Resumo - Genética - USP
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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS<br />
LGN 5799 – Seminários em <strong>Genética</strong> e Melhoramento de Plantas<br />
Departamento de <strong>Genética</strong><br />
Avenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - SP<br />
http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php<br />
“MARCADORES MOLECULARES BASEADOS EM MICROARRANJOS: DArT E SFP”<br />
Doutoranda: Larissa DI Cássia Laperuta<br />
Orientadora: Profa. Dra. Maria Lúcia Carneiro Vieira<br />
O desenvolvimento de marcadores moleculares para a detecção de polimorfismos de DNA é um<br />
dos recursos mais importantes que têm permitido o avanço da genética molecular. Já foram descritos,<br />
na literatura, vários tipos de marcadores moleculares, sendo que estes podem ser divididos em duas<br />
classes: os que derivam de restrição, seguida ou não de amplificação, e os que derivam exclusivamente<br />
da PCR. Na primeira classe, os mais utilizados são RFLP, VNTR, AFLP e CAPS, enquanto na segunda<br />
classe, tem‐se RAPD, SSR, e SCAR. Há também aqueles que dependem de seqüenciamento, como o<br />
SNP. Mais recentemente, foram desenvolvidos dois novos marcadores moleculares baseados na técnica<br />
de hibridização por microarranjo: DArT e SFP. Essa técnica permite a observação simultânea de várias<br />
centenas de locos polimórficos espalhados pelo genoma.<br />
O marcador DArT (Diversity Arrays Technology) apresenta grande potencial para estudos de<br />
diversidade genética e de mapeamento, demonstra alta informação de polimorfismos e revela relações<br />
genéticas consistentes entre amostras. Alguns estudos sugerem que a tecnologia DArT apresenta<br />
vantagens sobre as tecnologias existentes em termos custo e velocidade na detecção de<br />
polimorfismos. Os marcadores DArT podem ser utilizados também para a genotipagem de grandes<br />
coleções de germoplasma. Para cada amostra de DNA individual que é estudada, são desenvolvidas<br />
representações genômicas através da digestão do DNA genômico com enzimas de restrição e posterior<br />
ligação de adaptadores aos fragmentos digeridos. Posteriormente, é feita uma PCR onde são utilizados<br />
primers complementares à seqüência dos adaptadores para reduzir a complexidade do genoma. Os<br />
fragmentos amplificados são clonados. Esses insertos clonados são novamente amplificados,<br />
purificados e arranjados em um suporte sólido (microarranjo), resultando em um “discovery array”.<br />
Representações genômicas preparadas a partir de genomas individuais alvos de estudo são hibridizados<br />
a esse “discovery array” para identificação de polimorfismos. Os clones polimórficos (marcadores DArT)<br />
mostram intensidade de sinais de hibridização variáveis para diferentes indivíduos conforme os<br />
diferentes genótipos.<br />
SFPs (Single Feature Polymorphisms) foram primeiramente identificados em leveduras como<br />
diferenças significativas na intensidade de hibridização quando o DNA genômico de diferentes<br />
linhagens era hibridizado com arranjos de oligonucleotídeos de expressão de alta densidade. Os SFPs
podem ser considerados como uma alternativa viável para os SNPs (Single‐Nucleotide Polymorphisms)<br />
em estudos de associação de uma grande variedade de genomas, principalmente em organismos<br />
modelo, como Arabidopsis thaliana. Nesses organismos existe uma taxa muito alta de desequilíbrio de<br />
ligação, o que pode levar à interferência de um marcador sobre o comportamento de um marcador<br />
vizinho. Tal fato é compensado nessa técnica através do uso de marcadores com densidades mais<br />
elevadas. O DNA genômico total do indivíduo ou da variedade que se quer estudar é marcado e<br />
hibridizado a um Chip de expressão de outro indivíduo ou de outra variedade ao qual se queira<br />
comparar. Os polimorfismos detectados por essa técnica são conseqüência de variações alélicas que<br />
vão desde polimorfismos em um único nucleotídeo até grandes deleções existentes. A grande<br />
vantagem do SFP é a facilidade da genotipagem, que é feita in loco nos arranjos de expressão além de<br />
não exigir conhecimento prévio das seqüências a serem analisadas.<br />
De qualquer forma, a existência de vários tipos de marcadores moleculares e a diferença em<br />
seus princípios, metodologias e aplicações requerem alguns cuidados quanto à escolha de um ou mais<br />
métodos a serem utilizados. Assim, deve‐se avaliar qual ou quais são os marcadores mais apropriados<br />
de acordo com o projeto a ser realizado, uma vez que não há nenhum marcador molecular que<br />
preencha satisfatoriamente todas as necessidades dos pesquisadores.<br />
Referências:<br />
Borevitz, J.O.; Liang, D.; Plouffe, D.; Chang, H.; Zhu, T.; Weigel, D.; Berry, C.C.; Winzeler, E.; Chory, J.<br />
Large‐scale identification of single‐feature polymorphisms in complex genomes. Genome<br />
Research, v.13, p.513–523. 2003.<br />
Jaccoud, D.; Peng, K.; Feinstein, D.; Kilian, A. Diversity arrays: a solid state technology for sequence<br />
information independent genotyping. Nucleic Acids Research, v.29, n.4, e.25, p.1‐7. 2001.<br />
Rostoks, N.; Borevitz, J. O.; Hedley, P. E.; Russell, J.; Mudie, S.; Morris, J.; Cardle, L.; Marshall, D.F.;<br />
Waugh, R. Single‐feature polymorphism discovery in the barley transcriptome. Genome Biology,<br />
v.6, R54. 2005.<br />
Semagn, K.; Bjornstad, A.; Ndjiondjop, M.N. An overview of molecular marker methods for plants.<br />
African Journal of Biotechnology, v.5, n.25, p. 2540‐2568. 2006.<br />
Wenzl, P.; Carling, J.; Kudrna, D.; Jaccoud, D.; Huttner, E.; Kleinhofs, A.; Kilian, A. Diversity Arrays<br />
Technology (DArT) for whole‐genome profiling of barley. Proceedings of the National Academy<br />
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Winzeler, E.A.; Richards, D.R.; Conway, A.R.; Goldstein, A.L.; Kalman, S.; McCullough, M.J.; McCusker,<br />
J.H.; Stevens, D.A.; Wodicka, L.; Lockhart, D.J.; Davis, R.W. Direct allelic variation scanning of the<br />
yeast genome. Science, v.281, p.1194–1197. 1998.<br />
Xia, L.; Peng, K.; Yang, S.; Wenzl, P.; de Vicente, M.C.; Fregene, M.; Kilian, A. DArT for high‐throughput<br />
genotyping of Cassava (Manihot esculenta) and its wild relatives. Theoretical and Applied<br />
Genetics, v.110, p.1092‐1098. 2005.