nara lins meira quintão análise dos mecanismos envolvidos na ...

amostras foi realizada utilizando o kit Bio-Rad, segundo recomendações do fabricante
(Bio-Rad, CA, USA). (FERREIRA et al., 2005b)
3.11.2.2. Ensaio de Western blot
Quantidades equivalentes de proteína foram adicionadas ao tampão Tris-HCl
65,5 mM (Tris 200 mM, glicerol 10 %, SDS 2 %, β-mercaptoetanol 2,75 mM e azul de
bromofenol 0,04 %), fervidas por 5 min e separadas por eletroforese em gel de
poliacrilamida 12 %. As proteínas foram transferidas para uma membrana de
nitrocelulose (Bio-Rad) por eletroforese, de acordo com instruções do fabricante (GE
Healthcare, SP, Brasil). As membranas foram bloqueadas em solução TBS-T (Tris-
buffered saline tween 20) contendo leite em pó desnatado 10 % por 60 min em
temperatura ambiente, sob agitação. Posteriormente, as membranas foram incubadas
por 2 h com os anticorpos para o receptor B1 (sc-15048) ou receptor B2 (sc-15051)
(Santa Cruz Biotechnology, USA) diluídos 1:100 em TBS. Após lavagem, as
membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados à peroxidase. Os
imunocomplexos foram visualizados, utilizando o sistema de detecção por
quimioluminescencia (ECL, Amersham).
3.12. Drogas e reagentes
As seguintes drogas e reagentes foram utilizados: aprotinina, hidrato de cloral
(Vetec; Brasil); azul de bromofenol, benzamidina, β-mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT),
ácido etileno diaminotetraacetico (EDTA), glicerol, leupeptina, ácido n-[2-
hidroxietil]piperazina-n’-[4-butanosulfonio (HEPES), pepstatina A, fenilmetilsulfonil
fluorido (PMSF), inibidor de tripsina da soja, tris, triton x-100, β-glicerofosfato, fluoreto
de sódio, β-mercaptoetanol, anticorpo anti-NGF murino (lote 118H9095), pastilhas de