Caroline Valente dissertação de mestrado - Universidade Federal ...

nmol.L -1 , glutamina 6,8 mmol.L -1 , ácido 2,4–diclorofenóxiacético 2 μmol.L -1 ,
benzilaminopurina 0,5 μmol.L -1 , cinetina 0,5 μmol.L -1 , sacarose a 3% (m/v), caseína
a 0,5 % (m/v) e Phytagel (Sigma ® ) a 2% (m/v) (SANTOS et al., 2002). O pH do meio
de cultura foi ajustado para 5,8 com KOH antes de ser autoclavado a 121ºC (1 atm)
por 20 minutos. As soluções de L–glutamina e de hidrolisado de caseína foram
filtradas através de uma membrana esterilizante de 25 mm de diâmetro e 0,22 μm de
poro e adicionadas ao meio de cultura autoclavado e frio.
Para manutenção do tecido vegetal as culturas embriogênicas foram
cultivadas por 20 dias, no escuro em temperatura de 25 ± 0,5ºC e umidade relativa
do ar igual a 70% ± 5. A cada 20 dias as culturas foram repicadas e transferidas para
placas de Petri contendo o meio BM.
4.3 ISOLAMENTO DE MITOCÔNDRIAS DE Araucaria angustifolia
Mitocôndrias foram isoladas de culturas de células embriogênicas de A.
angustifolia, através de centrifugações diferenciais pela técnica desenvolvida por
Mariano e colaboradores (2004), como descrito a seguir. Culturas embriogênicas de
A. angustifolia de 15 – 17 dias foram transferidas para um béquer na presença do
meio de extração gelado a 4ºC contendo sacarose 250 mmol.L –1 , HEPES 10
mmol.L –1 (pH 7,6), EGTA 2 mmol.L –1 , cisteína 3 mmol.L –1 e BSA 0,2 g%. Utilizando
uma tesoura o material foi reduzido a pequenos fragmentos. Em seguida, o tecido foi
homogeneizado utilizando-se o homogeneizador van Potter–Elvehjem (10 vezes
com o pistilo frouxo e 10 vezes com o pistilo apertado) e rompidos em
homogeneizador Turratec através de ciclos de 4 segundos na presença de meio de
extração gelado a 4ºC. A proporção de meio utilizado foi de 200 mL para 35 g de
tecido. O homogenato foi filtrado através de tecido gabardine e o pH foi ajustado
para 7,2 com NaOH. O filtrado foi centrifugado por 10 minutos a 1.000 x g e o
sobrenadante foi centrifugado por 10 minutos a 15.000 x g. Os precipitados
resultantes foram ressuspensos em meio de isolamento (sacarose 250 mmol.L –1 ,
HEPES 10 mmol.L –1 (pH 7,2), EGTA 0,25 mM, BSA 0,2 g%) e transferidos para um
único tubo. Este foi centrifugado a 1.000 x g por 10 minutos. Em seguida, o
sobrenadante foi centrifugado a 15.000 x g por 10 minutos, e o precipitado, contendo