Ciclo Celular: Introdução

Ciclo Celular: Introdução
Rodrigo Martins
ICB _ LaNCE _ HU
rodrigomartins@ufrj.br

Células são geradas a partir de células e a única
maneira de se fazer nova célula é a DIVISÃO de
uma célula pré‐existente
De bactérias a mamíferos multicelulares
Ciclos sucessivos de duplicação

Quando na presença de estímulos adequados as
células podem se multiplicar através de
repetidos ciclos de proliferação e divisão
celular, que em função dessa natureza cíclica,
esse ciclo de vida das células proliferantes foi
denominado CICLO CELULAR

Proliferação Celular vs. Crescimento Celular
> Nem todas as células precisam crescer para se dividir
Divisão Celular em Blastômeros

• Fases do Ciclo Celular
Roteiro
• Relevância da Pesquisa sobre Ciclo Celular
• Histórico
• Os “Artistas do Espetáculo”: Ciclinas e CDKs
• Métodos de Estudo do Ciclo Celular

Copiar e segregar/dividir material genômico de modo perfeito!

Fases do Ciclo Celular

Mitose pode ocorrer sem citocinese > Formação de célula
com muitos núcleos
> Embriões de Drosophila

Particularidades do Ciclo Celular durante a Organogênse/
G2
Desenvolvimento de Organismos Multicelulares
Mitose
G1
Síntese de DNA (S)
G0
(pós-mitótica)
“Nascimento”
Ciclo Celular está Acoplado a
Mecanismos de Diferenciação Celular
**divisões simétricas vs. assimétricas

Divisão Meiótica Gera Células Germinativas Haplóides

Relevância do Estudo do Ciclo Celular

Biologia do Desenvolvimento
wt Sox2
Microftalmia
Fantes et al. Nature Genet. 33: 461‐2, 2003
Olena et al. Genes and Dev. 20: 1187‐02, 2006

A Retina de Vertebrados

Coordenação entre Proliferação, Saída do Ciclo e
Diferenciação é Crucial para Formação da Retina
Mitose
Fase S
Desenvolvimento
Proliferação
Saída do Ciclo Celular
Especificação do Tipo Celular
Morte Celular
Migração
Sinaptogênese

Particular Importância do Controle de Ciclo Celular
para o Desenvolvimento da Retina
Saída Precoce do Ciclo Saída Tardia do Ciclo
Functional Retina
Retinoblastoma

Importância Clínica do Estudo do Ciclo:
Biologia do Câncer
Saída de um estado quiescente para um estado de proliferação celular
ativa é um pré‐requisito para formação de diversos tumores
Necessidade de Controle Inequívoco do Estado Pós-mitótico

Células‐Tronco e Terapias Celulares
Células Multipotentes com capacidade
de gerar diferentes tipos celulares / tecidos / órgãos
Teratomas

Prêmio Nobel
O Nobel em Fisiologia ou Medicina de 2001 foi dado a pesquisadores
que fizeram descobertas sobre os mecanismos moleculares do ciclo
celular (proteínas cdk e ciclina e seus mecanismos de ação).
Leland Hartwell Tim Hunt Paul Nurse
Evans, R., Rosenthal, E.T., Youngblom, J., Distel, D. & Hunt, T. Cyclin: a protein specified by maternal mRNA in sea urchin eggs that is destroyed
at each cleavage division. Cell 33, 389–396 (1983)
Nurse, P. et al. Genetic control of the cell division cycle in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Mol. Gen. Genet. 146, 167–178 (1976).
Hartwell, L. H., Culotti, J., Pringle, J.R. & Reid, B.J. Genetic control of the cell division cycle in yeast. Science 183, 46‐51 (1974).
Hartwell, H. L.,Culotti, J. & Reid, B. Genetic control of the cell‐division cycle in yeast. I Detection of mutants. PNAS 66, 352–359 (1970).

Periódicos Internacionais Especializados
Desde 2002
www.landesbioscience.com/journals/cc/

Histórico

“ Toda célula se origina de outra célula similar pré‐existente.“
1858
Omnis cellula e cellula
Rudolf Virchow, 1821 – 1902
Robert Remak, 1815‐1865

Na vidada para o XX, a divisão celular foi estudada
em detalhe por embriologistas e microscopistas
• Eduard Strasburger (1875), botânico, e Walther Flemming (1979), que estudava células
animais, são considerados os descobridores da MITOSE;
• Flemming descreveu a cromatina e ambos deduziram que o núcleo estaria relacionado com
hereditariedade;
Walther Flemming, 1843 – 1905 Eduard Strasburger, 1844 ‐ 1912

• Nas décadas de 1970 e 1980, novas metodologias de biologia molecular
permitiram os pesquisadores das áreas de biologia celular, bioquímica e
genética, de forma conjunta, elucidar os mecanismos moleculares de
controle do ciclo celular;
• Novamente, o progresso científico foi fruto das pesquisas e descobertas
terem sido feitas em diversos organismos vivos cada um com suas
“vantagens” biológicas ou metodológicas;
• Embriologistas vs. Geneticistas
Embriologistas ‐ Anfíbios, Ouriço do mar e outros invertebrados marinhos
Geneticistas ‐ Leveduras

“Cell Cycle Classics”

Pesquisas em leveduras levaram a descoberta de
Genes essenciais para o Ciclo Celular
• Reprodução rápida
• Genoma relativamente pequeno ( em torno de 1% do nosso)
• Fácil manipulação genética
• Rápida identificação e caracterização de mutantes genéticos;

Genes Cdc (Cell‐division cycle)
Busca sistemática por mutações que inativavam genes
necessários para o ciclo/divisão celular
Cdc15 selvagem
Cdc15 mutante

Muitas Descobertas sobre a Bioquímica do Ciclo
foram feitas Estudando de Ovócitos Anfíbios
• 1 ovócito de Xenopus tem 1mm de diâmetro e um volume de citoplasma 100.000
vezes maior que uma célula humana;
• Fertilização dispara Divisão por Clivagem* do ovócito;
• Total de 4096 células em 7 horas ( ~15 minutos de fase S e M)
• Fases G1 e G2 indetectáveis;
• Fácil de injetar substâncias nas células e observar efeitos no ciclo.

Descoberta do MPF (“Maturation promotion factor”)
Maturação = indução de entrada em meiose
MPF = complexo proteico formado pelas ptns :
Cinase Cdc2 (hoje também chamada de Cdk1)
e
Ciclina B2
Masui e Markert, 1971 - J. Exp. Zool. 177: 129-146

A “natureza” do MPF (“Maturation promotion factor”)
COMPORTAMENTO
CÍCLICO
DO MPF
Gerhart, J.; Wu, M. & Kirschner, M.
J. Cell Biol. 98: 1247-1255, 1984
ATIVIDADE DO MPF
DEPENDE DE
SÍNTESE PROTÉICA
Newport, J.W. & Kirschner, M.
Cell 37: 731-742, 1984

IDENTIFICAÇÃO
DE CICLINAS
EM OVOS DE
INVERTEBRADO
MARINHO
MPF E CICLINAS
Hunt, T.; Luca, F.C. & Ruderman, J.V.
J. Cell Biol. 116: 707-724, 1992

Cdc2 = CDK1 !!
Alguns dos genes essenciais para divisão das leveduras codificavam
exatamente proteínas que mediavam a atividade
bioqímica/biológica do MPF
MPF was first known for its function, then as a protein and finally as a
gene. In contrast, CDC28 (S. cerevisiae) or cdc2 (S. pombe) was first
described as a gene with a known function and only later was the
protein identified. Cyclin was first discovered as a protein, then as a
gene and finally its function was known as a component of MPF”

Os Artistas do Espetáculo: Ciclinas e CDKs
• Ciclinas –Proteínas cuja expressão varia de forma
dependente da fase do ciclo celular
• CDK (cinases dependentes de ciclina )
1‐ Proteínas cinase ‐ capazes de transferir radicais fosfato para seus substratos (vídeo)
2‐ CDKs são serina‐treonina cinases
3‐ Atividade de cinase das CDK depende de associação com as ciclinas
4‐ Eventos pós‐traducionais de fosforilação e defosforilação contribuem para a
ativação plena das CDK

Moléculas Reguladoras do Ciclo são extremamente
conservadas evolutivamente

Em camundongos, por exemplo, existem aproximadamente 20 enzimas CDK, mas somente
algumas regulam a transição entre as fases do ciclo celular (ex: CDK1, CDK2, CDK4, CDK6 e CDK7
A fosforilação de dezenas de substratos celulares por enzimas CDKs específicas em estágios
específicos do ciclo celular induz modificações funcionais dos diferentes substratos
Eventos como a desmantelamento da membrana nuclear, condensação da cromatina, indução
da replicação do DNA e montagem dos fusos mitóticos dependem das fosforilações mediadas
por diferentes CDKs
Alterações cíclicas na atividade das CDKs depende da associação dessas cinases com as
ciclinas. Ao contrário das CDK, cuja expressão não varia muito, a expressão das ciclinas muda
dependendo da fase ciclo celular.
• A transição entre as
fases do ciclo celular é
regulada por diferentes
complexos ciclina/CDK

• Como as células conseguem variar a quantidade das
ciclinas ?
Transcrição Gênica e Síntese de proteínas
vs.
Proteólise Controlada
Ubiquitinação e Degradação proteossomal

CDK1 regula Mitose e tem degradação
mediada pelo complexo APC (“anaphase‐promoting complex”)

Além da Expressão de Ciclinas (transcricional vs.
proteólise) a atividade das CDKs também é regulada
por eventos PÓS‐TRADUCIONAIS

Regulação Pós‐traducional da Ativação de CDK1
Wee1
CAK (MO15, Cdk7/CycH)
Cdc25

G1
S
Regulação Simplificada da Transição G1-S do Ciclo Celular
“Rb”
Entrada na
fase S
“Rb” = Rb, p107 ou p130
Ciclina/CDK
“Rb”
G0
(Pós-mitótica)
Reguladores “Upstream”
Proto‐oncogenes (MYC)
Ativação de vias de sinalização por
Mitógenos
Ciclina / CDK
Ciclina D1
Ciclina D3
Ciclina E
CDK4/6
CDK2

Proteínas Rb:
Supressores de Tumor que controlam o Ciclo Celular
Rb1 +/-
• RBL: Terceiro tipo de câncer
pediátrico mais comum
• Enucleação:
Perda de visão
• Somente ~10% de sobrevivência
quando ocorre metástase

Proteínas CKI (CDK inhibitor) Inibem as CDKs

G1
S
Regulação Simplificada da Transição G1-S do Ciclo Celular
“Rb”
Entrada na
fase S
“Rb” = Rb, p107 ou p130
Ciclina/CDK
“Rb”
G0
(Pós-mitótica)
CKI
Proto‐oncogenes (MYC)
Supressores de Tumor (p53/Arf)
Kip
p21
p27
p57
Reguladores “Upstream”
CKI
Ink
p15, p16
p18, p19
Ciclina / CDK
Ciclina D1
Ciclina D3
Ciclina E
CDK4/6
CDK2

Pontos de Checagem ou Checkpoints
É necessário um controle de qualidade da
replicação do DNA
A perfeição na divisão mitotica é crucial para
que os cromossomos duplicados sejam
corretamente distribuídos para as células‐filha
O ambiente está propício para que a célula
continue se proliferando e entre na fase S
novamente?

Mecanismos Moleculares de Checkpoints
regulam diretamente a atividade das CDKs

Técnicas de Estudo
Como determinar em que fase do ciclo celular uma célula está?
Análogos de timidina são incorporados ao DNA
na fase S do Ciclo
Timidina Tritiada 3 [H] Bromodeoxi-Uridina – BrdU
Iododeoxi-Uridina - IrdU
Citofluorometria

Uso de múltiplos marcadores de Fase S permite detectar
Re-Entrada no Ciclo Celular
P30 “p107‐single”
In vivo
BrdU
24 h
In vivo
intervalo
48 h
In vitro
3 [H]‐timidina
24 h

Comparando a Quantidade Total de Células Proliferantes
H3 3 [H]‐thymidine -thymidine
H3 3 [H]‐thymidine -thymidine
Rb
RB1
p27Kip1 p27Kip1 retinas
time (hr)
3 [H]‐thymidine
Proportion of progenitors
dividing at that
developmental stage
for each animal

Estudo da Cinética de Progressão no Ciclo Celular:
Saída do Ciclo Celular ou Aumento do tempo de Ciclagem?
(Exit or Lengthening? )
time (hr)
Proporção de células
proliferantes se
dividindo
Velocidade de progressão
no ciclo celular

Infecção por Retrovírus Incompetente de Replicação no
Estudo da Proliferação Celular (Expansão Clonal)
E14.5
retinas
Retrovírus Incapaz de Replicação
1
1
1
2
4 3
15
6
7
8
9
retina
10 dias de cultura
Clone de 9 células

Modelos de Estudo mais Modernos
Repórter fluorescente das diferentes fases do ciclo celular in vivo
Sakaue‐Sawano et al., 2008 Cell. 132(3):487‐98.
Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell‐cycle progression

Mais Informações
• Molecular Biology of THE CELL ‐ Cap 17
• http://www.hchs.hunter.cuny.edu/wiki/index.
php?title=19th_Century_Science
• http://www.nature.com/ncb/journal/v3/n1/fu
ll/ncb0101_e1.html