EDTA 2 mmol.L -1 , NADH 0,17 mmoL.L -1 , ferricianeto de potássio 0,6 mmol.L -1 , rotenona 1 μmol.L -1 e proteína mitocondrial em concentração adequada (0,1 mg.mL -1 de proteína mitocondrial). A reação foi monitorada a 420 nm e os resultados expressos em micromol de ferricianeto reduzido. min -1 . mg -1 de proteína, considerando-se o coeficiente de extinção molar do ferricianeto de 1.040 mol.L -1 . cm -1 (CREUTZ & SUTIN, 1973). A atividade da NADH citocromo c redutase (EC 1.6.99.3 - NADH: Citocromo c óxido redutase) foi avaliada pelo método descrito por SOMLO (1965), em sistema de reação constituído de: tampão Hepes 50 mmol.L -1 , pH 7,4, EDTA 2 mmol.L -1 , NADH 50 μmol.L -1 , citocromo c (oxidado) 40 μmol.L -1 , NaCN 1 mmol.L -1 e proteína mitocondrial em concentração adequada (0,1 mg.mL -1 de proteína mitocondrial). A reação ocorreu a 28 o C e foi iniciada pela adição de NADH. A velocidade de redução do citocromo c foi acompanhada a 550 nm e o resultado expresso em nmol de citocromo c reduzido. min -1 . mg -1 de proteína mitocondrial, considerando-se a
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