adriano penha furtado - BAIP - Universidade Federal do Pará

hibridização (60ºC por 30 seg) e extensão (72ºC por 30 seg), e uma etapa final
de 72ºC por sete minutos. A visualização dos fragmentos amplificados foi feita
após eletroforese em gel de agarose 2,5%, impregnado com brometo de etídio
e visualizado sobre luz ultravioleta, utilizando DNA Leadder de 100 pb.
2.4.3 Seqüenciamento dos Fragmentos Amplificados
Os fragmentos amplificados foram submetidos ao seqüenciamento
direto de acordo com o protocolo da ABI Prism Dye Terminator Cycle
Sequencing Ready kit (PerkinElmer Cetus, Noortwalk, CA, USA), usando o
primer DIDR-F1 e o produto da reação foi levado ao seqüenciador de DNA ABI
Prism 310, Genetic Analizer.
2.4.4 Estudo Filogenético
Para o estabelecimento de relações filogenéticas, as seqüências
obtidas a partir das amostras da Ilha do Marajó e Rio de Janeiro foram
alinhadas entre si e com seqüências de filarídeos previamente depositadas no
Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/) por outros autores.
O alinhamento das seqüências foi realizado usando o software
Clustal W (Thompson et al., 1994). A árvore filogenética foi construída usando
o software Mega 4.0 (Tamura et al., 2007) e método da Máxima Parcimônia,
com 1000 réplicas de bootstrap. A amostra Setaria digitata (von Linstow, 1906)
(Nematoda, Filarioidea: Setariidae) (EF196091) foi utilizada como grupo
externo.
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