nara lins meira quintão análise dos mecanismos envolvidos na ...
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amostras foi realizada utilizando o kit Bio-Rad, segundo recomendações do fabricante<br />
(Bio-Rad, CA, USA). (FERREIRA et al., 2005b)<br />
3.11.2.2. Ensaio de Western blot<br />
Quantidades equivalentes de proteí<strong>na</strong> foram adicio<strong>na</strong>das ao tampão Tris-HCl<br />
65,5 mM (Tris 200 mM, glicerol 10 %, SDS 2 %, β-mercaptoetanol 2,75 mM e azul de<br />
bromofenol 0,04 %), fervidas por 5 min e separadas por eletroforese em gel de<br />
poliacrilamida 12 %. As proteí<strong>na</strong>s foram transferidas para uma membra<strong>na</strong> de<br />
nitrocelulose (Bio-Rad) por eletroforese, de acordo com instruções do fabricante (GE<br />
Healthcare, SP, Brasil). As membra<strong>na</strong>s foram bloqueadas em solução TBS-T (Tris-<br />
buffered saline tween 20) contendo leite em pó des<strong>na</strong>tado 10 % por 60 min em<br />
temperatura ambiente, sob agitação. Posteriormente, as membra<strong>na</strong>s foram incubadas<br />
por 2 h com os anticorpos para o receptor B1 (sc-15048) ou receptor B2 (sc-15051)<br />
(Santa Cruz Biotechnology, USA) diluí<strong>dos</strong> 1:100 em TBS. Após lavagem, as<br />
membra<strong>na</strong>s foram incubadas com anticorpos secundários conjuga<strong>dos</strong> à peroxidase. Os<br />
imunocomplexos foram visualiza<strong>dos</strong>, utilizando o sistema de detecção por<br />
quimioluminescencia (ECL, Amersham).<br />
3.12. Drogas e reagentes<br />
As seguintes drogas e reagentes foram utiliza<strong>dos</strong>: aprotini<strong>na</strong>, hidrato de cloral<br />
(Vetec; Brasil); azul de bromofenol, benzamidi<strong>na</strong>, β-mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT),<br />
ácido etileno diaminotetraacetico (EDTA), glicerol, leupepti<strong>na</strong>, ácido n-[2-<br />
hidroxietil]piperazi<strong>na</strong>-n’-[4-butanosulfonio (HEPES), pepstati<strong>na</strong> A, fenilmetilsulfonil<br />
fluorido (PMSF), inibidor de tripsi<strong>na</strong> da soja, tris, triton x-100, β-glicerofosfato, fluoreto<br />
de sódio, β-mercaptoetanol, anticorpo anti-NGF murino (lote 118H9095), pastilhas de