Doença de Petri da Videira - UTL Repository - Universidade Técnica ...

Material e métodos
Figura 3.3. Ilustração do modo como foi efectuada a divisão dos lançamentos de videira usados para ensaios
de fungicidas em feridas de poda.
De cada região, com presença de necroses, cortaram-se cinco pedaços, com auxílio de
uma tesoura de poda. Os pedaços foram desinfectados superficialmente por imersão em
etanol a 70%, evaporado à chama (Adalat et al., 2000). Seguidamente, foram imersos
numa solução de hipoclorito de sódio (NaOCl) a 7%, durante 1 min., passados por água
destilada esterilizada, também durante 1 min. e por fim secos em papel de filtro. Foram,
então, transferidos assepticamente para placas de Petri contendo 15-20 mL de PDA e
250 mg/L de cloranfenicol. As placas foram colocadas em estufa de incubação a 22ºC, na
obscuridade, durante 2 semanas (Mugnai et al., 1996).
3.3.2 EXTRACÇÃO DE DNA
Região 2
Região 5
Poda
Na extracção do DNA, a partir dos lançamentos inoculados artificialmente com Pa.
chlamydospora, utilizaram-se os protocolos descritos por Cenis (1992) e Nascimento et
al. (2001), introduzindo algumas modificações.
Região 1
Região 3
Região 4
Da margem das necroses retiraram-se fragmentos de madeira que foram congelados em
azoto líquido e macerados com o auxílio de um almofariz e pilão até ficarem reduzidos a
um pó fino. Este foi então transferido para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e
adicionado 650 µL de tampão de extracção (200mM Tris-HCl, pH 8,0; 250 mM EDTA;
0,5% SDS, p/v), suplementado com 1% de polivinilpirrolidona (PVP, Sigma Chemical
Company, St. Louis, MO, USA). Posteriormente os tubos foram agitados por vortex
durante 15 min., para homogeneização da mistura. De seguida, adicionaram-se 195 µL
de acetato de sódio 3M (pH 5,2), e colocaram-se os tubos de microcentrífuga a -20ºC,
durante 15 min. Passado este período, os tubos foram centrifugados a 13000 rpm