Caroline Valente dissertação de mestrado - Universidade Federal ...

a fração mitocondrial, foi ressuspensa em meio de isolamento de modo a obter uma
suspensão correspondente a aproximadamente 10–20 mg de proteína por mL. Um
esquema do isolamento de mitocôndrias de células embriogênicas de A. angustifolia
está representado na Figura 5.
4.4 ISOLAMENTO DE MITOCÔNDRIAS DE Araucaria angustifolia TRATADAS
PELO FRIO E PELO CALOR
As culturas de células embriogênicas de A. angustifolia foram submetidas ao
estresse pelo frio e pelo calor. No estresse pelo frio as placas de Petri com as
culturas de araucária foram deixadas por 24h e por 48h a uma temperatura de 4 ±
1ºC em uma sala refrigerada, na ausência da luz. Já no estresse pelo calor as
placas de Petri com as culturas de araucária foram deixadas por 4h em estufa a 43 ±
1ºC e por 12h em uma estufa a 37 ± 1ºC. Posteriormente, essas células foram
utilizadas para o isolamento de mitocôndrias segundo o item 4.3. As mitocôndrias
das células submetidas ao estresse, foram utilizadas para analisar os efeitos
provocados pelo frio e calor no controle respiratório e na expressão da PUMP pela
técnica de western blot. Para uma melhor visualização da atividade da PUMP foram
isoladas mitocôndrias utilizando meios de extração, isolamento e de reação que
continham ou não BSA desprovido de ácidos graxos.
4.5 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS
As concentrações de proteínas das suspensões mitocondriais foram
determinadas pelo método descrito por Lowry et al., (1951), utilizando albumina de
soro bovino como padrão. As leituras foram realizadas a 700 nm em
espectrofotômetro HITASHI 2001 acoplado a uma impressora Epson LX 300.