Doença de Petri da Videira - UTL Repository - Universidade Técnica ...

Material e métodos
Pch2 (Tegli et al., 2000) que amplificam um fragmento de 360 bp. A mistura de reacção,
de volume 25 µL, foi a seguinte: 1x Tampão de PCR, 50 µM de cada dNTP, 0,5 µM de
cada primer, 2 U de Taq DNA polimerase (Dream Taq, Fermentas) e 1µL do produto
amplificado resultante da reacção PCR anterior. Como controlo negativo utilizou-se a
mesma mistura de amplificação, substituindo o produto amplificado por água miliQ
esterilizada.
O programa de amplificação utilizado consistiu numa pré-desnaturação de 3 min. a 95ºC,
seguida de 15 ciclos de 20 s a 94 ºC (desnaturação), 30 s a 60ºC (hibridação), 1 min. a
72ºC (extensão), terminando com um período de 1 min. a 72ºC (extensão final) (Tegli
et al., 2000; Nascimento et al., 2001).
Os produtos de amplificação foram separados por electroforese em gel de agarose a 2%
(p/v) em tampão TBE a 0,5x (45 mM Tris-base, 45 mM acido bórico, 1mM EDTA, pH 8,0)
(Sambrook et al., 1989), numa tina horizontal 20 x 25 cm (largura x comprimento)
(“Horizon 20-25, Horizontal Gel Electrophoresis Apparatus, Life Technologies/GibcoBRL”).
Em cada um dos poços das extremidades do gel colocaram-se 1,5 µL do marcador de
peso molecular 123 pb DNA ladder (GibcoBRL) adicionados de 3 µL de “gel-loading
buffer” (0,25%, p/v, de azul de bromofenol; 40%, p/v, de sacarose em TBE 0,5x),
enquanto que nos restantes poços se procedeu à aplicação das amostras constituídas por
18 µL dos produtos amplificados, nas mesmas condições do marcador. A electroforese
decorreu durante 1h 30m a 80 V, corrente gerada pela fonte “Electrophoresis Power
Supply – EPS 100, Pharmacia Biotec”, em tampão TBE 0,5x, à temperatura ambiente.
No fim da electroforese o gel foi corado com brometo de etídio (0,5 µg/L), durante 10
min. e depois lavado em água destilada, de forma a retirar o excesso do corante, durante
20 min. Os resultados foram visualizados num transiluminador de luz ultra-violeta (312
nm) “BTX 20.M, UVItec Limited”, e impressos em papel fotográfico, utilizando uma
impressora térmica “Mitsubishi Model P91E”.
29