Caroline Valente dissertação de mestrado - Universidade Federal ...

RESUMO
Mitocôndrias de células embriogênicas de A. angustifolia contêm na sua
membrana interna a cadeia transportadora de elétrons, bombeadora de H + e
produtora de ATP e também uma oxidase alternativa (AOX), não bombeadora de H + ,
insensível a cianeto e sensível ao SHAM. Possuem outros componentes alternativos
como as NADH desidrogenases alternativas, que são sensíveis a flavona, uma
oxidase alternativa (AOX) e uma proteína desacopladora de mitocôndrias de plantas
(PUMP) identificada neste trabalho, pela primeira vez, em gimnospermas.
Mitocôndrias de A. angustifolia foram capazes de respirar pela oxidação dos
substratos malato/glutamato e succinato, com alta capacidade fosforilativa,
demonstrada pelos controles respiratórios. Estas mitocôndrias também oxidaram o
NADH externamente adicionado na presença e na ausência de rotenona.
Malato/glutamato foram oxidados na presença de rotenona, evidenciando a
presença da NADH desidrogenase interna. A adição de flavona a mitocôndrias
respirando na presença de FCCP, causou inibição de 60% em ambas as
desidrogenases alternativas. O complexo I e a succinato oxidase foram inibidos em
10-15% e 20%, respectivamente. O grau de inibição pela flavona nas atividades de
NADH desidrogenase e NADH citocromo c redutase em mitocôndrias rompidas,
também sugere o envolvimento das NADH desidrogenases alternativas. Além disso,
a flavona causou uma significativa queda no potencial de membrana em
mitocôndrias energizadas por NADH ou malato/glutamato. Mitocôndrias de células
embriogênicas de A. angustifolia tratadas pelo frio e pelo calor, foram isoladas com o
intuito de compará-las com mitocôndrias não submetidas a estresse. Através de
análises por western blot foi possível identificar a proteína PUMP nas mitocôndrias
de A. angustifolia submetidas ao estresse pelo frio e pelo calor. Foi utilizando o
anticorpo policlonal de Arabidopsis thaliana (AtPUMP), o qual tem sido utilizado na
identificação da PUMP de diferentes espécies de plantas, como do tubérculo de
batata e tomate. A PUMP foi visualizada em uma única banda com peso molecular
maior que 33 kDa. Células expostas a uma temperatura de 4°C por 48h tiveram
aumento da expressão da PUMP quando comparadas com as mitocôndrias de
células não submetidas a estresse. Já o efeito da exposição a 43°C por 4h parece
ter sido muito drástico, pois desapareceu a banda da PUMP. A atividade da PUMP
foi avaliada pela adição de BSA aos meios de isolamento e/ou de reação. Os valores
de controle respiratório mostraram que o BSA previne o desacoplamento em todas
as condições de estresse, indicando sua ação inibitória sobre a PUMP. Nos estudos
comparativos da morfologia das células embriogênicas da A. angustifolia submetidas
ou não a estresses por variação de temperatura, observou-se que o estresse pelo
frio ou pelo calor foram danosos à morfologia tanto das células embrionárias como
das suspensoras, interferindo na multiplicação celular, levando a uma diminuição no
número de células e ocasionando deformações nas células suspensoras.