Doença de Petri da Videira - UTL Repository - Universidade Técnica ...
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Material e métodos O esquema dos ensaios de campo, encontra-se representado no Anexo A. O delineamento experimental usado foi o da casualização global das modalidades e os resultados foram submetidos a análise da variância (ANOVA) com efeitos fixos e distribuição normal, utilizando um delineamento a um factor (tratamento fungicida), totalmente casualizados e um nível de significância de 0,05, com recurso ao programa STATISTICA 6.0. Os valores expressos em percentagens sofreram transformação angular (arcsen√x), antes de se proceder à ANOVA. A comparação dos valores médios dos resultados obtidos foi realizada através do teste de Tukey (com nível de significância de 0,05). As videiras em ensaio foram ainda alvo de poda em verde (desponta, monda de sarmentos, desladroamento e desfolha) não se tendo procedido à monda de cachos. É ainda de referir que os tratamentos contra as principais doenças, pragas e infestantes foram realizados de acordo com o procedimento habitual da quinta onde foi instalado o ensaio. 3.3.1 AVALIAÇÃO DA EXISTÊNCIA DE NECROSES Após seis meses de incubação (Setembro/Outubro), recolheram-se as varas em ensaio para avaliação. Procedeu-se à medição do comprimento total das varas, assim como do comprimento dos vários entrenós. Posteriormente todas as varas foram cortadas longitudinalmente e registou-se a existência ou não de necroses e avaliou-se o seu comprimento. Seguidamente efectuou-se o reisolamento do fungo inoculado a partir de fragmentos de madeira retirados da bordadura das necroses. No Quadro 3.3 e na Figura 3.3 pode-se visualizar os vários níveis em que se dividiu cada lançamento. Quadro 3.2. Níveis em que foram divididos os talões. Níveis Local do lançamento Região 1 abaixo do corte de poda Região 2 acima do 3º nó Região 3 abaixo do 3º nó Região 4 acima do 2º nó Região 5 abaixo do 2º nó 26
Material e métodos Figura 3.3. Ilustração do modo como foi efectuada a divisão dos lançamentos de videira usados para ensaios de fungicidas em feridas de poda. De cada região, com presença de necroses, cortaram-se cinco pedaços, com auxílio de uma tesoura de poda. Os pedaços foram desinfectados superficialmente por imersão em etanol a 70%, evaporado à chama (Adalat et al., 2000). Seguidamente, foram imersos numa solução de hipoclorito de sódio (NaOCl) a 7%, durante 1 min., passados por água destilada esterilizada, também durante 1 min. e por fim secos em papel de filtro. Foram, então, transferidos assepticamente para placas de Petri contendo 15-20 mL de PDA e 250 mg/L de cloranfenicol. As placas foram colocadas em estufa de incubação a 22ºC, na obscuridade, durante 2 semanas (Mugnai et al., 1996). 3.3.2 EXTRACÇÃO DE DNA Região 2 Região 5 Poda Na extracção do DNA, a partir dos lançamentos inoculados artificialmente com Pa. chlamydospora, utilizaram-se os protocolos descritos por Cenis (1992) e Nascimento et al. (2001), introduzindo algumas modificações. Região 1 Região 3 Região 4 Da margem das necroses retiraram-se fragmentos de madeira que foram congelados em azoto líquido e macerados com o auxílio de um almofariz e pilão até ficarem reduzidos a um pó fino. Este foi então transferido para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e adicionado 650 µL de tampão de extracção (200mM Tris-HCl, pH 8,0; 250 mM EDTA; 0,5% SDS, p/v), suplementado com 1% de polivinilpirrolidona (PVP, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA). Posteriormente os tubos foram agitados por vortex durante 15 min., para homogeneização da mistura. De seguida, adicionaram-se 195 µL de acetato de sódio 3M (pH 5,2), e colocaram-se os tubos de microcentrífuga a -20ºC, durante 15 min. Passado este período, os tubos foram centrifugados a 13000 rpm
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Material e métodos<br />
O esquema dos ensaios <strong>de</strong> campo, encontra-se representado no Anexo A. O<br />
<strong>de</strong>lineamento experimental usado foi o <strong>da</strong> casualização global <strong>da</strong>s mo<strong>da</strong>li<strong>da</strong><strong>de</strong>s e os<br />
resultados foram submetidos a análise <strong>da</strong> variância (ANOVA) com efeitos fixos e<br />
distribuição normal, utilizando um <strong>de</strong>lineamento a um factor (tratamento fungici<strong>da</strong>),<br />
totalmente casualizados e um nível <strong>de</strong> significância <strong>de</strong> 0,05, com recurso ao programa<br />
STATISTICA 6.0. Os valores expressos em percentagens sofreram transformação angular<br />
(arcsen√x), antes <strong>de</strong> se proce<strong>de</strong>r à ANOVA. A comparação dos valores médios dos<br />
resultados obtidos foi realiza<strong>da</strong> através do teste <strong>de</strong> Tukey (com nível <strong>de</strong> significância <strong>de</strong><br />
0,05).<br />
As vi<strong>de</strong>iras em ensaio foram ain<strong>da</strong> alvo <strong>de</strong> po<strong>da</strong> em ver<strong>de</strong> (<strong>de</strong>sponta, mon<strong>da</strong> <strong>de</strong><br />
sarmentos, <strong>de</strong>sladroamento e <strong>de</strong>sfolha) não se tendo procedido à mon<strong>da</strong> <strong>de</strong> cachos. É<br />
ain<strong>da</strong> <strong>de</strong> referir que os tratamentos contra as principais doenças, pragas e infestantes<br />
foram realizados <strong>de</strong> acordo com o procedimento habitual <strong>da</strong> quinta on<strong>de</strong> foi instalado o<br />
ensaio.<br />
3.3.1 AVALIAÇÃO DA EXISTÊNCIA DE NECROSES<br />
Após seis meses <strong>de</strong> incubação (Setembro/Outubro), recolheram-se as varas em ensaio<br />
para avaliação. Proce<strong>de</strong>u-se à medição do comprimento total <strong>da</strong>s varas, assim como do<br />
comprimento dos vários entrenós. Posteriormente to<strong>da</strong>s as varas foram corta<strong>da</strong>s<br />
longitudinalmente e registou-se a existência ou não <strong>de</strong> necroses e avaliou-se o seu<br />
comprimento. Segui<strong>da</strong>mente efectuou-se o reisolamento do fungo inoculado a partir <strong>de</strong><br />
fragmentos <strong>de</strong> ma<strong>de</strong>ira retirados <strong>da</strong> bor<strong>da</strong>dura <strong>da</strong>s necroses. No Quadro 3.3 e na Figura<br />
3.3 po<strong>de</strong>-se visualizar os vários níveis em que se dividiu ca<strong>da</strong> lançamento.<br />
Quadro 3.2. Níveis em que foram divididos os talões.<br />
Níveis Local do lançamento<br />
Região 1 abaixo do corte <strong>de</strong> po<strong>da</strong><br />
Região 2 acima do 3º nó<br />
Região 3 abaixo do 3º nó<br />
Região 4 acima do 2º nó<br />
Região 5 abaixo do 2º nó<br />
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