Caroline Valente dissertação de mestrado - Universidade Federal ...

4.6 DETERMINAÇÃO DO CONSUMO DE OXIGÊNIO
O consumo de O2 foi determinado a uma temperatura de 29ºC com eletrodo
de oxigênio tipo Clark (Yellow Springs Instruments Co.) em câmara fechada
termostatizada em polarógrafo Gilson. O sistema de reação em um volume final de
1,3 mL foi denominado meio de reação padrão e sendo constituído de sacarose 250
mmol.L –1 , KCl 2 mmol.L –1 , HEPES 10 mmol.L –1 (pH 7,2), BSA 0,2 g% e rotenona 40
μmol.L –1 (exceto quando indicado) e proteína mitocondrial em quantidades
adequadas para cada experimento. Este meio foi suplementado com os substratos
malato 10 mmol.L –1 , glutamato 10 mmol.L –1 , succinato 5 mmol.L –1 ou NADH 2
mmol.L –1 conforme indicado nas figuras. Outras adições foram feitas de acordo com
o protocolo seguido no dia do experimento. O coeficiente de controle respiratório
(CCR) foi obtido da razão entre a velocidade respiratória no estado 3 e estado 4, e
serviu como determinante da qualidade da preparação (CHANCE & WILLIAMS,
1955). Neste caso o meio foi suplementado com Pi 2 mmol.L –1 , malato 10 mmol.L –1 ,
glutamato 10 mmol.L –1 , ADP 80 nmol e 160 nmol por mg de proteína.
As velocidades respiratórias foram expressas em nanomoles de oxigênio
consumidos por miligrama de proteína mitocondrial por minuto, considerando-se que
a solubilidade do oxigênio na água a 29ºC e 1 atmosfera é de 296,40 μmol por litro
(ESTABROOK, 1967).
4.7 DETERMINAÇÃO DO POTENCIAL ELÉTRICO DE MEMBRANA (Δψ Δψ Δψ) Δψ
O potencial elétrico de membrana foi acompanhado fluorometricamente
através da variação da fluorescência da safranina O em espectrofluorímetro
Shimadzu RF–5301 PC acoplado a uma impressora (ÅKERMAN & WIKSTRÖM,
1976). O sistema de incubação foi constituído de sacarose 250 mmol.L –1 , HEPES–
K + (pH 7,2) 10 mmol.L –1 , BSA 0,1 g%, NaH2PO4 1 mmol.L –1 , rotenona 5 μmol.L –1 e
safranina O 5 μmol.L –1 , usando os comprimentos de onda de 495 nm (excitação) e
586 nm (emissão) com abertura de fenda de 3 nm (excitação e emissão). A medida
do potencial de membrana foi iniciada com succinato 2 mmol.L, malato 10 mmol.L –1 ,
glutamato 10 mmol.L –1 ou NADH 2 mmol.L –1 conforme indicado.