nara lins meira quintão análise dos mecanismos envolvidos na ...

utilizando os seguintes primers: sense AACCGTTTCAACTGGCCC e antisense
GACATAAATCAGTGGGTTC, para o receptor B1; e sense
TCCTTCGTTGCCGGTCCACA e antisense CGTCTCCGGAGTCCATCACA, para a β-
actina. O DNAc da β-actina foi utilizado para a padronização da quantidade de RNA.
Alíquotas de 2 µl do RT foram adicionadas a um tampão contendo: Tris-HCl 10 mM (pH
9), MgCl2 1 mM, dNTP 200 µM, 300 nM de cada primer e 5 U de Taq polimerase, em
um volume final de 30 µl. O ciclo do PCR foi o seguinte: 4 min a 94 ºC, 35 ciclos de 45
s a 94 ºC, 45 s a 53 ºC para o receptor B1 ou 45 s a 62 ºC para a β-actina , 60 s a 72 ºC
e finalmente, 5 min a 72 ºC. Alíquotas de 5 µl de cada amostra foram analisadas em gel
Tris/borato/EDTA (TBE)-poliacrilamida 6% e coradas com nitrato de prata. A análise
quantitativa foi realizada pela medida da banda da β-actina. O tamanho das bandas foi
de 609 pb para o receptor B1 e 509 pb para a β-actina.
3.11.2. Expressão dos receptores B1 e B2 para cininas
3.11.2.1. Preparação dos tecidos para o ensaio de Western Blot
A medula espinhal de camundongos Swiss operados e falso-operados foram
isolados no 4º dia após a cirurgia. Os tecidos foram homogeneizados em tampão A
gelado [HEPES 10 mM (pH 7,4), contendo MgCl2 1,5 mM, KCl 10 mM, PMSF 1 mM,
leupeptina 5 µg/ml, pepstatina A 5 µg/ml, aprotinina 10 µg/ml, ortovanadato de sódio 1
mM, β-glicerofosfato 10 mM, fluoreto de sódio 50 mM e ditiotreitol 0.5 mM]. As
amostras foram centrifugadas a 10.000 x g, por 60 min. O pellet foi re-suspenso em
400 µl de tampão A, contendo 0,1 % de Triton-X100 e incubado, sob agitação continua,
a 4 °C por 30 min. O extrato protéico foi então centrifugado por 30 min a 10.000 x g e o
sobrenadante contendo a fração rica em membrana foi armazenado em freezer -70 °C
até o momento de sua utilização. A determinação da concentração de proteína das