Caroline Valente dissertação de mestrado - Universidade Federal ...

4.8 WESTERN BLOT
4.8.1 Eletroforese de Proteína
O procedimento utilizado foi descrito por Laemmli (1970) e foi desenvolvido no
Laboratório de Fixação Biológica de Nitrogênio, sob o acompanhamento dos
Professores Dr.ª Rose Adele Monteiro e Dr. Emanuel Maltempi de Souza. As
amostras, contendo a proteína a ser analisada, foram submetidas à separação
eletroforética em condições desnaturantes (SDS-PAGE) em sistema vertical
utilizando o sistema do fabricante BioRad. A concentração do gel separador utilizado
foi de 12% e do gel de empilhamento foi de 4%.
As amostras contendo 100 μg de extrato mitocondrial de células
embriogênicas de A. angustifolia submetidas ou não ao estresse pelo frio por 24h e
48h a 4°C e pelo calor por 12h a 37°C e por 4h a 43°C e de tubérculo de batata
(Solanum tuberosum L., cv. Bintje) submetido ou não ao estresse pelo frio por 5 dias
a 4°C foram misturadas com tampão de amostra contendo 2% de SDS, 10% de
glicerol, 0,01% de azul de bromofenol, 0,0625 mol.L -1 de Tris-HCl pH 6,8 e 5% de β-
mercaptoetanol e foram fervidas a 100°C por 5 mim antes da aplicação. A voltagem
da corrida variou de 100 a 200V, utilizando o tampão de corrida Laemmli com 3 g/L
de Tris-base, 14 g/L de Glicina e 1 g/L de SDS. Após a corrida em gel de
eletroforese, um gel foi utilizado para a transferência das proteínas e no outro as
proteínas foram coradas com corante Coomassie Blue.
4.8.2 Transferência das Proteínas
As proteínas foram transferidas do gel de poliacrilamida para a membrana de
PVDP Hybond ® e utilizando um sistema semi – seco, com tampão de transferência
A1, A2 e C e foi transferido por 1h a 80 mA. Os três tampões utilizados foram
preparados da seguinte maneira: Tampão A1: 150 mL de Tris, 50 mL de metanol e
50 mL de água; Tampão A2: 12,5 mL de Tris, 50 mL de metanol e 187,5 mL de
água; Tampão C: 12,5 mL de Tris, 25 mL de ácido capróico, 162,5 mL de água e 50
ml de metanol. Os tampões de transferência foram preparados usando soluções