Doença de Petri da Videira - UTL Repository - Universidade Técnica ...

Material e métodos
(Centrífuga Hettich 32R), à temperatura de 4ºC durante 10 min., e o sobrenadante foi
recolhido para um novo tubo. Repetiu-se este passo pelo menos duas vezes, até total
eliminação das partículas sólidas. Ao sobrenadante obtido adicionou-se igual volume de
isopropanol frio, para precipitação do DNA.
Os tubos foram deixados à temperatura ambiente durante 5 min. e de seguida agitados
lentamente, por inversão, até se observar a formação de um “novelo”. Foram
centrifugados durante 10 min. (13000 rpm, 4ºC), seguindo-se a eliminação do
sobrenadante e lavagem do “pellet” com 1mL de etanol a 70%, frio. Centrifugou-se
novamente durante 2 min., nas condições acima descritas, decantou-se o sobrenadante e
deixou-se o precipitado a secar à temperatura ambiente.
Depois do “pellet” seco adicionaram-se 25 µL de TE (10mM Tris-HCl, pH 8,0; 1mM
EDTA), para solubilizar os ácidos nucleicos e colocaram-se os tubos de microcentrífuga a
4ºC até à utilização do DNA.
3.3.3 DETECÇÃO DE PHAEOMONIELLA CHLAMYDOSPORA POR NESTED - PCR
Depois de efectuada a extracção do DNA, procedeu-se à detecção de Pa. chlamydospora
recorrendo à técnica nested-PCR, uma variante da Reacção em Cadeia da Polimerase
(PCR).
Na primeira reacção de amplificação utilizaram-se os primers ITS4 (primer universal) e
ITSF1 (primer especifico para fungos) referidos por Hamelin et al. (1996), para amplificar
parte da região ITS (Espaçador Internamente Transcrito) do rDNA da globalidade dos
fungos presentes na madeira (Nascimento et al., 2001).
Cada reacção de amplificação foi realizada num volume final de 25 µL em tubos de
microcentrífuga de 200 µL, contendo a seguinte mistura: 1x Tampão de PCR, 100 µM de
cada dNTP, 1 µM de cada primer, 1,25 U de Taq DNA polimerase (Dream Taq,
Fermentas, Lituania) e 2,5 µL de DNA previamente diluído 10X (adaptado de Tegli et al.,
2000). Como controlo negativo utilizou-se a mesma mistura de amplificação,
substituindo o DNA por água miliQ esterilizada.
A reacção PCR decorreu num termociclador Biometra-T-Gradient com o seguinte
programa: pré-desnaturação a 95ºC, durante 3 min., seguida de 30 ciclos de 30 s a 92ºC
(desnaturação), 30 s a 55ºC (hibridação), 1 min. a 72ºC (extensão), terminando com um
período de 10 min. a 72ºC (extensão final).
Os produtos de amplificação obtidos foram sujeitos a uma segunda reacção de
amplificação, em que se usaram os primers específicos para o fungo em estudo, Pch1 e
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