nara lins meira quintão análise dos mecanismos envolvidos na ...

diretamente no ventrículo lateral (coordenadas do bregma: 1 mm lateral; 1 mm rostral;
3 mm vertical) para a administração de um volume de 5 µl das drogas ou veículo.
3.11. Ensaios bioquímicos
3.11.1. Quantificação do RNA mensageiro para o receptor B1 das cininas
3.11.1.1. Ensaio de RT-PCR
Com o objetivo de verificar o efeito da APB sobre a indução dos receptores B1
para cininas, foram avaliados os níveis do RNAm para este receptor no tecido da
medula e diferentes estruturas do cérebro de camundongos, coletados no 4º e no 30º
dias após a cirurgia, através da técnica da transcrição reversa seguida da reação em
cadeia da polimerase (RT-PCR), conforme metodologia descrita por Campos et al.
(2002) com algumas modificações. Nos intervalos de tempo descritos acima os animais
foram sacrificados por decapitação. A medula e diferentes estruturas cerebrais
(hipotálamo, tálamo, hipocampo e córtex) foram removidas em condições livres de
RNAse, congeladas em nitrogênio líquido e estocadas a -70 ºC. Posteriormente, as
amostras foram homogeneizadas e o RNA total foi extraído utilizando reagente TRIzol
(Invitrogen), conforme as recomendações do fabricante. A transcrição reversa (RT) foi
realizada com 2 µg de RNA total, utilizando oligo dT como primer (0,05 µg), 50 U de
transcriptase reversa, dNTP 144 µM, tampão de reação (DTT 10 mM, MgCl2 3 mM, KCl
75 mM e Tris-HCl 50 mM; pH 8,3) e 2 U de RNAsin Plus, em um volume final de 12,5
µl. Para a obtenção do DNA complementar (DNAc) as amostras foram aquecidas por 5
min a 70 ºC, resfriadas a 4 ºC por 5 min e mantidas a 25 ºC durante a adição da
enzima RT. Após a adição da enzima, as amostras foram mantidas a 37 ºC por 60 min,
70 ºC por 5 min e resfriadas a 4 ºC por 5 min. A amplificação do DNAc de seqüências
específicas para o receptor B1 de camundongo e para a β-actina foi obtida por PCR,