MECANISMOS DE INVASÃO E METÁSTASES
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<strong>MECANISMOS</strong> <strong>DE</strong> <strong>INVASÃO</strong> E <strong>METÁSTASES</strong><br />
Fabiana Henriques Machado de Melo, Mara de Souza Junqueira<br />
e Roger Chammas<br />
Cânceres são doenças genéticas, resultantes de mutações acumuladas no<br />
genoma. Estas mutações estão associadas ao descontrole de programas<br />
essenciais como proliferação, morte e diferenciação celular. Acredita-se que o<br />
genoma das células transformadas seja instável e desta instabilidade resulte a<br />
aquisição acumulativa de mutações que podem converter uma célula normal em<br />
uma célula cancerosa. Hanahan e Weinberg agruparam as capacidades<br />
adquiridas por uma célula cancerosa em 6 classes de alterações que interferem<br />
com a fisiologia normal de células e tecidos : (1) auto-suficiência quanto a fatores<br />
de crescimento; (2) insensibilidade a fatores inibitórios de proliferação; (3) evasão<br />
da apoptose ou morte celular programada; (4) potencial replicativo infinito; (5)<br />
angiogênese sustentada; e, (6) invasão tecidual e metástase.<br />
No processo de carcinogênese, como classicamente definido e discutido<br />
em outros capítulos deste livro, é frequentemente ao longo da fase de progressão<br />
tumoral, que algumas células adquirem um fenótipo mais agressivo, invadindo<br />
tecidos adjacentes e formando metástases à distância. Na tentativa de se definir<br />
melhor o fenótipo metastático, comparam-se as células metastáticas e as células<br />
não-metastáticas. As células metastáticas frequentemente apresentam moléculas<br />
diferentemente expressas qualitativa e/ou quantitativamente. Estas moléculas têm<br />
sido identificadas como possíveis marcadores de progressão tumoral, e são<br />
1
utilizadas para exploração da fisiopatologia da disseminação metastática dos<br />
tumores. Algumas moléculas têm sua expressão diminuída ou mesmo abolida nas<br />
células metastáticas. A identificação destes genes supressores de metástases e a<br />
caracterização de seu mecanismo de ação também têm recebido a atenção de<br />
diferentes grupos de pesquisa.<br />
A metástase é um processo complexo, constituído de várias etapas, e que<br />
resulta das interações entre as células tumorais e o microambiente tecidual onde<br />
estas células se encontram. Durante a disseminação de um tumor, as células<br />
tumorais devem ser capazes de se soltar do tumor primário (perda da interação<br />
célula-célula) e escapar do tecido de origem; invadir a matriz extracelular, migrar<br />
ativamente pelo estroma intersticial; induzir a formação de novos vasos<br />
sanguíneos e/ou linfáticos (angiogênese), essenciais para a expansão da massa<br />
tumoral; por estes mesmos vasos, as células tumorais podem alcançar a corrente<br />
sanguínea ou linfática, após atravessar a membrana basal e o endotélio dos vasos<br />
(intravasão), sobreviver na circulação, interagir com o endotélio vascular,<br />
extravasar e, ainda, proliferar no parênquima do órgão-alvo (Figura 1). O processo<br />
de angiogênese é crítico para a expansão das células do tumor primário e dos<br />
focos metastáticos. Ao longo deste processo, as células tumorais interagem com<br />
diversos elementos do hospedeiro, que ora atuam facilitando o processo de<br />
metastatização, ora atuam impedindo-o. A identificação de moléculas e genes que<br />
estão associados ao processo metastático e a elucidação de seu papel neste<br />
processo são importantes para a exploração de novos métodos para o diagnóstico<br />
precoce, avaliação prognóstica e padronização de novas estratégias terapêuticas.<br />
2
Em tese, estas informações serão úteis para o controle clínico da ocorrência de<br />
metástases, que é a causa da morte de 2 a cada 3 pacientes com câncer.<br />
Neste capítulo, discutiremos as bases moleculares das principais etapas do<br />
processo de disseminação tumoral, dando ênfase às perspectivas de intervenção,<br />
ainda em fase de avaliação nos diversos centros de pesquisa sobre câncer. A<br />
maior parte das informações sobre os mecanismos fisiopatológicos da<br />
disseminação tumoral vem de estudos em carcinomas, que correspondem a cerca<br />
de 80% dos tumores em adultos. De maneira geral, a disseminação de outros<br />
tipos de tumores envolvem as mesmas grandes famílias de moléculas, como<br />
discutido a seguir; embora os membros destas famílias possam variar entre<br />
tumores de diferentes origens.<br />
Desorganização tecidual e microinvasão: o papel de E-caderina na<br />
organização de tecidos epiteliais<br />
As moléculas efetoras e reguladoras do processo de invasão tumoral são<br />
moléculas que têm papel importante em eventos fisiológicos, como a<br />
morfogênese, embriogênese e angiogênese. Porém, em contraste à invasão de<br />
células tumorais, a invasão de células normais é finamente regulada e cessa<br />
quando o estímulo é retirado.<br />
Para as células tumorais invadirem os tecidos adjacentes e formarem<br />
metástases à distância, elas devem ter a habilidade de formar interações<br />
transientes ora com as proteínas da matriz extracelular, ora com as outras células,<br />
como células do estroma, células endoteliais e plaquetas. Entre as moléculas de<br />
adesão célula-célula alteradas estão as caderinas e as CAMs (cell adhesion<br />
3
molecules), proteínas pertencentes à superfamília das imunoglobulinas; entre as<br />
moléculas que regulam as interações entre células e a matriz extracelular estão as<br />
integrinas.<br />
As caderinas são moléculas de adesão dependentes de Ca 2+ que medeiam<br />
a interação homotípica célula-célula, inicialmente identificadas nas junções<br />
aderentes (adherens junctions). As caderinas são uma superfamília de pelo menos<br />
30 diferentes moléculas, cuja expressão é controlada têmporo-espacialmente.<br />
A molécula de E-caderina, que é expressa por células epiteliais, é a que se<br />
encontra mais freqüentemente alterada em tumores. Diferentes estudos revelaram<br />
que a E-caderina é freqüentemente inativada durante o desenvolvimento de<br />
carcinomas humanos, incluindo carcinomas de mama, cólon, próstata, estômago,<br />
fígado, esôfago, pele, rim e pulmão e está associada à invasão e a formação de<br />
metástases em linfonodos e à distância. A inibição da função de E-caderina pode<br />
ocorrer por diversos mecanismos, entre eles mutação ou deleç ão do gene CDH1,<br />
rearranjo cromossômico ou hipermetilação. De fato, deleções ou hipermetilação da<br />
região 16q22, onde o gene da E-caderina se localiza, são freqüentes em<br />
carcinomas do trato gastro-intestinal humano. Alternativamente, descreve-se a<br />
perda da expressão de fatores de transcrição que freqüentemente coincidem com<br />
a supressão da atividade do promotor de E-caderina em carcinomas invasivos. Em<br />
modelos experimentais, a inibição da expressão de E-caderina em células de<br />
carcinoma, facilita a invasão tumoral, enquanto o reestabelecimento da expressão<br />
de E-caderina resulta em diminuição de proliferação e inibição de invasão e<br />
metástases. E-caderina é em parte responsável pelo fenômeno de inibição por<br />
contato, uma característica de células epiteliais normais, associadas ao bloqueio<br />
4
de proliferação quando células entram em contato umas com as outras. Esta<br />
característica é fundamental para a manutenção da arquitetura dos epitélios. Em<br />
modelos animais, a perda funcional de E-caderina está associada à aceleração da<br />
progressão tumoral, adenocarcinomas e lesões metastáticas aparecem mais<br />
precocemente em animais que não expressam E-caderinas funcionais. Estas<br />
propriedades de E-caderinas permitiram classificá-la como uma molécula<br />
supressora de metástases.<br />
A perda funcional de E-caderina também está associada ao<br />
desenvolvimento de melanomas, neoplasias malignas de melanócitos.<br />
Melanócitos encontram-se frequentemente na camada basal da epiderme, onde<br />
interagem com queratinócitos, formando a chamada unidade de pigmentaç ão da<br />
pele. A perda de expressão de E-caderina parece ser um passo crítico na<br />
progressão de melanomas, permitindo que as células tumorais sejam liberadas da<br />
epiderme e invadam a derme. Ao deixar de expressar E-caderina, as células de<br />
melanoma passam a expressar altos níveis de N-caderina, potencializando as<br />
interações com fibroblastos e células endoteliais que também expressam N-<br />
caderina. Esta mudança no padrão de expressão de caderinas ocorre durante a<br />
progressão tumoral e já foi documentada in vitro e in vivo. Este fenômeno tem sido<br />
observado em outros tipos de cânceres humanos, como carcinoma de próstata,<br />
carcinoma de tireóide e linfomas de células T. Resultados experimentais<br />
mostraram que essa alteração no padrão de expressão das caderinas pode ter<br />
papel importante nas interações entre células tumorais e células do hospedeiro, na<br />
migração, invasão tecidual e regulação da expressão gênica. A expressão de N-<br />
caderina em células de carcinoma de mama está correlacionada com aumento da<br />
5
motilidade e invasão, sugerindo que a N-caderina potencialize a interação entre as<br />
células tumorais e as células do estroma.<br />
Inicialmente, pensava-se que a E-caderina poderia ter um papel na<br />
supressão da progressão tumoral por inibir a invasão e metástase, conferindo às<br />
células uma maior capacidade de interação com as células adjacentes. Porém,<br />
mais recentemente foi mostrado que, além de seu papel como supressor de<br />
metástases, a perda de E-caderina também pode contribuir para a ocorrência de<br />
eventos da carcinogênese, como a perda do controle sobre o crescimento e<br />
proliferação celular. A porção citoplasmática da E-caderina interage com as<br />
moléculas de α e β-catenina, este último produto de um conhecido protooncogene.<br />
Além da β-catenina fazer parte do complexo de adesão de E-caderina, ela tem<br />
papel essencial como mediador da via de transdução de sinal de Wnt/Wingless<br />
(glicoproteína que exerce papel na embriogênese), que ativa os fatores de<br />
transcrição LEF/Tcf, que por sua vez controlam a transcrição de genes que<br />
codificam, por exemplo, ciclina D1, Myc e metaloproteinases.<br />
De maneira simplificada, o pool de β−catenina citoplasmática pode ser<br />
considerado um dos elementos reguladores da proliferação e invasão de células<br />
epiteliais. Quando há β−catenina livre no citoplasma, esta molécula transloca para<br />
o núcleo, onde ativa os fatores de transcrição da família de LEF/Tcf, induzindo a<br />
transcrição de genes que controlam o ciclo celular (Myc e ciclina D1), ou ainda, a<br />
transcrição de enzimas proteolíticas como as metaloproteinases (vide abaixo). Nos<br />
tecidos, quando há interação entre células e formação das junções aderentes,<br />
mediadas por E-caderinas, as moléculas de β−catenina são recrutadas para a<br />
6
egião submembranar. Direciona-se assim o pool citoplasmático de β−catenina<br />
para uma função associada à organização do citoesqueleto. As células então<br />
parariam de proliferar. Há formas alternativas de controlar-se o pool citoplasmático<br />
de β−catenina, como por exemplo, estimulando-se sua degradação. Esta função<br />
depende de moléculas como o produto do gene APC, frequentemente alterado em<br />
pacientes com polipose adenomatosa colônica familial. A falta deste mecanismo<br />
de degradação ou a perda funcional de E-caderina levam ao acúmulo do pool<br />
citoplasmático de β−catenina e sua ulterior translocação para o núcleo. A β-<br />
catenina também exerce papel no controle da proliferação e apoptose e também<br />
está aumentada em alguns tipos de câncer. Dados recentes mostraram que a E-<br />
caderina suprime o crescimento de células de carcinoma de cólon por inibir a via<br />
de sinalização β-catenina/Wnt.<br />
A transição epitélio-mesenquimal<br />
Ao mesmo tempo que a células tumorais se soltam do tumor primário por<br />
diminuição da interação célula-célula, elas devem ter a capacidade de migrar e<br />
invadir o estroma adjacente. Células de carcinomas passam por um processo<br />
denominado de transição epitélio-mesenquimal: a célula tumoral, de origem<br />
epitelial passa a expressar um conjunto de genes tipicamente expressos em<br />
células do tecido conjuntivo. Segundo Thierry, do ponto de vista celular, a<br />
transição se dá entre um morfotipo epitelióide, menos migratório, para um<br />
morfotipo fibroblastóide, mais migratório. Por muito tempo, este fenômeno foi<br />
chamado de desdiferenciação, e definido por parâmetros morfológicos, e não<br />
7
moleculares. De maneira geral, tem-se evitado o uso do termo desdiferenciação.<br />
Sabemos atualmente que este comportamento das células neoplásicas é bastante<br />
influenciado pela interação com a matriz extracelular, que tem capacidade<br />
instrucional, modulando a expressão de diferentes genes. A transição epitélio-<br />
mesenquimal é controlada por fatores peptídicos (fatores de motilidade ou<br />
dispersão) que interagem com receptores específicos, muitos deles com atividade<br />
tirosino-quinase, que além de atuar nesta transição de fenótipos, também podem<br />
atuar como fatores de crescimento. São exemplos destas moléculas: HGF<br />
(hepatocyte growth factor), membros da família de EGF (epidermal growth<br />
factors), e seus receptores, respectivamente c-met e membros da família dos<br />
receptores de EGF (EGFR e p185 neu /Her2 ou erbB-2, como discutido em outros<br />
capítulos deste livro). Estas moléculas parecem controlar diretamente os efetores<br />
da resposta de migração celular, sendo assim responsáveis pela sinalização da<br />
dispersão ou desagregação de células de um tecido.<br />
Integrinas: sensores do microambiente<br />
A capacidade de migração pela matriz extracelular é mediada por<br />
moléculas da superfamília das integrinas, glicoproteínas heterodiméricas integrais<br />
de membrana que integram os meios intra- e extracelulares; e, depende da ação<br />
de metaloproteases. As integrinas são compostas de uma cadeia α (α1-10, αv, αIIb,<br />
αL, αM, αX, por exemplo) e uma cadeia β (β1-6, por exemplo). Há uma grande<br />
variedade destes receptores de superfície celular: pelo menos 25 moléculas<br />
diferentes que atuam na adesão das células a outras células (por exemplo,<br />
8
membros da sub-família das β2 integrinas) e de células à matriz extracelular (por<br />
exemplo, membros da sub-família das β1 e β3 integrinas). A função das integrinas<br />
é controlada em parte pela ação dos fatores de motilidade ou dispersão<br />
mencionados acima.<br />
À medida que as células tumorais se locomovem por matrizes<br />
extracelulares diferentes daquela encontrada em seu extrato tecidual de origem,<br />
os sinais externos de proliferação e sobrevivência vão sendo também<br />
progressivamente alterados. De fato, quando células epiteliais e endoteliais<br />
normais são desalojadas de seus extratos de origem, estas células iniciam o<br />
processo de morte celular programada. Este processo de morte é conhecido como<br />
anoikis (do grego, sem casa). Há evidências de que as integrinas sejam também<br />
moléculas sinalizadoras do desalojamento. Ao mesmo tempo, integrinas regulam<br />
as vias de sobrevivência celular. O modelo proposto para integração destas vias<br />
de sinalização é o de que a ocupação das integrinas na superfície celular<br />
sinalizaria adequação do meio externo e portanto sobrevivência celular. Em<br />
diferentes microambientes, identificados pela célula através da relativa<br />
desocupação de suas integrinas, a ausência ou diminuição relativa dos sinais de<br />
sobrevivência culminaria então na morte celular por apoptose. Este modelo, ainda<br />
alvo de testes de validação, tem implicações interessantes. A observação mais<br />
relevante, é que ao longo do processo de transformação as células cancerosas<br />
evadem estes mecanismos e são capazes de sobreviver em diferentes<br />
microambientes.<br />
9
Várias alterações na padrão de expressão e/ou função de integrinas ao<br />
longo da progressão tumoral foram identificadas. Mais frequentemente as<br />
integrinas são responsáveis por um processo de migração disfuncional. Assim, por<br />
exemplo, fibroblastos são células migratórias, mas, de maneira geral migram<br />
pouco ou quase nada sobre membranas basais (matriz extracelular especializada<br />
que separa por exemplo os epitélios do tecido conjuntivo subjacente). No processo<br />
de transformação maligna de fibroblastos, há aumento da capacidade de migração<br />
do fibroblasto transformado sobre laminina, glicoproteína específica das<br />
membranas basais. Esta migração disfuncional depende do acúmulo de uma<br />
integrina específica, α6β1 integrina, que é responsável pela resposta migratória<br />
das células transformadas.<br />
As células tumorais apresentam pelo menos dois mecanismos de migração<br />
pela matriz extracelular: (1) um movimento celular individual, semelhante ao<br />
movimento de leucócitos pelos tecidos inflamados, chamado de migração<br />
amebóide; (2) um movimento celular coletivo, caracterizado pela migração de<br />
agregados celulares. O movimento celular coletivo requer que as células,<br />
agrupadas através de interações célula-célula, formem uma unidade assimétrica.<br />
Na frente de migração, estão as células com características mais migratórias,<br />
onde é gerada a força motriz; as células localizadas posteriormente são<br />
virtualmente puxadas pelas células localizadas anteriormente. O mecanismo de<br />
comunicação e transmissão de força utilizado pelas células em movimento não é<br />
conhecido. Resultados recentes mostraram que o movimento coletivo de células<br />
de melanoma é bloqueado com anticorpos anti-β1 integrinas; curiosamente, o<br />
10
movimento amebóide não é sensível à inibição por anti-β1 integrinas. Pode-se<br />
concluir que ao alterar as interações célula-célula e/ou célula-matriz, células<br />
tumorais sofrem transição de um programa de migração para outro. Esses<br />
resultados ilustram o conceito de plasticidade da migração de células tumorais. O<br />
movimento coletivo de células de melanoma representa uma estratégia de<br />
migração eficiente, que permite a translocação ativa e passiva de células<br />
heterogêneas (nem todas as células precisariam ser igualmente migratórias),<br />
potencializando a disseminação de células que apresentem diferentes<br />
características dentro da massa tumoral. Existiria assim um efeito de comunidade,<br />
onde o fenótipo metastático poderia ser a resultante de fenótipos compartilhados<br />
por uma população de células tumorais heterogêneas entre si. Essa é uma<br />
característica das células tumorais que deverá ser levada em consideração na<br />
geração de futuras estratégias terapêuticas.<br />
A distribuição polarizada das integrinas observada em células epiteliais<br />
normais é perdida em células de carcinoma. As integrinas α6β1 e α6β4, que são<br />
ligantes de laminina-1, concentradas normalmente na membrana basolateral,<br />
passam a ter uma distribuição mais uniforme. A integrina α5β1, que se liga a<br />
fibronectina, também tem alteração na sua distribuição em fibroblastos<br />
transformados. Estes, antes agrupados nas placas de adesão focal, são<br />
encontrados em toda a superfície celular de maneira difusa após a transformação.<br />
Resultados indicam que há uma correlação inversa entre a deposição de<br />
fibronectina na matriz e a migração celular, sugerindo que a diminuição de<br />
fibronectina na matriz e o aumento da capacidade invasiva de fibroblastos<br />
11
transformados pode ser causado pela redução da expressão ou da função da α5β1<br />
integrina. Por outro lado, o aumento da expressão da integrina αvβ3 parece<br />
contribuir para a aquisição do fenótipo maligno de células de melanoma. A<br />
transição do melanoma de crescimento radial para o de crescimento vertical, é<br />
acompanhado do aumento da expressão dessa integrina.<br />
As vias de sinalização de integrinas são controladas por diferentes<br />
moléculas, que têm sido identificadas como supressoras de metástases. Incluem -<br />
se aí CD82, membro da família das tetraspaninas e RHOGDI2, um regulador da<br />
função de RHO e RAC, que controlam a organização do citoesqueleto em<br />
processos de movimento celular. Algumas tetraspaninas colocalizam com<br />
integrinas na membrana plasmática das células em microdomínios especializados.<br />
Nestes microdomínios encontram-se diferentes lipídios e glicolipídios, como os<br />
gangliosídeos, por exemplo. Diferentes marcadores associados a progressão<br />
tumoral pertencem à família dos gangliosídeos. Mais recentemente, evidências<br />
experimentais indicam que os gangliosídeos podem modular a migração celular<br />
dependente de integrinas, provavelmente interferindo com a interação integrina-<br />
tetraspanina.<br />
Além da família das integrinas αv estar relacionada com a aquisição da<br />
capacidade migratória, ela também tem papel importante na angiogênese (ver<br />
abaixo). A αvβ3 integrina é expressa em vasos neoformados durante processos<br />
fisiológicos e patogênicos, como a progressão tumoral. A análise da expressão da<br />
αvβ3 integrina em tumores de pacientes com carcinoma de cólon mostrou uma<br />
relação inversa entre o intervalo de sobrevida livre de doença dos pacientes e os<br />
12
níveis intratumorais desta integrina. Esta variável parece dependente da<br />
densidade microvascular analisada para cada caso.<br />
As integrinas da família αv também estão envolvidas na regulação da<br />
atividade das enzimas proteolíticas que degradam a membrana basal, a primeira<br />
barreira que as células tumorais devem ultrapassar. Na verdade, a interrupção da<br />
organização ou integridade da membrana basal é um marcador histológico chave<br />
na transição de um tumor para carcinoma invasivo. As enzimas que degradam a<br />
matriz extracelular pertencem à família das metaloproteinases, que será discutida<br />
a seguir.<br />
A degradação da matriz extracelular<br />
Para que haja a migração de células tumorais pelas diferentes matrizes<br />
extracelulares do organismo (através das membranas basais, pelo estroma<br />
intersticial e pelas matrizes ósseas), é necessário que haja degradação da matriz<br />
extracelular. A degradação da matriz ocorre em condições fisiológicas e<br />
patológicas, sendo finamente regulada em diversos níveis, como será discutido a<br />
seguir. Entre as moléculas efetoras desta degradação encontra-se uma família de<br />
enzimas, as metaloproteinases de matriz extracelular (MMP), proteinases<br />
dependentes de zinco para sua atividade. A família das MMP conta com mais de<br />
25 diferentes membros, subdividida em 4 grupos, de acordo com a sua estrutura<br />
primária e a especificidade ao substrato: colagenases, gelatinases, estromelisinas<br />
e metaloproteínases-tipo membrana (Tabela 1). A degradação da matriz<br />
extracelular também depende de enzimas que degradam polissacarídeos<br />
13
complexos, como os glicosaminoglicanos (por exemplo, hialuronidases,<br />
heparanases e condroitinases).<br />
Atividade aumentada de MMPs está associada às fases de crescimento do<br />
tumor, invasão e metástases, sendo freqüentemente superexpressas em<br />
diferentes cânceres. A maioria das MMPs é secretada em forma latente<br />
(zimogênio). As pró-MMPs são ativadas por proteólise no espaço extracelular. A<br />
ativação de pró-MMPs depende da ação de uma serino-protease, a plasmina; que,<br />
por sua vez também existe numa forma latente, o plasminogênio. A conversão de<br />
plasminogênio em plasmina depende de um outro sistema de serino-proteases: os<br />
ativadores do plasminogênio (tipos tecidual e uroquinase, tPA e uPA,<br />
respectivamente). A ativação dos ativadores do plasminogênio depende de sua<br />
interação com receptores específicos de membrana e depende, pelo menos em<br />
parte, de αv integrinas. Ainda, a expressão de MMPs também é controlada<br />
transcricionalmente. Citocinas e fatores peptídicos como interleucina (IL)-4 e IL-10,<br />
fatores de crescimento (EGF, fator de crescimento transfomante α (TGF-α), fator<br />
de crescimento fibroblasto básico (bFGF), e TGF-β-1 induzem a expressão de<br />
diferentes membros da família das MMPs.<br />
Ao lado das cascatas de ativação, o processo de degradação da matriz<br />
extracelular também é regulado por diferentes inibidores encontrados no plasma e<br />
nos tecidos. Entre os inibidores plasmáticos, por exemplo, encontram -se inibidores<br />
de proteases não específicos como a α2-macroglobulina e α1-antiprotease; entre<br />
os inibidores teciduais destaca-se a família das TIMPs (tissue inhibitors of<br />
metalloproteinases ). As TIMPs, uma família de 4 proteínas (TIMP-1, TIMP-2,<br />
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TIMP -3 e TIMP -4), exercem um duplo controle sobre as MMPs inibindo tanto sua<br />
forma ativa como no seu processo de ativação (Figura 2). Além da função de<br />
inibidores da atividade das MMPs, as TIMPs também induzem mudança na<br />
morfologia da célula, estimulam o crescimento de vários tipos celulares e modulam<br />
negativamente o processo de angiogênese.<br />
MMPs na disseminação de tumores<br />
As MMPs medeiam a degradação da matriz extracelular e da membrana<br />
basal durante fases precoces do processo de tumorigênese, contribuindo para a<br />
formação do microambiente que promove o crescimento do tumor. As MMPs<br />
também participam em estágios mais tardios do desenvolvimento do câncer,<br />
promovendo o crescimento sustentado tanto de tumores primários como<br />
metastáticos pela ativação de fatores de crescimento, inativação de proteínas de<br />
ligação a fatores de crescimento ou pela liberação de moléculas mitogênicas<br />
residentes na matriz extracelular. MMPs atuam assim modulando a<br />
biodisponibilidade de fatores de crescimento, favorecendo a expansão das células<br />
tumorais; quer diretamente, induzindo a proliferação de células tumorais; quer<br />
indiretamente, regulando o comportamento das células endoteliais (vide abaixo) e<br />
fibroblastos que suportam o crescimento do tumor.<br />
Um dos primeiros passos na invasão de carcinomas é a disrupção da<br />
membrana basal e subsequente migração por esta matriz extracelular<br />
proteolisada. A membrana basal é constituída de moléculas como laminina,<br />
colágeno tipo IV e proteoglicanos contendo heparam-sulfato. Mais recentemente,<br />
mostrou-se que a molécula de laminina-5, presente em membranas basais de<br />
15
epitélios, por exemplo, está associada ao controle do fenótipo migratório.<br />
Laminina-5 íntegra sinaliza o estado estacionário. A clivagem de laminina-5 por<br />
MMP-2 ou MMP-14 revelam um sítio críptico da molécula de laminina que<br />
desencadeia a motilidade celular. Esta forma clivada é encontrada em tumores<br />
experimentais; em cânceres humanos, MMP-14 co-localiza com laminina-5, o que<br />
sugere que este seja um mecanismo operante associado a cânceres<br />
microinvasivos.<br />
A transição epitélio-mesenquimal é um processo finamente regulado.<br />
Discutimos acima o papel das junções aderentes e E-caderina na manutenção da<br />
arquitetura dos epitélios, e na regulação de vias de sinalização associadas a via<br />
Wnt/wingless. E-caderina é clivada pela MMP -3 ou 7 e a liberação do fragmento<br />
de E-caderina promove a invasão das células do tumor de maneira parácrina in<br />
vitro , possivelmente atuando como inibidor competitivo de outras moléculas de E-<br />
caderina intactas. A clivagem de E-caderina também desencadeia a transição<br />
epitélio-mesenquimal, associada ao comportamento invasivo de tumores. Outras<br />
moléculas, como CD44, também regulam este processo.<br />
A ativação de MMPs também figura entre os mecanismos que as células<br />
tumorais utilizam para escapar da "vigilância" do sistema imune. A proliferação de<br />
linfócitos T, que é regulada pela sinalização de citocinas pelo receptor α da<br />
interleucina 2 (IL-2Rα), pode ser inibida pela clivagem deste receptor por MMP-9.<br />
MMPs também ativam TGF-β, um fator supressor de linfócitos T na resposta<br />
contra os tumores. A clivagem do inibidor de proteinase α1, gerado por MMP-11,<br />
diminui a sensibilidade das células do tumor a células natural killer.<br />
16
A expressão de MMPs, embora baixa ou não detectável na maioria dos<br />
tecidos normais, encontra-se aumentada na maioria dos tumores. Animais<br />
modificados geneticamente e que não expressam algumas das MMPs apresentam<br />
tumores menores que os animais normais, ou ainda apresentam tumores mais<br />
tardiamente. Estas moléculas, que têm sido consideradas moléculas associadas a<br />
tumor, no entanto não são produzidas somente pelas células tumorais<br />
propriamente ditas. Estudos usando a técnica de hibridação in situ , permitiram<br />
mostrar que o mRNA de diversas MMPs é produzido também por fibroblastos do<br />
estroma e células inflamatórias presentes no microambiente onde se encontram<br />
as células tumorais. Assim, postula-se que as células tumorais paracrinamente<br />
modulem a expressão de MMPs por células normais. As células inflamatórias,<br />
como mastócitos, macrófagos e neutrófilos, além de produzir MMPs também<br />
produzem citocinas que podem atuar como moduladores positivos deste processo.<br />
Cria-se assim uma rede tecidual de ativação transcricional , síntese, secreção e<br />
ativação de MMPs, como aquela ativada no processo de remodelação tecidual<br />
normal; embora sem os mecanismos de controle normal operantes. O fenômeno<br />
discutido acima ilustra claramente o conceito de que o comportamento dos<br />
tumores não depende somente da célula tumoral, mas também de suas interações<br />
com elementos do hospedeiro, que ocorrem no contexto do microambiente<br />
tumoral.<br />
Da mesma forma que as células tumorais invadem os tecidos do<br />
hospedeiro, células do hospedeiro, como células endoteliais e pericitos, são<br />
recrutadas pelo tumor, invadem-no e formam estruturas vasculares (vasos<br />
sanguíneos e linfáticos), que compõem um elemento importante do microambiente<br />
17
tumoral (Figura 3). A vascularização do tumor se dá por angiogênese. Ao mesmo<br />
tempo que se criam rotas vasculares de influxo de nutrientes, necessários para a<br />
expansão da massa tumoral; os vasos neoformados podem dar vazão ao efluxo<br />
de células tumorais para a circulação hematogênica ou linfática, resultando assim<br />
na disseminação sistêmica do tumor.<br />
Angiogênese<br />
A angiogênese é um processo fisiológico definido como a formação de<br />
novos vasos a partir de vasos pré-existentes que ocorre durante a formação de<br />
novos tecidos, onde são requeridos oxigênio e nutrientes para o crescimento das<br />
células.<br />
As células de um tumor conseguem obter nutrientes e oxigênio por difusão<br />
passiva a uma distância de ~0.2 a 0.5 mm. Portanto, tumores sólidos só podem<br />
apresentar tamanho superior a 0.5 a 1 mm 3 (~10 6 células) quando são<br />
vascularizados, o que nos permite concluir que o crescimento tumoral depende da<br />
angiogênese. No entanto, a angiogênese em tumores é bastante diferente daquela<br />
vista em tecidos normais, apresentando vasos vazantes, com diâmetro irregular e<br />
paredes finas, com fluxo sanguíneo aberrante e áreas de necrose. Além de<br />
diferenças morfológicas, muitas moléculas de superfície são diferencialmente<br />
expressas entre as células endoteliais da vasculatura tumoral e do tecido normal,<br />
como descrito a seguir.<br />
As células tumorais começam a promover a angiogênese já nas fases<br />
iniciais da tumorigênese. O processo de angiogênese é resultado do balanço entre<br />
fatores estimulatórios, como o VEGF (fator de crescimento de célula endotelial<br />
18
vascular), PDGF (fator de crescimento derivado de plaquetas), TGF-α e -β, FGF-2<br />
(fator de crescimento de fibroblastos tipo 2 ou básico) e citocinas pró-inflamatórias<br />
como TNF-α (fator de necrose tumoral α); e entre fatores inibitórios como<br />
interferons, angiostatina, endostatina, trombospondina e inibidores de<br />
metaloproteinases. Ao longo da transformação maligna, há aumento da expressão<br />
das proteínas pró-angiogênicas e diminuição das proteínas supressoras da<br />
angiogênese, algumas delas controladas por TP53, como trombospondina, por<br />
exemplo.<br />
O primeiro passo da neovascularização é a ativação de células endoteliais<br />
quiescentes pelos fatores liberados pelas células tumorais ou pelas células do<br />
estroma adjacente. Esta ativação ocorre em resposta a estímulos estressantes<br />
como a hipóxia, privação de nutrientes ou compressão. Em condições de<br />
normoxia, o O2 difunde livremente pelas células, levando a modificações pós -<br />
traducionais de diferentes proteínas, entre elas o fator transcricional HIF-1α. a<br />
forma oxigenada de HIF-1α é ubiquitinada e degradada pelo proteasoma, num<br />
mecanismo que depende da proteína VHL, mutada em alguns tumores, como na<br />
síndrome de von Hippel Lindau. Em condições de hipóxia, os níveis de HIF-1α<br />
aumentam, a molécula então transloca para o núcleo, onde associada a HIF-1β<br />
atua como fator de transcrição regulando por exemplo a expressão gênica de<br />
VEGF, que atua sobre as células endoteliais.<br />
Nestas condições, as células endoteliais são estimuladas a produzir<br />
metaloproteinases, a degradar a matriz extracelular e a proliferar. A degradação e<br />
remodelação da matriz permitem que as células endoteliais em proliferação<br />
19
migrem através do tecido e formem estruturas tubulares. Enquanto ocorre a<br />
remodelação da matriz pelas metaloproteinases, as células endoteliais em<br />
resposta a ativação de fatores de crescimento alteram a expressão de seus<br />
receptores de superfície. Por exemplo, têm -se o aumento da expressão do<br />
receptores de fatores de crescimento, como o receptor para VEGF. Também<br />
ocorre diminuição da expressão de caderinas. Por outro lado, têm-se aumento da<br />
expressão de integrinas, entre elas α2β1, α3β1, α5β1 e αvβ3. Essas alterações<br />
determinam o comportamento das células endoteliais, que perdem a interação<br />
célula-célula e aumentam a habilidade de interagir e de migrar pela matriz<br />
extracelular.<br />
Entre as integrinas com a expressão alterada, o aumento da expressão da<br />
αvβ3.é o mais notável. Ao contrário das outras integrinas, αvβ3 não é encontrada<br />
em células endotelias quiescentes. Devido a esse padrão de expressão seletiva<br />
em células endoteliais de vasos tumorais, esta integrina tem sido alvo de<br />
abordagens terapêuticas experimentais e em estudos clínicos de fase 1 e 2, até o<br />
momento.<br />
No processo de angiogênese, MMPs tem função pró-angiogênica pela<br />
liberação de fatores como FGF básico e TGF-β, residentes na matriz; mas<br />
também anti-angiogênica, associada à clivagem de componentes da matriz<br />
extracelular e geração de peptídeos com ação anti-angiogênica. Assim por<br />
exemplo, a degradação de colágeno tipo I é necessária para a invasão das células<br />
endoteliais e a ulterior formação de vasos (estruturas tubulares). MMP-2, 9 e 14<br />
regulam diretamente a angiogênese. Há evidências de que a inibição da<br />
20
expressão de MMP-2 em células tumorais está associada a angiogênese<br />
deficiente. Por outro lado, uma série de fatores anti-angiogênicos foi recentemente<br />
caracterizada, como por exemplo a angiostatina, a endostatina e tumstatina. Estas<br />
moléculas são derivadas de plasminogênio, colágeno XVIII e colágeno tipo IV,<br />
respectivamente. É importante ressaltar que as moléculas parentais não tem<br />
nenhum efeito anti-angiogênico, que só é observado após o processamento por<br />
proteólise limitada (clivagem) do plasminogênio e dos colágenos. A clivagem de<br />
plasminogênio pelas MMP-2, 3, 7, 9 e 12 (metaloelastase de macrófago) dá<br />
origem a angiostatina; MMP-3, 9, 12, 13 e 20 estão envolvidas na geração de<br />
endostatina, um fragmento C-terminal da clivagem do colágeno tipo XVIII. Tanto<br />
angiostatina como endostatina reduzem a proliferação de células endoteliais e<br />
endostatina pode inibir a invasão das células endoteliais por agir como um inibidor<br />
das MMP-14 e 2. Embora os dados em animais de experimentação quanto ao uso<br />
de angiostatina e endostatina sejam bastante promissores, o uso clínico destas<br />
moléculas tem encontrado uma série de barreiras; não sendo ainda eficiente. De<br />
qualquer maneira, o princípio de sua utilização tem motivado a geração de<br />
compostos modificados que atuem de maneira similar a estes angiostáticos.<br />
MMP-12 pode também inibir a angiogênese do tumor por clivagem e<br />
inativação do receptor de uPA (uPAR), que é necessário para a invasão das<br />
células endoteliais pela matriz provisória de fibrina. Tanto inibidores sintéticos de<br />
MMPs como por exemplo marimastate, batimastate e inibidores endógenos, como<br />
as TIMPs são capazes de inibir a formação de tubos capilares in vitro e in vivo.<br />
Vários inibidores de angiogênese têm sido desenvolvidos, tendo como alvo as<br />
células endoteliais presentes no microambiente tumoral, ao invés das células<br />
21
tumorais (Tabela 2). Esta nova abordagem terapêutica é promissora porque ao<br />
contrário das células tumorais, as células endoteliais são geneticamente estáveis<br />
e conseqüentemente não acumulam mutações que permitiriam o desenvolvimento<br />
de resistência a drogas. Além disso, a expressão de moléculas específicas à<br />
vasculatura do tumor sugere que estes vasos poderiam ser seletivamente<br />
destruídos sem afetar a integridade dos vasos normais.<br />
Os vasos não são formados somente pelas células endoteliais. Células<br />
estromais de suporte, os pericitos, interagem com as células endoteliais. As<br />
células endoteliais modulam a função do pericito, secretando PDGF, que atua de<br />
maneira parácrina nos pericitos que expressam o receptor para este fator de<br />
crescimento. O receptor de PDGF é uma tirosino-quinase e sua atividade regula,<br />
entre outros processos, a pressão intersticial intratumoral, frequentemente<br />
elevada. Inibidores da atividade de receptores de PDGF, como o STI571 (Glivec),<br />
têm sido avaliados como redutores da pressão intersticial intratumoral. Os<br />
resultados são bastante promissores: a administração conjunta de quimioterápicos<br />
e STI571 está associado a uma maior captação de quimioterápicos pela célula<br />
tumoral em modelos experimentais. Este conceito, uma vez confirmado mais<br />
amplamente, como demonstrado para drogas como taxol e 5-fluorouracil (em<br />
estudo clínico), permitiria administrar doses progressivamente menores, porém<br />
igualmente eficazes de quimioterápicos, otimizando seu índice terapêutico.<br />
A expressão alterada de moléculas de superfície e de matriz pelas células<br />
endoteliais do tumor também podem ser exploradas para a geração de novas<br />
técnicas de diagnóstico e prognóstico. Análises de expressão gênica através da<br />
técnica de SAGE (serial analysis of gene expression) revelaram que células<br />
22
endoteliais da vasculatura de tumores de cólon humano apresentam níveis de<br />
colagenases, bem como de outras proteínas da matriz e metaloproteinases, de 10<br />
a 30 vezes maior quando comparado aos níveis das células do tecido adjacente<br />
normal. Bibliotecas de fagos têm sido desenvolvidas para identificar peptídeos que<br />
se ligam especificamente a proteínas presentes nas células endoteliais dos vasos<br />
tumorais. Um dos peptídeos identificados reconhece as integrinas α5β1 e αvβ3.<br />
Outro peptídio que foi identificado se liga a um novo marcador do endotélio, o<br />
aminopeptidase-N. Anticorpos anti-aminopeptidade-N, bem como seus inibidores<br />
enzimáticos, inibem a angiogênese, indicando que esta peptidase pode também<br />
estar envolvida na migração de células endoteliais.<br />
Em modelos experimentais, tumores de crescimento lento, que são mais<br />
difíceis de serem tratados com quimioterapia, são responsivos a terapia anti-<br />
angiogênica. Deve-se levar em consideração, que os inibidores de angiogênese<br />
são mais efetivos quando administrados num esquema que mantenha a<br />
concentração da droga na circulação constante, ao invés de uma terapia que seja<br />
periodicamente descontinuada. A terapia anti-angiogênica, baseada em anticorpos<br />
como por exemplo anti-αvβ3 integrinas, angiostáticos endógenos (angiostatina e<br />
similares) ou exógenos; ou ainda, inibidores de MMPs que atuam também na<br />
inibição da angiogênese guarda um grande potencial, que precisa ser<br />
sistematicamente avaliado. Problemas antecipados a esta terapia recaem sobre<br />
um fenômeno ainda pouco estudado, denominado mimetismo vasculogênico.<br />
Observado em melanomas, este processo se caracteriza pela formação de<br />
estruturas vasculares revestidas por células tumorais, e não somente células<br />
23
endoteliais. Acredita-se que neste caso as células tumorais mimetizem as células<br />
endoteliais, formando estruturas que se anastomosam com vasos já formados,<br />
garantindo assim o aporte de nutrientes e oxigênio ao interior do tumor. Não se<br />
sabe ainda quão geral é este fenômeno.<br />
Linfangiogênese<br />
Apesar do amplo conhecimento sobre o papel da angiogênese na<br />
progressão tumoral, relativamente pouco se sabe a respeito da linfangiogênese,<br />
isto é, geração de novos vasos linfáticos.<br />
Até há pouco tempo, sugeria-se que não existiam vasos linfáticos dentro de<br />
massas tumorais. Esta seria uma das causas para a alta pressão intersticial<br />
observada em tumores sólidos, discutida acima. Com a geração de marcadores<br />
mais específicos para os vasos linfáticos, contudo, muitos grupos identificaram a<br />
presença de vasos linfáticos colabados no microambiente tumoral. O colapso<br />
destes vasos dentro do tumor parece ser devido ao estresse mecânico gerado<br />
pelas células tumorais em proliferação; o que, por sua vez, contribui para o<br />
aumento da pressão dentro do interstício tumoral.<br />
Mais recentemente, identificaram-se dois fatores linfangiogênicos. O<br />
primeiro fator de crescimento linfangiogênico descoberto foi o fator de crescimento<br />
vascular endotelial do tipo C (VEGF C). O VEGF C é sintetizado como uma pré-<br />
pró-proteína e muitas formas são geradas através de um processo proteolítico. O<br />
VEGFC tem afinidade por dois receptores de superfície do tipo tirosina quinase,<br />
VEGFR2 e VEGFR3, que são predominantemente expressos nas células<br />
endoteliais dos vasos sangüíneos e linfáticos, respectivamente. Como o VEGF, o<br />
24
VEGF C estimula a migração e proliferação de células endoteliais e induz aumento<br />
na permeabilidade vascular, porém doses maiores de VEGF C são necessárias<br />
para se observarem estes efeitos. Diferentemente do VEGF, a expressão de<br />
VEGF C não é estimulada pela hipóxia, e sim por citocinas pró-inflamatórias.<br />
Evidências experimentais indicam que o VEGF C regula o crescimento de vasos<br />
linfáticos em vários modelos animais. Em animais geneticamente modificados, a<br />
super-expressão de VEGF C acelera o aparecimento de metástases. O aumento<br />
da expressão de VEGF C em queratinócitos da pele leva a hiperplasia dos vasos<br />
linfáticos da derme. As respostas angiogênica e linfoangiogência de VEGF C<br />
dependem do grau de processamento proteolítico do seu precursor e do padrão<br />
de expressão dos seus receptores nas células endoteliais dos vasos sangüíneos e<br />
linfáticos no tecido alvo.<br />
O segundo fator de crescimento identificado foi o VEGF D (também<br />
conhecido como fator de crescimento induzido por c-FOS ou FIGF). O VEGF D é<br />
processado da mesma maneira que o VEGF C e tem afinidade pelos mesmos<br />
receptores nas células endoteliais. Como o VEGF C o VEGF D é linfoangiogênico<br />
quando tem sua expressão aumentada em queratinócitos da pele.<br />
Estudos recentes demonstraram que a expressão de VEGF C é detectável<br />
em metade dos cânceres humanos analisados e que há uma correlação entre a<br />
expressão de VEGF C e a formação de metastáses em linfonodos regionais em<br />
cânceres coloretal, de tireóide, próstata, estômago, pulmão e carcinoma<br />
esofágico. A expressão aumentada de VEGF D foi observada em melanomas<br />
quando comparados com melanócitos. Apesar dos avanços nessa área, ainda não<br />
25
foi determinado se a inibição da linfoangiogênese seria uma estratégia terapêutica<br />
eficaz na inibição da disseminação de células tumorais e formação de metástases.<br />
Um conceito importante de se discutir é o da disseminação de células<br />
tumorais para linfonodos. Dado o grande número de anastomoses linfático-<br />
venosas, as células que saem dos tumores podem chegar aos linfonodos de<br />
drenagem quer por vasos linfáticos, quer por vasos sanguíneos. A via de saída da<br />
célula tumoral parece ser menos crítica do que a real capacidade da célula<br />
tumoral colonizar o linfonodo. De qualquer forma, estudos experimentais<br />
mostraram que a linfangiogênese acelera o aparecimento de metástases. Não se<br />
sabe, no entanto, se os vasos linfáticos pré-existentes já seriam suficientes para<br />
dar vazão à disseminação das células metastáticas; ou se haveria a formação de<br />
novo de vasos linfáticos (linfangiogenêse) ou eventual hipertrofia/hiperplasia da<br />
rede linfática existente. Estes pontos deverão ser esclarecidos experimentalmente<br />
nos próximos anos.<br />
Fase Intravascular da disseminação tumoral<br />
O achado de células tumorais na circulação sanguínea e/ou linfática não é<br />
infrequente; embora em alguns estudos tenha-se mostrado uma correlação entre o<br />
número de células tumorais circulantes e o prognóstico de pacientes, o significado<br />
clínico deste achado ainda não foi firmemente estabelecido. Por ora, o achado de<br />
células tumorais na circulação serviria somente para identificação de doença<br />
residual. O processo de metástase é tido como ineficiente: estima-se que somente<br />
uma a cada 10.000 células tumorais presentes na circulação, em sistemas<br />
experimentais, tem a capacidade de gerar um nódulo metastático.<br />
26
O processo de entrada das células tumorais na circulação, contudo, não é<br />
um processo passivo. De fato, as células metastáticas têm maior capacidade de<br />
migrar de maneira polarizada para o interior dos vasos sanguíneos do que as<br />
células não metastáticas, que se fragmentam mais facilmente ao longo do<br />
processo de entrada na circulação, talvez por menor deformabilidade.<br />
Uma vez na circulação, a eficiência do processo depende da capacidade<br />
das células tumorais formarem êmbolos mistos com elementos figurados do<br />
sangue, principalmente plaquetas. A interação das células tumorais com plaquetas<br />
é mediada por um outro sistema de moléculas de adesão: as selectinas.<br />
Selectinas são glicoproteínas transmembranares que apresentam a<br />
capacidade de se ligar especificamente a carboidratos (o que as define como<br />
lectinas animais), presentes em diferentes moléculas como glicoproteínas,<br />
glicolipídios e glicosaminoglicanos/proteoglicanos. Existem três selectinas em<br />
mamíferos: a L- selectina, encontrada em leucócitos; a P-selectina, encontrada em<br />
plaquetas e células endoteliais e a E-selectina, encontrada em células endoteliais.<br />
A interação de selectinas com seus ligantes depende em parte de uma estrutura<br />
de carboidratos carregado negativamente. Mais frequentemente a ligação se dá<br />
entre a selectina e agregados de um antígeno carboidrato conhecido como<br />
sialosil-Lewis x/a .Este antígeno é encontrado em diferentes moléculas e tem sido<br />
considerado um marcador associado a tumores. De fato, sialosil-Lewis a é o<br />
antígeno reconhecido por CA19-9, que encontra aplicação no seguimento clínico<br />
de portadores de alguns tumores, como por exemplo, tumores de ovário. A<br />
expressão de antígenos sialosil-Lewis x/a em carcinomas de mama, cólon, próstata,<br />
vias biliares, estômago e pulmão é um fator de mau prognóstico. Estes antígenos<br />
27
geralmente se apresentam em glicoproteínas, classificadas como membros da<br />
família das mucinas. Estas mucinas aumentam a tendência de agregação<br />
plaquetária, e quando isto ocorre em torno da célula tumoral, aumenta-se a<br />
probabilidade da formação de um êmbolo misto, constituído de células tumorais e<br />
plaquetas, que serviriam como um envoltório para a célula tumoral circulante.<br />
Admite-se, embora faltem ainda evidências conclusivas, que o envoltório de<br />
plaquetas serviria como um escudo para o êmbolo tumoral, dificultando assim o<br />
acesso e portanto reconhecimento e destruição da célula tumoral por células de<br />
defesa (quer do sistema imune inato como do adaptativo). A formação do êm bolo<br />
misto depende da interação entre P-selectina e seus ligantes. Esta noção foi<br />
recentemente confirmada em sistemas experimentais, onde se avaliou a<br />
progressão de carcinomas de cólon em animais deficientes em P-selectina. A<br />
disfunção plaquetária esteve associada a uma menor propensão na formação de<br />
metástases. Estes dados sugerem que intervenções farmacológicas que diminuam<br />
a tendência de formação de trombos/êmbolos poderiam ser úteis no controle da<br />
doença metastática. Em sistemas experimentais, a fração de baixo peso molecular<br />
da heparina, que tem ação anti-trombótica, inibiu de maneira significativa o<br />
desenvolvimento de metástases. Estudos clínicos estão sendo propostos para se<br />
avaliar o impacto do uso desta estratégia em momentos críticos do tratamento de<br />
pacientes com câncer, como por exemplo no período pós-operatório, onde apesar<br />
de técnica cirúrgica adequada existe um aumento significativo de células tumorais<br />
circulantes. Pelo que discutimos acima, é necessário um estudo sistemático para<br />
se avaliar o real benefício clínico de estratégias como esta.<br />
28
De qualquer forma, na circulação o êmbolo metastático tende a ser retido<br />
em leitos vasculares dos diferentes órgãos. Esta retenção é física; e, também<br />
pode haver retenção em leitos vasculares específicos pelo reconhecimento de<br />
moléculas de adesão território-específicas. Este reconhecimento é um dos<br />
elementos que define o fenômeno de organotropismo das metástases, embora<br />
sua contribuição seja pequena neste processo.<br />
O extravasamento da célula tumoral<br />
Estudos usando microscopia intravital, identificaram duas formas de saída<br />
da célula tumoral para o interior dos órgãos sede de metástases. No primeiro,<br />
após a parada da célula no leito vascular, num processo semelhante ao fenômeno<br />
de rolamento de leucócitos pelo endotélio inflamado, as células tumorais<br />
isoladamente se despreendem do trombo, interagem com a célula endotelial e<br />
transmigram para o interior do órgão-alvo. No segundo, as células tumorais<br />
formam grandes trombos que induzem a destruição da parede do vaso, e<br />
subsequente infiltração da célula tumoral.<br />
Os mecanismos de transmigração e migração pelo estroma intersticial são<br />
semelhantes àqueles discutidos acima. O processo de transmigração de células<br />
tumorais, que define o eficiente extravasamento, depende de uma combinação de<br />
fatores, à semelhança do que ocorre com leucócitos. Mais recentemente, mostrou-<br />
se que células tumorais também expressam receptores de quimiocinas, e que o<br />
conjunto de receptores expressos está associado à capacidade da célula<br />
metastatizar para órgãos específicos, que produzam as quimiocinas cognatas.<br />
Parte do organotropismo depende então da expressão de receptores de<br />
29
quimiocinas. Curiosamente, entre os genes controlados por HIF (como discutido<br />
acima), encontram-se genes que codificam receptores de quimiocinas, como o<br />
CXCR4. A expressão deste receptor está associado à formação de metástases<br />
ósseas em pacientes com adenocarcinomas de mama; e, em sistemas<br />
experimentais, variantes metástaticas expressam níveis elevados deste receptor<br />
quando comparadas a variantes não metastáticas.<br />
Quando da formação do trombo, as células endoteliais sofrem um processo<br />
de morte celular por desalojamento (anoikis). O mecanismo deste processo de<br />
invasão não está completamente esclarecido. A análise do fenômeno indica que a<br />
célula endotelial perde sua capacidade de adesão à membrana basal<br />
subendotelial, o que é seguido do processo de apoptose. As células tumorais<br />
migrariam então para o interior do órgão-alvo, podendo gerar assim o implante<br />
metastático. Não está claro ainda qual o efetor da perda de adesão das células<br />
endoteliais, que é primariamente mediada por integrinas. Candidatos para esta<br />
função são membros da crescente família das disintegrinas, moléculas que<br />
possuem domínios semelhantes aos das moléculas de matriz extracelular que são<br />
reconhecidas pelas integrinas.<br />
A formação do nódulo metastático<br />
Podemos propor os seguintes cenários para o destino da célula<br />
metastática: (1) a célula metastática não produz seus próprios fatores de<br />
crescimento, nem responde a fatores produzidos no órgão-alvo ; (1a) se a célula<br />
for completamente resistente ao anoikis, será formado um depósito metastático<br />
onde as células estarão quiescentes; (1b) se a célula ainda for sensível a anoikis,<br />
30
o desalojamento estará associado à morte da célula metastática; (2) células<br />
resistentes a anoikis e que produzam ou respondam a fatores de crescimento<br />
presentes no órgão-alvo, haverá crescimento da metástase até o volume crítico de<br />
0.5 a 1 mm 3 , quando será fundamental o recrutamento de vasos para a expansão<br />
da metástase.<br />
A célula metastática pode ficar quiescente no seu novo ambiente até o<br />
momento em que passa a produzir seus próprios fatores de crescimento ou passe<br />
a responder a fatores externos. É possível ainda que no novo ambiente, as células<br />
passem a reconhecer sinais anti-proliferativos. A quiescência da massa tumoral<br />
também pode ser conseqüência da inadequada angiogênese, induzindo um<br />
estado de dormência nas células do depósito metastático. Esta observação foi<br />
feita quando se descreveu o angiostático angiostatina, e sugeriu uma base<br />
molecular para o fenômeno que era conhecido como imunidade concomitante em<br />
tumores. Este fenômeno se baseia na observação clínica e experimental que os<br />
depósitos metastáticos apresentavam uma taxa de crescimento muito acelerada<br />
após a retirada da massa tumoral primária. Em 1994, Folkman e colaboradores<br />
mostraram que este fenômeno era devido a um angiostático circulante presente no<br />
soro de animais com grandes massas tumorais; o angiostático seria destruído no<br />
tumor primário, mas não na circulação agindo sistemicamente bloqueando a<br />
angiogênese associada à inflamação ou a tumores. Quando há um desequilíbrio<br />
entre as substâncias angiogênicas e angiostáticas no sentido angiogênico, há<br />
remodelação do microambiente tumoral, com formação de vasos que suportam a<br />
expansão da massa tumoral metastática, que eventualmente poderia dar origem a<br />
novas metástases (Fig. 1).<br />
31
Estes cenários nos remetem às características adquiridas pela célula<br />
cancerosa, como proposto por Hanahan e Weinberg. A primeira noção que precisa<br />
ser reforçada é a de que estas capacidades não são absolutas, dependendo do<br />
ambiente tecidual em que as células se encontram. Isto é, os sinais de<br />
sobrevivência e proliferação/anti-proliferação provavelmente são qualitativa e<br />
quantitativamente diferentes nos diferentes tecidos ou microambientes. A segunda<br />
noção é a de que não existe uma ordem na aquisição das capacidades da célula<br />
cancerosa. A terceira noção é a de que nem todas as células da massa tumoral<br />
compartilham necessariamente todas as características necessárias para o<br />
desenvolvimento do câncer, como se imaginava a princípio. De fato, a célula que<br />
adquire a capacidade de invasão não é necessariamente a célula que sobrevive<br />
na circulação ou a que recruta plaquetas e interage com o endotélio. O processo<br />
de metastatização parece antes ser a conseqüência da complementação de<br />
fenótipos de uma comunidade de células heterogêneas. Finalmente, cânceres são<br />
microambientes compostos de células cujo genoma foi alterado e de células do<br />
hospedeiro, cujo genoma aparentemente não foi alterado. Estas noções devem<br />
ser a base para propostas de estratégias terapêuticas combinadas, que tenham<br />
como alvo não somente a célula tumoral propriamente dita, mas também<br />
elementos do hospedeiro, como por exemplo, células endoteliais, pericitos e<br />
plaquetas, que atuam promovendo a progressão tumoral.<br />
32
Leituras recomendadas<br />
Chammas, R. e R.R. Brentani (2002). Cell-matrix interactions. Encyclopedia<br />
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34
Grupo MMP Substrato(s)<br />
Colagenases<br />
Colagenase intersticial<br />
Colagenase 1<br />
MMP 8 Colageno tipo I,II,III,VII e X<br />
Colagenase neutrofila<br />
Colagenase 2<br />
MMP 1 Colageno tipo I,II,III,VII e X<br />
Colagenase 3 MMP 13 Colageno tipo I,II,III,IV,VII,X,XIV; tenascina; agrecan e<br />
fibronectina<br />
Colagenase 4<br />
MMP 18 Colageno tipo I; gelatinas<br />
Gelatinases<br />
Gelatinase A MMP 2 Gelatina tipo I,IV,V e X; laminina-5 e TGF-β-latente<br />
Gelatinase B<br />
MMP 9 Gelatina tipo I,IV,V e X; laminina-5 e TGF-β-latente<br />
Estromelisinas<br />
Estromelisina 1 MMP 3 Colageno tipo III,IV,IX e X; gelatina; pro-MMP1; laminina;<br />
proteoglicano; fibronectina; elastina; E-caderina; perlecan<br />
e pro-MMP13<br />
Estromelisina 2 MMP 10 Colageno tipo III,IV,IX e X; gelatina; pro-MMP1; laminina e<br />
proteoglicano<br />
Estromelisina 3 MMP 11 α-1-antiprotease<br />
Matrilisina MMP 7 Gelatina; fibronectina; pro-MMP1; laminina; colageno IV<br />
Metaloelastase<br />
MMP 12 Elastina e pro-MMP13<br />
MMPs-tipo Membrana<br />
MT1MMP MMP 14 Pro-MMP2; gelatina; colagenos; fibronectina e<br />
proteoglicanos<br />
MT2MMP MMP 15 Pro-MMP2; fibronectina; tenascina e laminina<br />
MT3MMP MMP 16 Pro-MMP2; gelatina; colageno III e fibronectina<br />
MT4MMP MMP 17 N.D<br />
MT5MMP MMP 24 N.D<br />
MT6MMP MMP 25 N.D<br />
RASI-1 MMP 19 N.D<br />
Enamelisina MMP 20 Amelogenina<br />
Femalisina MMP 23 N.D<br />
Endometase MMP 26 N.D<br />
Epilisina MMP 28 N.D<br />
CMMP MMP 22 N.D<br />
N.D.: não determinado<br />
Tabela 1. Família das Metaloproteinase de Matriz Extracelular (MMP). Agruparam-se os membros da família das<br />
metaloproteinases de matriz em quatro gurpos distintos. Colagenases, gelatinases e estromelisinas são secretados em<br />
forma latente ou inativa. As MMPs de membrana apresentam um domínio transmembranar. Os substratos já identificados<br />
das diversas MMP estão listados na coluna da direita.<br />
35
INIBIDORES DA ANGIOGÊNESE<br />
Agente angiostático Alvo e Mecanismo de<br />
ação na célula endotelial<br />
Angiostatina ATP-sintase, angiomotina<br />
e anexina II. Inibe a<br />
proliferação e migração<br />
Bevacizumab (Avastina) Anticorpo<br />
contra VEGF<br />
monoclonal<br />
Arresten Integrina α1β1. Inibe a<br />
proliferação e migração.<br />
Canstatina Integrina αvβ3. Inibe a<br />
proliferação e migração.<br />
Combretastana Microtúbulos. Induz a<br />
reorganização do<br />
citoesqueleto de actina<br />
Fase de Estudo Clínico<br />
(em 2002)<br />
Fase 1<br />
Fases 2 e 3<br />
Não<br />
Endostatina Integrina α1β1. Inibe a Fases 1 e 2.<br />
proliferação e migração e<br />
induz a apoptose.<br />
NM-3 Inibidor de VEGF. Inibe a Fase 1<br />
proliferação<br />
Tumstatina Integrina αvβ3. Inibe a Não<br />
2-metoxiestradiol<br />
proliferação<br />
Inibe a proliferação Fases 1 e 2<br />
Vitaxina Anticorpo monoclonal Fases 1 e 2<br />
contra Integrina αvβ3.<br />
36<br />
Aprovado para início em<br />
2003<br />
Fase 1 completa<br />
Tabela 2. Exemplos de angiostáticos, seu mecanismo possível de ação e<br />
fase de estudos clínicos em que se encontram. Várias estratégias baseadas na<br />
inibição do processo de angiogênese encontram-se em fase de estudos em<br />
diferentes centros de pesquisa e tratamento (adaptado de Kerbel e Folkman<br />
(2002) Nature Rev.Cancer 2: 727-739).
Legendas das Figuras<br />
Figura 1. Esquema das etapas do processo de disseminação tumoral.<br />
Alterações genéticas se acumulam nas células em processo de transformação. O<br />
processo microinvasivo se caracteriza pela aquisição das capacidades de<br />
migração disfuncional e de sobrevivência em microambientes distintos do original<br />
da célula transformada. A expansão da massa tumoral só se dá quando ocorre<br />
indução sustentada de angiogênese, que permite o influxo de nutrientes e O2 para<br />
a massa tumoral. Da mesma forma que a vascularização neoformada permite<br />
influxo de nutrientes, pode haver por estes mesmos vasos a saída da célula<br />
tumoral do tumor para a circulação sistêmica. Uma vez na circulação, a viabilidade<br />
da célula tumoral depende de sua interação com elementos como as plaquetas. A<br />
formação de microêmbolos facilita, em parte, o processo de disseminação à<br />
distância. No órgão-alvo, se as células tumorais sobreviverem, o foco metastático<br />
pode ficar em estado de dormência ou sofrer expansão, dependente de<br />
vascularização. O processo pode ser cíclico, e metátases podem ser originadas de<br />
outras metástases. A expressão de genes associados à progressão tumoral está<br />
associada a alterações físicas no genoma da célula transformada (mutações);<br />
porém, há também evidências de que traços do fenótipo metastático sejam<br />
atribuíveis a alterações epigenéticas da célula tumoral, como por exemplo<br />
expressão descontrolada ou silenciamento de genes -chave para o processo de<br />
metastatização.<br />
Figura 2. Esquema do contole da degradação da matriz extracelular, um<br />
processo regulado em vários níveis: (1) a ativação de metaloproteinases de<br />
matriz (MMPs, como colagenase, gelatinase e estromelisina), secretadas como<br />
pró-enzimas, depende da serino-protease, plasmina; (2) plasmina precisa ser<br />
ativada a partir do plasminogênio pelos ativadores de plasminogênio; (3) que, por<br />
sua vez, também são secretados em formas latentes. Ao lado desta hierarquia de<br />
ativação, há uma série de inibidores mais ou menos específicos. Entre os menos<br />
específicos estão os inibidores plasmáticos, entre os mais específicos estão os<br />
inibidores teciduais, como TIMPs. Os ativadores de plasminogênio também são<br />
inibíveis por inibidores como PAI-1 e PAI-2. A degradação da matriz está<br />
associada à liberação (aumento de biodisponibilidade) de uma série de fatores<br />
peptídicos residentes na matriz extracelular, como FGF-2 e TGF-β ; além do fato<br />
de muitas das atividades de proteínas de matriz extracelular serem próprias de<br />
seus fragmentos, e não das moléculas intactas (sítios ou domínios funcionais<br />
crípticos). Exemplos incluem os fragmentos motogênicos de laminina-5 ou os<br />
peptídeos angiostáticos derivados do plasminogênio, colágenos IV e XVIII<br />
(respectivamente, angiostatina, tumstatina e endostatina).<br />
Figura 3. Angiogênese em melanomas experimentais. Células tumorais foram<br />
transplantadas em animais singênicos. O desenvolvimento de massas tumorais<br />
(M) depende da formação de uma adequada rede de vasos sanguíneos (V),<br />
formada a partir de vasos do próprio hospedeiro e que invadem a massa tumoral,<br />
permitindo assim o influxo de nutrientes e oxigênio. Áreas necróticas (N), refletem<br />
37
o desbalanço entre o aporte de nutrientes e a proliferação das células tumorais<br />
(Coloração: hematoxilina e eosina; barra equivale a 100 micrômetros. Em<br />
colaboração com Dra. Estela Novak, Fundação Hemocentro de São Paulo).<br />
38