Avaliação da proteína de recombinante DnaK (HSP70)

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
AVALIAÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE DnaK (HSP70) DE Mycoplasma
hyopneumoniae COMO ANTÍGENO VACINAL
TESSÁLIA DINIZ LUERCE
MONOGRAFIA DE CONCLUSÃO DE CURSO
Universidade Federal de Pelotas
Campus Universitário s/nº
Caixa-postal 354 CEP 96010-900
Pelotas – RS – Brasil
2007

TESSÁLIA DINIZ LUERCE
AVALIAÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE DnaK (HSP70) DE Mycoplasma
hyopneumoniae COMO ANTÍGENO VACINAL
PELOTAS, 2007
Monografia apresentada ao curso
de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Pelotas
como requisito parcial à
obtenção do título de Bacharel
em Ciências Biológica.
Orientador:......................................

BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Odir Antônio Dellagostin (Orientador)
Universidade Federal de Pelotas.
Doutoranda Simone Simionatto (co-orientadora)
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Agrícola.
Universidade Federal de Pelotas.
Prof. Dr. Fabricio Rochedo Conceição
Fundação Universidade Federal do Rio Grande.
Prof a . MSc Daiane Drawanz Hartwig
Universidade Federal de Pelotas.

DEDICATÓRIA
A Deus Pai, que ofereceu o que tinha de mais valioso pela minha vida!
A Jesus pela constante presença, pelo seu gesto de amor ao oferecer
sua vida para pagar o preço da minha dívida, por ter ressuscitado e
ascendido ao céu, abrindo os portais eternos e nos dando livre acesso à
presença de Deus!
Ao amado Espírito Santo que me ensina e ajuda a andar na verdade!
A esse Deus trino, que é um Deus vivo, um Deus que esta perto. O
criador de todas as coisas, que neste trabalho me permitiu conhecer um
pouco mais da sua maravilhosa criação!

AGRADECIMENTOS
A Universidade Federal de Pelotas pela oportunidade de realizar um curso de
graduação de qualidade.
Ao meu orientador, Odir A. Dellagostin, pela orientação, experiência,
ensinamentos, apoio, confiança, exemplo de dedicação e profissionalismo, que foram
importantes para o desenvolvimento deste trabalho, assim como para minha vida pessoal
e profissional.
Ao Maicon, meu amado esposo, por todo amor, amizade e companheirismo, por
sempre acreditar no meu potencial, sempre me incentivando a crescer e lutar.
Aos meus pais e irmãs por todo esforço e incentivos dados em minha vida.
Aos meus amigos da Aliança Bíblica Universitária de Pelotas pelos momentos de
crescimento e descontração.
Aos meus amigos e colegas de laboratório de Biologia Molecular, Alan, André,
Ângela, Cristina, Daiane, Fabiana, Fabricio, Fernanda, Francine, Gustavo, Luciano,
Marcelo, Michel, Michele, Sandra, Sibele, Silvana, Reginaldo, Robson, Valeska,
Vanessa e Vanuza pelo apoio, incentivo e amizade.
A doutoranda Simone Simionatto pela especial co-orientação, pela paciência
e por sua constante disposição em compartilhar seus conhecimentos.
Aos colegas, estagiários e amigos do Centro de Biotecnologia, pela amizade
e convívio agradável.
Ao CNPq pela concessão de bolsa de iniciação científica.
E a todos que direta ou indiretamente contribuíram de alguma forma para a
realização deste trabalho.
Muito Obrigada!

µg – micrograma
µL – microlitro
µm – micrômetro
µM – micro molar
Al(OH) 3 – hidróxido de alumínio
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIAÇÕES
BSA – Bovine Sorum Albumin (albumina sérica bovina)
CDRS – Complexo de Doenças Respiratórias em Suínos
CIP – Calf Intestine Alkaline Phosphatase (enzima fosfatase alcalina isolada de
intestino de bezerro)
C-dnaK – região C-terminal do gene dnaK
DNA – ácido desoxirribonucléico
dnaK – gene codificador da proteína DnaK
DnaK – proteína codificada pelo gene dnaK
dNTP – 2’ - desoxinucleotídeo 5’ – trifosfatos
EDTA – ácido etileno diamino tetracético
ELISA – Enzime-Linked Immunossorbent Assay (ensaio de imunoabsorção
enzimática)
h – hora
IL – interleucina
IM – intramuscular
IPTG – isopropil ß-D-tiogalactosídeo
kb – kilobase
kDa – kilodalton
LB – Meio Luria - Bertani
M – molar
mA – miliampér
mg – miligrama
MgCl 2 – cloreto de magnésio
min – minutos
mL – mililitro
mm – milímetro

mM – milimolar
NaCl – cloreto de sódio
NaH 2 PO 4 – dihidrogenofosfato de sódio
Ni 2+ – níquel
ng – nanograma
nm – nanômetro
OD – Optical Density (densidade óptica)
pb – pares de bases
PBS – tampão fosfato salino
PBS -T – tampão fosfato salino acrescido de 0,05% de Tween 20
PCR – Polimerase Chain Reaction (reação em cadeia da polimerase)
PES – Pneumonia Enzoótica Suína
pH – potencial de hidrogênio
pMol – picomol
rC-DnaK – região c-terminal da proteína DnaK obtida por sistema heterólogo de
expressão
RNApol – RNA polimerase
rpm – rotações por minuto
s – segundos
SDS-PAGE – Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
(Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS)
SPF – Specific Pathogen Free (livre de patógeno específico)
TBE – tampão tris-borato-EDTA
TE – tampão tris-EDTA
TNF- a – tumor necrosis factor-alpha (fator de necrose tumoral - alfa)
U – unidade de enzima
UV – luz ultravioleta
V – volt
vol – volume
x – vezes

SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................................... 11
1.1 Pneumonia Enzoótica Suína ................................................................................................ 11
1.2 Agente etiológico................................................................................................................. 11
1.3 Patogenia............................................................................................................................. 12
1.4 Importância econômica........................................................................................................ 13
1.5 Diagnóstico.......................................................................................................................... 14
1.6 Controle da Pneumonia Enzoótica Suína............................................................................. 15
1.7 Vacinas recombinantes........................................................................................................ 15
1.8 Vacinas de subunidade e sistemas de expressão heteróloga.............................................. 16
1.9 Proteínas de choque térmico (HSPs) ................................................................................... 17
1.10 DnaK (HSP70) como antígeno vacinal................................................................................ 18
2 OBJETIVOS ....................................................................................................................... 19
2.1 Objetivo geral....................................................................................................................... 19
2.2 Objetivo específico .............................................................................................................. 19
3 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................... 20
3.1 Cepa e extração de DNA ...................................................................................................... 20
3.2 Desenho dos primers........................................................................................................... 20
3.3 Reação em cadeia da polimerase (PCR) .............................................................................. 20
3.4 Clonagem e expressão da proteína recombinante............................................................... 21
3.5 Teste de solubilidade........................................................................................................... 23
3.6 Purificação da proteína recombinante C-DnaK.................................................................... 23
3.7 Diálise .................................................................................................................................. 24
3.8 Imunização dos camundongos............................................................................................ 24
3.9 Avaliação da resposta imune humoral................................................................................. 25
3.10 Avaliação da antigenicidade da rC-DnaK por Western e dot blot...................................... 25
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................................... 27
4.1 Seleção da região C-temrinal do gene dnaK ........................................................................ 27

4.2 Construção do vetor pAE/C-dnaK ........................................................................................ 27
4.3 Avaliação da expressão da rC-DnaK em diferentes cepas de E. coli................................... 29
4.4 Determinação da solubilidade da proteína recombinante.................................................... 29
4.5 Purificação e quantificação da rC-DnaK .............................................................................. 30
4.6 Resposta imune humoral induzida pela vacina recombinante de subunidade .................... 31
4.7 Reconhecimento da proteína recombinante pelo soro de suínos imunizados contra a PES e
suínos naturalmente infectados pelo M. hyopneumoniae ......................................................... 32
5 CONCLUSÃO .................................................................................................................... 34
6 REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 35

RESUMO
LUERCE, Tessália Diniz. Avaliação da proteína recombinante DnaK (HSP70) de
Mycoplasma hyopneumoniae como antígeno vacinal. 2007. 40f. Monografia –
Ciências Biológicas Bacharelado, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
A Pneumonia Enzoótica Suína (PES), causada pelo Mycoplasma
hyopneumoniae, é uma importante doença na criação suinícola brasileira e mundial.
Altamente contagiosa, destrói os cílios do trato respiratório, predispondo o animal
infectado a outros patógenos. Atualmente as vacinas disponíveis no mercado são
compostas por bacterinas, as quais além de apresentar um elevado custo de
produção devido às dificuldades no cultivo de M. hyopneumoniae, conferem
proteção parcial. O objetivo deste estudo foi produzir por sistema de expressão
heterólogo em Escherichia coli a fração C-terminal da proteína DnaK (C-DnaK),
avaliar sua capacidade imunogênica em camundongos BALB/c e antigenicidade,
confrontando com soro de suínos imunizados contra PES e também de suínos
naturalmente infectados pelo M. hyopneumoniae. O gene foi amplificado por PCR,
inserido no vetor pAE e a proteína recombinante expressa em E. coli BL21(DE3)
pLysS, sendo purificada por cromatografia de afinidade. A C-DnaK recombinante
(rC-DnaK) foi inoculada em camundongos e a resposta imune humoral avaliada por
ELISA indireto. A proteína recombinante foi capaz de induzir uma resposta imune
humoral em camundongos. Sendo observada uma absorbância média de 0,133,
para rC-DnaK testada contra o pool dos soro dos animais inoculados com a
bacterina, indicando haver produção de anticorpos contra a rC-DnaK na presença do
M. hyopneumoniae. Através da técnica de Western blot foi observado que suínos
imunizados contra a PES apresentam anticorpos que reconhecem epítopos da rC-
DnaK. A proteína recombinante foi reconhecida pelo soro dos suínos naturalmente
infectados pelo M. hyopneumoniae, quando utilizada a técnica não desnaturante, dot
blot, sugerindo que esta proteína é expressa durante a infecção. Estes resultados
demonstram que a rC-DnaK constitui um alvo potencial para a utilização em testes
de imunoproteção em suínos.
Palavras chave: Vacina Recombinante, Pneumonia Enzoótica Suína, DnaK,
Mycoplasma hyopneumoniae.

1 INTRODUÇÃO
1.1 Pneumonia Enzoótica Suína
A Pneumonia Enzoótica Suína (PES), causada primariamente pelo
Mycoplasma hyopneumoniae, é uma doença respiratória altamente contagiosa, de
distribuição cosmopolita, caracterizada por alta morbidade, baixa mortalidade, tosse
crônica, retardo do crescimento (OBOEGBULEN, 1981), formação de hiperplasia
das células epiteliais e aumento perivascular e peribronquiolar com acúmulo de
células mononucleares (KOBISCH, FRIIS 1996). A instalação do M. hyopneumoniae
promove a destruição dos cílios do tecido epitelial ao longo do trato respiratório,
reduzindo sua capacidade de defesa e permitindo a entrada de patógenos
secundários (CHOI et al., 2006) agravando, assim, o quadro clínico do animal
(ARAÚJO, 2004) e aumentando os prejuízos (TRACKER et al., 1999).
A disseminação da PES em um rebanho pode ocorrer através do contato
direto dos animais sadios com as secreções do aparelho respiratório do suíno
infectado ou por aerossóis eliminados durante a tosse. Entre plantéis pode ocorrer
por via aerógena, visto que os aerossóis podem atingir até 3,5 km, ou serem levadas
por veículos de transporte (RAUTIAINEN, WALLGREN, 2001; BARGEN, 2004). Ou
ainda, acontecer a transmissão passiva, através do compartilhamento de utensílios
com granjas contaminadas (FANO et al., 2005). A existência de ventilação
inadequada, alta densidade de animais no criatório, ausência de controle da
temperatura, mistura de animais de várias idades e origens, favorecem a instalação
da pneumonia enzoótica suína e sua permanência no rebanho. A PES afeta suínos
de todas as idades, porém sua forma clínica é mais comum em animais da fase de
crescimento e terminação (SOBESTIANSKY et al., 1999).
1.2 Agente etiológico
O M. hyopneumoniae é uma bactéria pertencente à classe Mollicutes, que
não apresenta parede celular, que lhe confere a forma pleomórfica, resistência a
antibióticos, que interferem na síntese da parede celular, como as penicilinas,
cefalosporinas e vancomicinas, além de não corar-se pelo método de Gram, sendo
recomendadas as colorações Giemsa, Castañeda, Dienes e novo azul de metileno
(CONCEIÇÃO; DELLAGOSTIN, 2006; MONTAGNER et al., 2006). Além disso,

possui uma membrana trilaminar simples composta de proteínas, glicoproteínas,
glicolipídeos, fosfolipídios e colesterol, sendo este último responsável pela rigidez e
estabilidade osmótica da membrana (CONCEIÇÃO; DELLAGOSTIN, 2006).
Apresenta suscetibilidade a lise por choque osmótico, pelo uso de detergentes,
álcool, por anticorpos específicos ligados ao complemento (VERONESI, FOCACCIA,
1996) e não resiste á variações bruscas de pH e temperatura.
Seu tamanho varia entre 400-1200 nm, sendo considerado pequeno quando
comparado a outras bactérias e possui um dos menores genomas (920,079 Kb) não-
virais conhecidos, apresentando baixo conteúdo de guanina e citosina (28%)
(VASCONCELOS et al., 2005; ARRAES et al., 2007).
Um reflexo deste genoma conciso é seu caráter fastidioso, suas necessidades
nutricionais e sua limitada capacidade biossintética (STAATS et al., 2007), de modo
que, a manutenção deste estilo de vida, exigiu a adoção de um comportamento
parasitário, explorando nutrientes não sintetizados e evoluindo para invadir e
permanecer em seus hospedeiros (VAN HAM et al., 2003). Devido a estas
características, apenas uma parcela mínima dos micoplasmas existentes na
natureza já foi cultivada in vitro. Embora o M. hyopneumoniae participe dessas
limitações, é possível cultivá-lo utilizando meios líquidos e sólidos extremamente
enriquecidos, porém, cresce pouco e lentamente mesmo nos melhores meios
disponíveis. Quando cultivado em meio sólido, sua colônia apresenta-se
morfologicamente semelhante ao um “ovo frito”.
A presença de seqüências repetidas em regiões gênicas e intergênicas,
criadas por “derrapagens” durante o processo de replicação, levanta a suspeita de
que o M. hyopneumoniae utiliza o mecanismo de variação de fase para aumentar a
variabilidade de suas proteínas como estratégia para explorar ainda mais seu
genoma reduzido, embora não tenha sido observada nenhuma proteína que valide
essa suspeita (FERREIRA, CASTRO, 2007).
1.3 Patogenia
O “Complexo de Doenças Respiratórias em Suínos” (CDRS), composto por
patógenos de origem bacteriana ou viral, que podem causar infecções
concomitantemente, é uma ameaça à saúde dos rebanhos, sendo o M.
hyopneumoniae um dos principais agentes deste complexo (TRACKER, 2006). O
agente da PES se fixa aos cílios da traquéia, brônquios e bronquíolos, paralisando-

os e destruindo-os. Park et al. (2002) levantam a possibilidade desta fixação induzir
o aumento de cálcio livre intracelular nas células epiteliais e ser o responsável pela
perda dos cílios. Este dano desestrutura o principal mecanismo de defesa
inespecífica do trato respiratório, o elevador mucociliar, tornando o animal suscetível
a patógenos secundários (CIPRIAN et al., 1988; MORRIS et al., 1995; YOUNG et al.,
2000).
O M. hyopneumoniae expõe vários epítopos simultaneamente causando uma
resposta imune localizada, interagindo com macrófagos alveolares e linfócitos,
estimulando-os a produzir citocinas pró-inflamatórias (TNF- a, IL -1 e IL -6) que, além
de produzirem as lesões pulmonares, hiperplasia linfóide perivascular e
peribrônquica (RODRIGUEZ et al., 2004; SOBESTIANSKY et al., 1999), são
responsáveis pela redução do crescimento (WILKIE, MALLARD, 1999), aumentando
o prazo para abate. Além disso, um processo de imunossupressão generalizada é
desenvolvido.
Nos estágios iniciais da doença observa-se perda de cílios, esfoliação,
discreto acúmulo de neutrófilos ao redor das vias aéreas; e, com a evolução da
doença, há um aumento no número de linfócitos nos espaços peribrônquiais,
peribronquiolares e perivasculares. As lesões pulmonares desenvolvem-se
principalmente nas porções anteroventral ou apical dos lobos pulmonares, seguindo
o caminho que o ar faz ao entrar nos pulmões. Visualmente bem delimitadas, de
consistência firme, as lesões variam da coloração vermelho púrpura ao castanho
acinzentado (RIBEIRO et al., 2004; CONCEIÇÃO; DELLAGOSTIN, 2006). Depois de
infectado o suíno leva entre 10 a 16 dias para manifestar os primeiros sinais da
doença (MAES et al., 2007).
1.4 Importância econômica
A carne suína é uma das mais consumidas no mundo. Em duas décadas de
pesquisa foi possível a obtenção de uma carne mais saudável, com redução de 31%
da gordura, 10% do colesterol e 14% das calorias, promovendo um aumento do
consumo no país. Atualmente, a carne suína é a terceira mais consumida pelos
brasileiros, com um consumo de 12,7 kg/habitante/ano, em alguns países europeus
que chega à 76 kg/habitante/ano (SCOFANO, 2006). Em quarto lugar no ranking
mundial sobre produção e exportação de carne suína, o Brasil, em 2006, atingiu 2,86
milhões de toneladas, exportando 18%.

A PES é uma das mais importantes doenças da indústria suinícola brasileira e
mundial (RAUTIEN, WALLGREN, 2001; CONCEIÇÃO et al., 2006; MAES et al.,
2007). Rebanhos infectados pela pneumonia enzoótica apresentam retardo no prazo
do abate dos suínos, e possíveis mortes decorrentes das infecções secundárias,
gerando grandes perdas econômicas. Segundo Morris et al. (1995) esse prejuízo
pode atingir o alto índice de 44%.
Pesquisas realizadas em matadouros de vários países, tem revelado a
ocorrência de lesões típicas de enfermidade em 30% à 80% dos animais abatidos.
No Brasil, constatou-se que 55% dos suínos de abate apresentavam lesões
sugestivas e 100% dos rebanhos examinados estavam afetados (SOBESTIANKY et
al., 1999). A doença promove perdas econômicas que podem chegar a 20% sobre a
conversão alimentar e até 30% sobre o ganho de peso, dependendo da gravidade
das lesões e das infecções secundárias (SOBESTIANYSK et al., 1999).
O alto índice de PES em criadouros comerciais no mundo todo e,
especialmente no Brasil, onde se estima estar presente na totalidade das granjas,
desencadeiam perdas econômicas que requerem novas estratégias de controle para
a doença.
1.5 Diagnóstico
A PES pode ser diagnosticada com base nos sinais clínicos da doença,
observação de lesões macroscópicas e análises histopatológicas (RIBEIRO et al.,
2004; SCOFANO, 2006). Porém, outras doenças podem provocar sinais clínicos e
lesões semelhantes. Além disso, as lesões causadas pela PES podem apresentar-
se modificadas quando o animal estiver acometido de infecções secundárias.
Diagnóstico por métodos sorológicos como Hemoaglutinação Indireta,
Fixação de Complemento e ELISA, podem ser realizados no rebanho nove dias
após a observação de tosse nos animais, quando já é possível detectar a
soroconversão. Quando utilizado o ELISA deve-se utilizar métodos complementares
para determinar o diagnóstico, porque, embora apresente alta sensibilidade, este
teste é limitado pela reação cruzada com Mycoplasma flocculare.
O método de isolamento do M. hyopneumoniae, a partir de tecido
pulmonar, permite identificar o agente em um processo rápido de aproximadamente

67 h, porém, a presença de M. hyorhinis pode gerar um resultado falso positivo.
Como complemento a esta técnica é realizado um PCR multiplex seguido de Nested
PCR para diferenciar M. hyopneumoniae de M. hyorhinis (LIN et al., 2006).
Em animais com baixo nível de contaminação o Nested PCR tem sido uma
boa alternativa para detectar a presença do agente da PES (Referência). Cada
procedimento possui uma parcela de precisão e subjetividade, sendo necessário
combinar métodos para uma determinação segura do diagnóstico, a fim de se evitar
resultado inconclusivo e controverso.
1.6 Controle da Pneumonia Enzoótica Suína
Tradicionalmente, o controle da infecção causada pelo M. hyopneumoniae é
realizado através do uso de antibióticos. Porém, a crescente prevalência de cepas
resistentes tem aumentado o risco de reinfecção (CHEN et al., 2003), e além deste
tratamento ter custo elevado, dificilmente elimina a pneumonia enzoótica do rebanho
e os resíduos do medicamento podem ainda comprometer a carne suína.
A vacinação é mais efetiva para erradicar ou controlar a infecção, que o uso
de antibióticos (CONCEIÇÃO et al., 2006). Atualmente, o mercado dispõe de vacinas
compostas pelo microrganismo inativado (bacterinas). Sua produção apresenta
elevado custo devido à dificuldade de cultivar o M. hyopneumoniae, que cresce
pouco e lentamente em meios enriquecidos, fato este, que torna a vacina contra a
PES o medicamento de maior custo da suinocultura, além de promover apenas
proteção parcial. Estes fatos despertam o interesse por vacinas desenvolvidas
através da tecnologia de DNA recombinante, uma vez que o cultivo do agente em
larga escala não é requerido.
1.7 Vacinas recombinantes
O progresso obtido na pesquisa na área imonológica, bioquímica e da biologia
molecular, tem disponibilizado novas estratégias para a obtenção e produção de
vacinas (ADA, RAMSHAW, 2003). As vacinas de segunda geração são baseadas
em uma seleção racional do antígeno a ser produzido via tecnologia do DNA
recombinante.
Dominantes até a década de 70, as vacinas de primeira geração, baseadas
principalmente em células inteiras dos patógenos mortos ou atenuados, vem sendo
substituídas gradualmente pelas vacinas da nova geração (LUPI, 2003).

As vacinas recombinantes podem ser de três tipos: (1) vacinas de DNA,
contém genes ou fragmentos de genes relacionados à virulência ou patogenicidade
de agentes infecciosos, inseridos em um pequeno DNA circular (plasmídeo) que, ao
ser introduzido no organismo, utilizam o maquinário celular deste para codificar
essas proteínas e promover a imunização; (2) vacinas vetorizadas, onde organismos
como bactérias e vírus carream genes do patógeno e expressam estes genes dentro
do hospedeiro; (3) vacinas de subunidade, que são compostas por proteínas,
frações de proteínas ou proteínas combinadas de um patógeno, produzidas em um
sistema heterólogo de expressão (KREUZER; MASSEY, 2002).
1.8 Vacinas de subunidade e sistemas de expressão heteróloga
Vacinas recombinantes de subunidade utilizam apenas a porção antigênica
do patógeno, não apresentando risco infeccioso. Obtidas por sistemas heterólogos
de expressão, onde são produzidas elevadas quantidades de proteínas à um menor
custo, em substituição às dispendiosas purificações convencionais (HOCKNEY,
1994).
A vacina contra o vírus da hepatite B é um exemplo de vacina recombinante
de subundade disponível no mercado, anteriormente obtida através da purificação
do plasma humano, teve o gene HBs foi inserido em um plasmídeo e expresso em
levedura (Saccharomyces cerevisae), com grande rendimento. Diferente das vacinas
compostas por microrganismos inativados ou mortos que expõe o sistema a
inúmeras moléculas não conhecidas, a vacina de subunidade é composta por
partículas não infecciosas, não sendo observado nenhum efeito colateral. Esta pode
ser administrada em pessoas imunossuprimidas e mulheres grávidas, sem risco e
com eficiência.
A segurança das vacinas recombinantes de subunidade fez com que esta
fosse o único tipo de vacina recombinante a conseguir a licença pelos orgãos de
regulação competentes. A produção destes antígenos pode ser realizada em vários
sistemas heterólogos de expressão mediados tanto por organismos procariotos
como eucariotos. As vantagens e desvantagens apresentadas por esses sistemas
devem ser levadas em consideração para cada antígeno a ser expresso.
A expressão de proteínas em E. Coli, apesar de não realizar modificações
pós traducionais, apresenta fácil crescimento, possui várias cepas com genótipo
conhecido, vários plasmídeos comerciais disponíveis em processo de baixo custo.

Estas muitas vantagens de E. coli tem mantido-a como um microorganismo
importante para a produção de proteínas recombinantes (MAKRIDES, 1996).
1.9 Proteínas de choque térmico (HSPs)
Em resposta às súbitas mudanças das condições ambientais, muitos
organismos apresentam um aumento imediato na síntese de um pequeno grupo de
proteínas que preservam as funções celulares, estas proteínas são denominadas
proteínas de choque térmico (Heat Shock Proteíns - HSP), sendo assim chamadas
porque foram primeiramente observadas após um estresse térmico (SCHERM et al,
2002). As HSPs podem ser classificadas em seis famílias de acordo com o seu peso
molecular aparente: HSP100, HSP90, HSP70, HSP60, HSP40 e HSP10 (VAN
EDEN, 2005).
Encontradas em todos os procariotos e eucariotos, as HSPs são proteínas
altamente conservadas, destacando-se as famílias HSP60 e HSP70. As HSPs
podem ser encontradas na porção cistólita, na parede celular ou como proteína
exportada (GULLO, TEOH, 2004). Têm por função a modulação da atividade
protéica por alteração de conformação, promovendo agrupamento/desagrupamento
de complexos multiprotéicos, regulando a degradação de proteínas no percurso do
proteossoma e facilitando a translocação de proteínas por membranas (TAKAYAMA
et al., 2003).
Em condições de estresse celular o aumento da síntese das HSPs é
justificado pela maior concentração de proteínas expressas ainda não enoveladas
ou desnaturadas, geradas em resposta ao estresse sofrido, de modo que sua
atuação confere resistência ao dano celular e a apoptose. O estresse enfrentado
pelas bactérias patogênicas durante o processo de colonização do hospedeiro e
instalação da doença, desencadeia a expressão de HPS em altos níveis (MADSEN
et al., 2006).
A resposta imunológica de hospedeiros contra Borrelia burgdorferi, Chlamidia
trachomatis, Helicobacter pylori, Mycobacterium leprae, M. tuberculosis, Yersinia
enterocolitica, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii, Plasmodium falciparum,
Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes entre outros, está associada ao
reconhecimento de HSPs destes patógenos (RAŠKA, WEIGL, 2005). Importantes
imunógenos da infecção, as HSPs são antígenos adequados para a utilização em
novas vacinas (RAŠKA, WEIGL, 2005; VAN EDEN, 2005).

1.10 DnaK (HSP70) como antígeno vacinal
Tanto HSP70 quanto HSP60 são antígenos imunodominantes em uma grande
variedade de bactérias patogênicas. Em Mycoplasma fermentans, M. genitalium e M.
pneumoniae foi detectada a expressão da HSP60 em resposta ao estresse térmico.
Porém, em M. hyopneumoniae o gene codificador para HSP60 está ausente no
genoma, sendo sua atividade atribuída ao complexo DnaK-DnaJ-GrpR (MINION et
al., 2004).
A DnaK foi identificada como a proteína mais expressa pelo M.
hyopneumoniae durante o estresse térmico. Pertencente a família HSP70, possui
atividade de chaperona, enovelando proteínas a partir do dobramento correto das
cadeias polipeptídicas, assim que estas emergem do ribossomo, se ligando aos
resíduos hidrofóbicos expostos na conformação inadequada da estrutura protéica.
Estas atividades são realizadas juntamente com as co-chaperonas DnaJ e GrpR e
utiliza energia obtida pela hidrólise do ATP (MINION et al., 2004 e MADSEN et al.,
2006; WALKER et al., 2007).
Analisando as seqüências dos genomas de M. hyopneumoniae cepas J, 7448
e 232, FERRREIRA & CASTRO (2007), designaram a proteína DnaK como um fator
de virulência. Atribuíram-na as seguintes características: (i) provavelmente
localizada na membrana ou secretada, (ii) relacionada ao estresse ambiental, (iii)
ortóloga a fatores de virulência bacterianos anteriormente descritos e (iv) identificada
como possível componente de patogenicidade ou mecanismos relacionados. Sendo
assim, a DnaK (HSP70) de M. hyopneumoniae mostra-se uma candidata potencial
para o desenvolvimento de uma nova vacina contra a pneumonia enzoótica suína.

2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
- Produzir a porção C-terminal da DnaK através de um sistema de
expressão heterólogo em E. coli e avaliar seu potencial imunogênico e
antigênico.
2.2 Objetivo específico
- Construir um vetor de expressão em procarioto contendo a região C-
terminal do gene dnaK;
- Expressar a proteína recombinante em 5 diferentes cepas de E. coli
BL21(DE3) (pLysS, Codon Plus RP, DE3, Star e SI), e selecionar
aquela que apresentar melhor desempenho para realizar a produção;
- Purificar a rC-DnaK;
- Inocular camundongos com a proteína recombinante e monitorar a
resposta imune humoral específica por ELISA;
- Avaliar a antigenicidade da proteína recombinante através de Western
blot utilizando soro de suínos imunizados contra a PES e de suínos
infectados com M. hyopneumoniae.

3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Cepa e extração de DNA
M. hyopneumoniae cepa 7448 (VASCONCELOS et al., 2005) foi cedido pelo
Cbiot/UFRGS, na forma de pellet. Para extração do DNA genômico foi utilizado
GFX Genomic Blood DNA Purification Kit (Amersham Biosciences, UK), segundo
especificações do fabricante.
3.2 Desenho dos primers
A análise do gene dnaK para desenho dos primers foi realizada a partir da
seqüência do genoma do M. hyopneumoniae, cepa 7448, disponível no GenBank®,
número de acesso NC_007332, utilizando o programa Vector NTI 8.0 (Informax). Os
primers foram desenhados para amplificar a maior região em pares de bases (pb) de
propriedade hidrofílica e com ausência de códons TGAs. Ao primer forward foi
adicionado o sítio para a enzima de restrição BamHI
(CGGGATCCATTACAACGGTTTCAGCAAAAG) e ao primer reverse o sítio para a
enzima HindIII (CCAAGCTTTTAATCCTGCTTGATTTCAGCA).
3.3 Reação em cadeia da polimerase (PCR)
A reação de PCR foi realizada para um volume final de 25 µL contendo 200
µM de cada dNTP, 2,0 mM MgCl 2 , 10% de Tampão 10x, 0,4 pmol de cada primer
(MWG Biotech, USA), 50 ng de DNA genômico e 1U da enzima Taq DNA polimerase
recombinante (Invitrogen).
A reação foi realizada em termociclador Mastercycler Gradient (Eppendorf)
sendo submetida às etapas de desnaturação inicial, a 94°C por 2 min, seguida de 30
ciclos de desnaturação, a 94°C por 1 min, hibridização em quatro temperaturas
diferentes 45/50/55/60°C por 1 min, extensão a 72°C por 1,5 min e, ao término dos
ciclos, a reação foi submetida a uma extensão final de 72°C por 7 min.
A amplificação foi checada em gel de agarose 1%, aplicando-se 4 ?L do
produto de PCR e 2 ?L de 6X tampão de amostra (0,25% azul de bromofenol, 40%
glicerol). A eletroforese foi realizada em cuba horizontal (BioRad) com tampão TBE
0,5X pH 8,3 (45 mM Tris, 45 mM ácido bórico, 1 mM EDTA) à 140V por 30 minutos e

visualizada em um translaminador UV. O gel foi fotografado com câmera digital
Olympus Camedia C-4000 zoom.
3.4 Clonagem e expressão da proteína recombinante
A ligação do gene foi realizada mediante modificações do protocolo descrito
por SAMBROOK, RUSSEL (2001). A região amplificada foi ligada ao vetor pAE
(RAMOS et al., 2004), derivado de um vetor comercial pRSETA-Invitrogen, que
possui as seguintes características: origem de replicação em E. coli, sítio de múltipla
clonagem, gene de resistência ao antibiótico ampicilina, operador lac e promotor do
fago T7, que possui a vantagem de induzir a transcrição pela T7 RNApol que
apresenta alta especificidade a sua região promotora, não promovendo a expressão
de proteínas da célula bacteriana, além disso, este vetor acrescenta à proteína
recombinante seis resíduos de histidina na porção N-terminal, como estratégia para
purificação da proteína recombinante em coluna de cromatografia de afinidade.
O produto de PCR, purificado utilizando o GFX TM
PCR DNA and Gel Band
Purification Kit, seguindo orientações do fabricante (Amersham Biosciences) e o
plasmídeo, foram digeridos em uma reação contendo cinqüenta microlitros de DNA,
1 µL da enzima HindIII, 4 µL de água, 6µL de 10x tampão de reação e incubadas em
banho-maria a 37°C overnight. Após, a digestão foi submetida à temperatura de
65°C por 20 min, para inativação da enzima.
Uma nova reação de digestão, agora com a enzima BamHI, foi realizada,
onde foram acrescidos 1 µL da enzima, 7µL do 10x tampão de reação e 2 µL de
água, e incubados em banho-maria por uma hora.
O vetor foi tratado com fosfatase alcalina (CIP) (Boehringer Mannheim) para
evitar a recircularização. O plasmídeo cipado e o inserto foram purificados com
GFX TM
PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences) e
quantificados por comparação com o marcador 1Kb DNA ladder (Invitrogen) à 50
ng/µL em gel de agarose 1%.
A reação de ligação foi realizada mediante relação equimolar 3:1, entre
inserto e vetor, na presença da enzima T4 DNA ligase (Invitrogen) a 8°C, overnight.
Um microlitro do produto da ligação foi adicionado a uma alíquota de 50 µL de
células E. coli TOP10 (Tabela 1) eletrocompetentes. Esta mistura foi homogeneizada
e transferida para uma cubeta de eletroporação (BioRad Laboratories) resfriada e

submetida a 25 µFD de capacitância, 200 Ohms de resistência e a 2,5 kV de
voltagem em um eletroporador (Bio-Rad Laboratories). Imediatamente após a
eletroporação, 450 µL do caldo Luria-Bertani (LB) foram adicionados as células,
estas foram mantidas a 37°C sob agitação de 220 rpm por 1 h. Transcorrido este
tempo, o produto da transformação foi semeado em ágar LB, acrescido de 100
µg/mL de ampicilina e mantido em estufa a 37°C, overnight.
Algumas colônias foram submetidas a uma triagem rápida utilizando o
protocolo Microprep (JOUGLARD et al., 2002), para identificação dos clones
recombinantes. Os prováveis recombinantes foram cultivados em caldo LB,
contendo 100 µg/mL de ampicilina, à 37°C sob agitação de 220 rpm, overnight,
estes tiveram seu DNA extraído, e foram submetidos a uma digestão com as
mesmas enzimas de restrição utilizadas na clonagem.
Tabela 1– Características da cepa bacteriana de clonagem E. coli TOP10.
E. coli TOP 10
Cepa Genótipo Referência
F - mcrA ?(mrr-hsdRMS-
mcrBC) f 80lacZ?M15
?lacX74 recA1 ara ?139
?(araleu) 7697 galU galK
rpsL (Str R ) endA1 nupG
Grant et al., 1990
Casadaban, Cohen, 1980
O gene clonado foi verificado integridade do gene clonado foi verificado
mediante seqüenciamento automático de DNA por eletroforese capilar utilizando di-
deoxi-nucleotídeos marcados em um seqüenciador MegaBACE 500 (Amershan
Biosciences), a seqüência gerada foi analisada utilizando os seguintes programas de
bioinformática: ContigExpress (Informax Inc) e Basic Local Alignment Search Tool
(BLAST), localizados no National Center for Biotechnology Information (NCBI)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
O plasmídeo recombinante foi denominado pAE/C-dnaK sendo transformado
nas cepas de expressão de E. coli subtipos BL21 (DE3) pLysS, BL21 (DE3), BL21
(DE3) Star, BL21 (DE3) Codon Plus RP e BL21 (DE3) SI, sendo as primeiras
cultivadas em 10 mL de caldo LB contendo 100 µg/mL de ampicilina, em agitador
orbital a 250 rpm a 37°C e a última em ausência de sal. Após atingir densidade ótica

a 600 nm (OD 600 ) entre 0,5 e 0,7, uma amostra foi coletada para servir como controle
não induzido. Em seguida foi adicionado 300 mM de NaCl na cepa SI e 1 mM de
IPTG nas demais cepas para induzir a expressão da proteína heteróloga. O cultivo
foi mantido ainda por três horas sob agitação e ao final uma amostra foi retirada para
observação. As amostras não-induzidas e induzidas dos cultivos foram processadas
e submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida segundo metodologia descrita
por Sambrook & Russel (2001).
3.5 Teste de solubilidade
O pellet de 4 mL do cultivo induzido por 2 h, foi ressuspendido em 1 mL do
tampão PBS 1x, sonicado em 3 ciclos (3 x de 10 s, à 20 kHz), tendo uma alíquota de
500 µL separada e centrifugada por 2 minutos a 14000 rpm. Ao pellet formado foram
adicionados 40 µL de tampão de amostra SDS 5x, 160 µL de TE 1x pH 8,0 (10 mM
tris; 1 mM EDTA) e ao sobrenadante (40 µL) foram acrescidos 10 µL de tampão de
amostra SDS 5x, sendo aplicados no gel de poliacrilamida 15% uma amostra de 5
µL do pellet e 15 µL do sobrenadante. Como controle foram aplicado 4 µL do cultivo
induzido acrescido de 1 µL de tampão de amostra SDS 5x.
3.6 Purificação da proteína recombinante C-DnaK
Um cultivo de E.coli BL21 (DE3) pLysS pAE/C-dnaK em 5 mL de caldo LB
contendo 100 µg/mL de ampicilina crescido em agitador orbital a 250 rpm a 37°C,
overnight, foi expandido para um volume de 500 mL de caldo LB. Ao atingir a
densidade ótica a 600 nm (OD 600 ), uma amostra do cultivo não induzido foi coletada
para servir como controle. Em seguida foi adicionado 1 mM de IPTG e, ao final de 3
h foi coletada uma alíquota para análise.
O cultivo induzido foi centrifugado a 4°C, 7000 rpm por 30 minutos, tendo seu
pellet congelado overnight e posteriormente ressuspendido em 60 mL de solução de
lavagem (200 mM NaH2PO4; 500 mM NaCl; 5 mM imidazol; pH 8,0) sob agitação, à
4°C por 2 h. Em seguida o material foi sonicado em 3 ciclos (3 x de 10 s, à 20 kHz),
filtrado em filtro 0,8 µm (Millipore) e submetido ao processo de purificação.
A proteína recombinante foi purificada mediante um processo de
cromatografia de afinidade através de uma coluna de Ni 2+ -Sepharose, a qual
promove a captura da proteína heteróloga através da ligação dos seis resíduos de

histidina adicionados à proteína recombinante pelo vetor utilizado, enquanto as
outras proteínas de E. coli ficam livres, sendo facilmente retiradas com a passagem
da solução de lavagem. A proteína recombinante é eluída da coluna quando
submetida a uma solução de eluição (200 mM NaH2PO4; 500 mM NaCl; 500 mM
Imidazol pH 8,0).
3.7 Diálise
Após a purificação a proteína recombinante foi dialisada em processo rápido,
sendo transferida para um saco de celulose (25 mm x 16 mm) (Sigma), que retém a
proteína ao mesmo tempo em que seus poros permitem a troca de íons e sais em
solução, o qual foi submerso em um becker contendo 1 L de PBS com 0,05% Triton
X–100 e mantido à 4°C sob agitação por 12 horas. A cada 3 h, 500 mL do PBS da
diálise era substituído por um novo PBS. A proteína dialisada foi armazenada a -
20°C com adição de glicerina 10%. A concentração da rC-DnaK foi determinada por
comparação com uma curva padrão de albumina sérica bovina (BSA) em gel de
poliacrilamida 15%.
3.8 Imunização dos camundongos
A proteína recombinante purificada foi utilizada na inoculação de
camundongos BALB/c fêmeas (Biotério Central, Universidade Federal de Pelotas,
RS, Brasil) de 5 a 7 semanas de idade. Os animais foram dispostos em três grupos
de cinco animais cada, sendo os grupos: (1) imunizados com a proteína
recombinante C-DnaK, (2) vacinados com a bacterina comercial (RespiSure ®
)
(controle positivo) e (3) administrados com PBS 1x acrescido de 15% de hidróxido
de alumínio [PBS/Al(OH)3] (controle negativo). Foram inoculadas duas doses, por via
intramuscular (IM), distantes em 21 dias.
Cada dose da vacina de subunidade foi administrada na concentração de 50
µg, juntamente com 15% do adjuvante Al(OH)3 e um volume de 100 µL da bacterina
e 100 µL PBS 1x/Al(OH)3 foram aplicados em cada animal dos grupos controles. As
coletas de sangue foram realizadas no dia 0 (zero), 21, 42, 63, 84, 105 e 112 dias,
sendo o sangue obtido via plexo venoso retro-ocular.

Para obtenção do soro, o sangue foi estocado a 37°C por 1 h, seguido de
uma outra incubação à 4°C por 1 h e posteriormente realizada uma centrifugação
por 10 min a 4000 rpm. O soro foi separado e estocado a -20°C até sua utilização.
3.9 Avaliação da resposta imune humoral
A resposta humoral foi monitorada por ELISA indireto a partir do pool dos
soros de cada grupo. Um ensaio preliminar foi realizado para identificar as
concentrações mais adequadas de antígeno, soro e anticorpo conjugado a serem
usados no teste.
O protocolo estabelecido foi o seguinte: sensibilizar a placa de microtitulação
(Cral) adicionando 5 µg/mL da proteína recombinante diluída em 50 mM tampão
carbonato bicarbonato (pH 9,8) a 4°C, overnight. Adicionar 200 µL de BSA 0,5%,
incubado a 37°C por 1 h. Incubar o soro (diluído 1:50 em PBS-T 1x) a 37°C por 1 h.
Adicionar o conjugado IgG anti-mouse para peroxidase (Sigma Aldrich) diluído em
PBS-T 1x 1:2000, a 37°C por 1 h. Entre cada etapas a placa foi lavada 3 vezes com
PBS-T 1x por 1 min. Posteriormente foi acrescido 100 µL de solução de enzima
substrato/cromógeno (H2O2/ortophenylenediamine) em tampão citrato-fosfato pH 4,0
e armazenado durante 15 min a temperatura ambiente em local com ausência de
luz. A leitura foi realizada em leitor de ELISA Multiskan MCC/340 (Titertek) filtro 450
nm. Os testes foram realizados para cada amostra em duplicata.
3.10 Avaliação da antigenicidade da rC-DnaK por Western e dot blot
Uma amostra da proteína recombinante foi submetida a 15% SDS-PAGE
utilizando o sistema de mini gel (BioRad). Após a corrida, o gel de policrilamida foi
sobreposto a uma membrana de nitrocelulose (GE Healthcare), estes foram
acoplados a um ”Bio-Rad Trans-Blot cell”, submerso em tampão de transferência e
mantidos a 150 V, 400 mA, por 1 h, para eletrotransferir a proteína recombinante
para a membrana.
Posteriormente, a membrana foi bloqueada com PBS-T 1x acrescido de 5%
de caseína, overnight a 4°C. Após o bloqueio, a membrana foi lavada com PBS-T 1x
(3x de 5 min por lavagem) e incubada individualmente com soro 1:100 dos animais
imunizados, livres de patógenos ou acometidos pela Pneumonia Enzoótica, por 1 h a
temperatura ambiente,o anticorpo anti-Pig IgG conjugado com peroxidase (Sigma
Aldrich) diluido 1:2000 foi adicionado a membrana e incubado por 1 h. Para reduzir o

ackground, os soros foram previamente adsorvidos com extrato de E. coli antes de
serem utilizados. O soro de animais livre de patógenos foi utilizado como controle
negativo e o extrato de M. hyopneumoniae cepa 7448 como controle positivo.
As bandas de imunoreação da proteína foram detectadas com 0,005% (peso /
vol) 4-cloro-1-naftol-0,015% (vol / vol) hidrogênio peroxidase em PBS 1x.
Um dot blot foi realizado para avaliar a interação do soro dos animais
infectados com a proteína recombinante com seus epítopos conformacionais
mantidos.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Seleção da região C-temrinal do gene dnaK
A análise do gene dnaK com auxilio do programa Vector NTI 8.0 demonstrou
que sua região C-terminal (C-dnaK) apresentava o maior fragmento (441 pb)
desprovido de códon TGA. Este códon é utilizado pelos micoplasmas para codificar
o aminoácido triptofano, enquanto que outros organismos, podem o reconhecer
como códon de terminação da tradução. Além disso, analise apontou que este
fragmento era hidrofílico, característica esta que tende a facilitar o processo de
purificação e sua manutenção na forma solúvel.
Portanto, a seqüência de 441 pb que codifica do aminoácido 455 ao 601 do
gene dnaK atendeu satisfatoriamente aos critérios, sendo escolhida para o
desenvolvimento do estudo.
4.2 Construção do vetor pAE/C-dnaK
Para otimizar a reação de PCR foram testadas as seguintes temperaturas de
anelamento 45, 50, 55 e 60°C. Na Figura 1 pode ser visualizado a amplificação do
C-dnaK nestas diferentes temperaturas, demonstrando que mesmo frente a uma
variação de 15°C, os primers anelaram com a mesma especificidade, mantendo
homogêneo o rendimento das reações.
Figura 1 – Gel de agarose demonstrando a amplificação do C-dnaK utilizando
diferentes temperaturas de anelamento dos primers. Coluna 1 - 1 kb DNA ladder;
colunas 2-5 – produto de PCR usando as temperaturas de anelamento: 45°C, 50°C,
55°C e 60°C, respectivamente.
O gene de interesse foi clonado com sucesso no vetor pAE. Na Figura 2 está
representado o mapa do vetor construído.
M 1 2 3 4
506 pb 457 pb

pUC ori
AmpR
pAE/C-dnaK
3237 bp
pT7
6x His
Bam HI (137)
dnaK - HSP 70
HindIII (584)
Figura 2 - Mapa do vetor pAE/C-dnaK gerado pelo programa Vector NTI 8.0
(Informax).
As colônias obtidas a partir da clonagem do plasmídeo pAE/C-dnaK em E.
coli, foram submetidas a uma triagem rápida. O perfil de bandas dos plasmídeos dos
clones recombinantes obtidos pela transformação, foram observados e comparados
ao padrão de bandas do vetor pAE. Os clones recombinantes deverão apresentar
uma banda maior que a do controle, uma vez que, além do vetor pAE, os clones
recombinantes possuem o C-dnaK inserido. Na Figura 3, o resultado da triagem
pode ser visualizado.
Figura 3 – Triagem dos clones recombinantes em gel de agarose 1%. Coluna 1,
pAE; coluna 2-11, plasmídeos provenientes da clonagem do pAE/C-dnaK em E. coli.
Os plasmídeos das colunas 2, 3, 5, 6, 8 e 10 apresentaram o padrão
esperado para clones recombinantes. Estes foram submetidos à digestão com as
mesmas enzimas utilizadas na clonagem, de modo que os plasmídeos
f1 ori
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

ecombinantes liberaram dois fragmentos, um de 447 pb e outro de 2790 pb,
referentes, respectivamente, ao inserto e ao vetor. Na Figura 4 observamos que
todos os plasmídeos analisados eram recombinantes.
Figura 4 – Gel de agarose 1% para confirmação dos clones recombinantes. Coluna
1, 1 kb DNA ladder; coluna 2- 7 clones recombinantes liberando o padrão esperado
(447 pb e 2790 pb).
A integridade da região gênica clonada foi verificada comparando o produto
do seqüenciamento do plasmídeo recombinante construído com a seqüência da C-
dnaK do M. hyopneumoniae (7448) disponível no GenBanK®. A análise feita
utilizando os programas de bioinformática ContigExpress (Informax) e Basic Local
Alignment Search Tool (BLAST) demonstrou identidade de 100% entre as
seqüências.
3054 pb
506 pb
1 2 3 4 5 6 7
4.3 Avaliação da expressão da rC-DnaK em diferentes cepas de E. coli
O vetor pAE/C-dnaK foi clonado nas cepas de expressão de E. coli BL21
(DE3) subtipos pLysS, BL21 (DE3), BL21 (DE3) Star, BL21 (DE3) Codon Plus RP e
BL21 (DE3) SI, demonstrando uma maior produção da proteína rC-DnaK (17.9 kDa)
nos subtipos pLysS, DE3 e Codon Plus (dados não mostrados). De acordo com
estes resultados a cepa escolhida para continuar o processo de produção da
proteína recombinante foi a cepa pLysS, pois apresentou, além da alta produção de
proteína, um controle na regulação da expressão mais efetivo.
4.4 Determinação da solubilidade da proteína recombinante
2790 pb
447 pb
Células bacterianas induzidas a produzir a rC-DnaK foram lisadas e
centrifugadas, permanecendo no sobrenadante as proteínas solúveis (hidrofílicas) e

no pellet aquelas insolúveis (hidrofóbicas). Uma amostra do sedimento e do
sobrenadante foram submetidos à eletroforese em gel de policrilamida 15%, onde foi
possível verificar que a proteína rC-DnaK de 17.9 kDa é expressa na forma solúvel,
uma vez que esta encontra-se presente no sobrenadante e não no pellet, conforme
podemos visualizar na Figura 5.
Figura 5 – Teste de solubilidade da proteína rC-DnaK, em SDS-PAGE 15% corado
com Comassie Blue. Coluna 1, Marcador de Massa Molecular; coluna 2, cultivo de
E.coli BL21 (DE3) pAE/C-dnaK induzido; coluna 3, amostra do pellet do cultivo E.coli
BL21 (DE3) pAE/C-dnaK induzido; coluna 4, amostra do sobrenadante do cultivo
E.coli BL21 (DE3) pAE/C-dnaK induzido.
4.5 Purificação e quantificação da rC-DnaK
Devido ao seu caráter hidrofílico e ausência de corpúsculos de inclusão
demonstrado no teste de solubilidade, adotou-se um protocolo de purificação para
proteínas solúveis. Na Figura 6 é possível visualizar a proteína recombinante
purificada.
40 kDa
31 kDa
20 kDa
14 kDa
40 kDa
31 kDa
25 kDa
14 kDa
1 2 3 4
17.9 kDa
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
17.9 kDa

Figura 6 – Purificação da proteína rC-DnaK em gel de Policrilamida 15% corado
com Comassie Blue. Coluna 1, Marcador de Massa Molecular; coluna 2 – 10,
frações eluídas da coluna de cromatografia.
As frações que apresentaram maior quantidade de proteína (Figura 6; colunas
6, 7 e 8) foram misturadas e dialisadas. A concentração da rC-DnaK foi determinada
por comparação a uma curva padrão de BSA (Figura 7) que demonstrou que esta
estava na concentração de aproximadamente 1,0 mg/mL. A quantidade obtida foi
suficiente para realizar a inoculação dos camundongos e para utilização nos teste de
caracterização imunológica.
Figura 7 – Quantificação da proteína recombinante utilizando curva padrão de BSA,
em SDS-PAGE 15% corado com Comassie Blue. Coluna 1-5, BSA nas
concentrações 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 e 4,0 µg respectivamente; coluna 6, 10 µL da rC-
DnaK dialisada.
4.6 Resposta imune humoral induzida pela vacina recombinante de
subunidade
A inoculação da proteína rC-DnaK em duas doses de 50 µg cada foi capaz
de induzir uma resposta imune humoral nos animais. Vinte e um dias após a primeira
dose já foi possível observar por ELISA (Enzime-linked immunossorbent assay)
indireto, que o pool dos soros dos animais vacinados com a rC-DnaK apresentaram
maior imunogenicidade que o pool dos grupos controles. Apresentando valores
crescentes de absorbância, chegando a ser observado valor de 0,3184 no 112º dia.
Sendo, que o soro dos animais imunizados com a rC-DnaK, apresentaram
níveis de anticorpos em média duas vezes maior que os produzidos pela bacterina
comercial ao longo do experimento.
1 2 3 4 5 6
17.9 kDa

Quando testada a rC-DnaK contra o pool dos soro dos animais inoculados
com a bacterina, foi observado uma absorbância média de 0,133, indicando haver
produção de anticorpos contra a rC-DnaK na presença do M. hyopneumoniae.
Absorbância
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0 21 42 63 84 105 112
Dias
rC-DnaK
Bacterina
PBS/Al(OH)3
Figura 8 – Resposta imune humoral determinada a partir do pool dos soros dos
animais inoculados com a rC-DnaK, PBS/Al(OH) 3 e bacterina, por ELISA indireto. A
medida das respostas imunes está expressa em absorbância.
4.7 Reconhecimento da proteína recombinante pelo soro de suínos
imunizados contra a PES e suínos naturalmente infectados pelo M.
hyopneumoniae
Houve forte reconhecimento da rC-DnaK pelo soro hiperimune, porém
algumas bandas inespecíficas foram observadas (Figura 9).

Figura 9 – Western blot confrontando o antígeno recombinante com o soro de
suínos imunizados contra a PES. Coluna 1, extrato de M. hyopneumoniae; coluna 2,
rC-DnaK.
No dot blot, a rC-DnaK foi reconhecida pelos 3 soros de suínos doentes
testados. Porém quando estes soros foram testados no Western blot somento 1 soro
foi capaz de reconhecer a proteína recombinante, como pode ser observado na
Figura 10, coluna 2.
1 2
1 2 3
17.9 kDa
Reconhecimento da
rC-DnaK
17.9 kDa
Figura 10 – Dot e Western blot confrontando o antígeno recombinante com o soro
de suínos naturalmente infectados pelo M. hyopneumoniae. Colunas 1-3, rC-DnaK,
sendo na porção superior com a conformação protéica mantida (dot blot) e na
porção inferior desnaturada (Western blot).
Estes resultados sugerem: (1) que a proteína DnaK é expressa pelo M.
hyopneumoniae durante o processo de infecção, (2) a presença de anticorpos
específicos contra rC-DnaK pode contribuir para a proteção do suíno contra a PES.

5 CONCLUSÃO
- Foi possível construir um vetor de expressão em procarioto, contendo a
região C-terminal do gene dnaK;
- O antígeno recombinante foi expresso em diferentes cepas de E. coli,
sendo que o subtipo BL21 (DE3) pLysS produziu a proteína em maior
quantidade e com controle de expressão mais efetivo;
- Foi possível purificar a proteína rC-DnaK na forma solúvel, através da
cromatografia de afinidade;
- A inoculação da proteína rC-DnaK em duas doses de 50 µg cada foi
capaz de induzir uma resposta imune humoral nos camundongos;
- Após a primeira dose já os animais vacinados com a rC-DnaK
apresentaram maior imunogenicidade que os grupos controles;
- O soro dos animais imunizados com a rC-DnaK, apresentam níveis de
anticorpos em média duas vezes maior que os produzidos pela
bacterina comercial;
- Quando testada a rC-DnaK contra o soro dos animais inoculados com
a bacterina, foi observado uma absorbância média de 0,133, indicando
haver produção de anticorpos contra a rC-DnaK na presença do M.
hyopneumoniae;
- A rC-DnaK foi reconhecida pelo soro de animais naturalmente
infectados com o M. hyopneumoniae, sugerindo que esta proteína é
expressa durante a infecção;
- A reação ocorrida entre a proteína recombinante e o soro de animais
imunizados com a cepa patogênica de M. hyopneumoniae 7448,
sugere que anticorpos específicos para rC-DnaK são produzidos,
constituindo esta proteína como um alvo potencial para a utilização em
testes de desafio em suínos.

6 REFERÊNCIAS
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NETO, C.E.; NICOLÁS, M.F.; OLIVEIRA, S.C.; PAIXÃO, R.F.; PEDROSA, F.O.;
PENA, S.D.; PEREIRA, M.; PEREIRA-FERRARI, L.; PIFFER, I.; PINTO, L.S.;
POTRICH, D.P.; SALIM, A.C.; SANTOS, F.R.; SCHMITT, R.; SCHNEIDER, M.P.;
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