adriano penha furtado - BAIP - Universidade Federal do Pará

submetidas à extração de DNA pelo mesmo método, sendo utilizadas como
controle negativo.
A extração de DNA dos vermes adultos seguiu o protocolo e
reagentes indicados no ChargeSwicth gDNA Mini Tissue Kit (Invitrogen Life
Technologies, Gaithersburg, MD, EUA), que consiste na lise dos tecidos dos
helmintos, seguido do acréscimo de Beads Magnéticas ® que, por afinidade
eletrostática, se ligam ao DNA extraído. O tubo contendo esta mistura é
colocado em um suporte contendo um ímã, que atrai as Beads Magnéticas ®
ligadas ao DNA para um lado do tubo, ficando livres os restos celulares que
podem ser retirados do tubo com consecutivas etapas de lavagens, seguido da
mudança de pH do meio, que provoca a mudança de carga das Beads
Magnéticas ®, que se desligam do DNA.
2.4.2 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Foram utilizados os primers específicos para filarídeos DIDR-F1
(AGTGCGAATTGCAGACGCATTGAG) e DIDR-F2 (AGCGGGTAATCACGACT
GAGTTGA) descritos por Rishniw et al., (2006) que amplificam a região 5.8S –
ITS2 – 28S do rDNA. A reação foi feita com 2 µL de DNA extraído, 1,5 mM de
MgCl2, 250 µM de dNTP (Invitrogen Life Technologies, Gaithersburg, MD,
EUA), tampão 1X (20 mM Tris – HCl, pH 8.4, 50 mM KCl), 1 U de Platinum Taq
DNA polimerase (Invitrogen Life Technologies, Gaithersburg, MD, EUA) e 10
µM de cada primer, em um volume final da reação de 20 µL.
A PCR foi processada com uma etapa inicial de desnaturação a
94ºC por 2 min, seguido de 35 ciclos de desnaturação (94ºC por 30 seg),
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