Fiskevaksiner og genteknologi – Internseminar - Bioteknologinemnda

Ansvarlig redaktør: Sissel RogneRedaktører: Grethe Foss og Jakob ElsterUtgiver: Bioteknologinemnda1. opplag: 10. april 2003, 300 eksemplarerPostadr.: Postboks 522 Sentrum, 0105 OsloBesøksadr.: Prinsensgt. 18, OsloInternett: www.bion.noE-post: bioteknologinemnda@bion.noGrafisk produksjon: Bioteknologinemnda v/Ole Johan BorgeBioteknologinemnda er et frittstående, regjeringsoppnevnt organ og ble første gang oppnevnt i 1991. Nemnda erhjemlet i Lov om medisinsk bruk av bioteknologi og Lov om fremstilling og bruk av genmodifiserte organismer.Foruten å være rådgivende i saker som angår bruk av bio- og genteknologi i relasjon til mennesker, dyr, planter ogmikroorganismer, skal nemnda bidra til opplysning og debatt. I sine vurderinger skal nemnda spesielt vektleggede etiske og samfunnsmessige konsekvenser ved bruk av morderne bioteknologi. Bioteknologinemnda har 21medlemmer og observatører fra seks departementer. Bioteknologinemnda har et budsjett på ca. 5,9 millioner kronerfor år 2001.

ForordEr en fisk å regne som genmodifisert dersom fiskenhar mottatt DNA-vaksine, eller er slik behandlingå regne som genterapi? Spørsmålet ble reist i enhenvendelse fra et forskingsmiljø til norsk forvaltning.Bioteknologinemnda anså dette som et svært viktigspørsmål, og at svaret kunne få store konsekvenserfor eksempelvis norsk oppdrettsnæring. Omfattendeavlsprogram og vaksinering av oppdrettsfisken, ergrunnpilarene for norsk oppdrettsnæring. Utviklingav hensiktsmessige vaksiner er derfor av vitalbetydning for næringen.Bioteknologinemnda besluttet å sette seg inn idagens vaksineproduksjon gjennom et internseminarsom ble arrangert i Namsos 5. september 2001. Nemndabesøkte VESOs anlegg teststasjon Vikan AkvaVet iAlhusstrand og Alpharmas vaksineproduksjonsanleggi Overhalla. Seminaret har dannet bakgrunn forBioteknologinemndas senere arbeid med reguleringav DNA-vaksiner. Foredragene fra internseminareter presentert i dette informasjonsheftet.Bioteknologinemnda takker foredragsholderne forgodt samarbeid som har muliggjort utarbeidelsen avinformasjonsheftet.Werner ChristieLederSissel RogneDirektør

Bioteknologinemnda: Internseminar 5. september 2001VESO Vikan AkvaVet holder til i vakre omgivelser påAlhusstrand ved Namsos.Arne Marius Fiskum fra Alpharma på Overhallaholder foredrag for Bioteknologinemnda.Omvisning på produksjonsanlegget for virusvaksiner.Anne Ramstad, stasjonsveterinær på VESO VikanAkvaVet holder foredrag om vaksinetesting.Foredragsholderne (fra venstre): John McDougall, Odd Magne Rødseth, Espen Rimstad og Esten Ødegaard.4

Fiskevaksiner og genteknologiInnholdInnledning....................................................................................................................................................................................................................6Anita Myrmæl, rådgiver, MiljøverndepartementetGenetic immunisation -”DNA Vaccines”.............................................................................................................................................................7John McDougall, seniorforsker, AlpharmaRekombinante, levende virusvaksiner.................................................................................................................................................................14Odd Magne Rødseth, forskningssjef, Intervet NorbioUlike risikomomenter ved bruk av rekombinante, levende virusvaksiner..................................................................................................19Espen Rimstad, professor, Norges veterinærhøgskoleRegulering av genmodifiserte organismer med hovedvekt på utfordringer knyttet til vaksiner og fisk...........................................25Esten Ødegaard, førstekonsulent, Direktoratet for naturforvaltning5

Bioteknologinemnda: Internseminar 5. september 2001InnledningAnita MyrmælRådgiver, MiljøverndepartementetMiljøverndepartementet, som har ansvar for utsettingetter genteknologiloven, er veldig glad for at nemndahar tatt dette initiativet, - og for at vi i forvaltningenblir tatt med rundt for å se på produksjonsanleggetog teststasjonen vi har vært på i dag. Vi har veldiggodt av å dra ut og se hvordan det faktisk foregår idet virkelige liv.DNA-vaksiner og rekombinante vaksiner er etganske nytt område, spesielt DNA-vaksiner. Vi harveldig mange spørsmål som vi håper å få svar på heri dag: helserisiko, miljørisiko, blir DNA-vaksinertfisk egentlig en GMO, og hvor lenge blir den daen GMO – og kan innsatt materiale inkorporeres ikromosomene og gå over i kjønnsceller selv om detinnsprøytes i somatiske celler? Dette er spørsmålsom svirrer rundt i våre hoder. Genteknologilovenregulerer jo helt klart genmodifiserte virusvaksiner,men DNA-vaksiner er mer i en gråsone. Loven åpnerimidlertid for regulering.Vi er her i dag for å lytte og lære, og forhåpentligvisfå svar på noen av spørsmålene våre. Esten Ødegaardfra Direktoratet for naturforvaltning vil si mer omhvordan vi har tenkt så langt. Her er det imidlertidmye som må drøftes videre.6

Fiskevaksiner og genteknologiGenetic immunisation - ”DNA Vaccines”John McDougallSeniorforsker, AlpharmaDNA vaccines is a very difficult subject to discuss, andI could spend days discussing it. Since I only have ahalf an hour, I will try to keep it to a minimum. What Iwould like to discuss within this half an hour, is what aDNA vaccine is, how it works, how you get it in, what itlooks like, how it’s produced, what the unique featuresof a DNA vaccine over regular vaccines are, what thelimitations are, a few examples of experimental DNAvaccines, and safety issues.Traditional vaccinesWhat is a DNA vaccine? Given the diverse backgroundof the people here, I want to start off a bit simple.What is a traditional fish vaccine? There are basicallytwo types. The first type of traditional fish vaccines isa whole bacterial or viral component – a bacteria or avirus: You isolate the pathogen from a fish, you growup the pathogen, kill it, and then you blend it togetherwith oils and other pathogens that also have beenkilled, and you give it to the fish for vaccination.A subunit vaccine or a recombinant subunit vaccineis basically the same type of thing. In both cases youisolate and grow the pathogen. In the case of subunitvaccines, you isolate the components from the killedpathogen, and you purify or partially purify them toget what is called a subunit, a part of the entity; or inthe case of a recombinant subunit vaccine, you cloneout specific genes that you want, you place them intoE. coli, in order to produce the pathogen protein, whichyou then purify. In either case you blend it into theformulation, and then you give it to the fish. That iswhat is done today with fish vaccines.What is it that we are looking for in the fish vaccine?We need the inactivated pathogen and the pathogencomponents to still be in a native structure, so itstill looks the way it does in nature; we want thesestructures, whether they’re proteins, lipids, or cell wallcomponents, to be presented to the fish so that theyproduce an immunological response; and we wantthis immunological response, whether an antibodyor another immunological response, to then protectthe fish when the live pathogen attacks.What are the problems with today’s vaccines? Wehave already got vaccines for many of the simplediseases. In some cases we have pathogens where wecannot get the pathogen or the pathogen componentsto produce the desired immunological effect. Youisolate it, you give it to the fish, and for whateverreason, it doesn’t give the right immunologicalresponse and therefore no protection. For thesediseases a different approach is needed; one of themis DNA vaccine.What is a DNA vaccine?What is a DNA vaccination? First of all, what it isn’t – itisn’t a golden bullet that will solve all problems. Thereare limitations, and there will be other approachesthat will be needed to take on other diseases, both infish and in the rest of the animals that are vaccinated,including us.A very long definition of DNA vaccination, orwhat is also called DNA-mediated immunisation:The direct introduction into the host organism tissuesof a plasmid DNA (or RNA) which is able to causeexpression of an antigenic protein directly withinthe transfected cells. That means, basically, that youplace the gene that you are interested in into theanimal and that the introduced gene will producethe protein that you want an immunological responseagainst, into a few of the cells in the fish, the cow, thepig, the chicken, or the human. In those few cells, thegene will produce the protein you want, in the correctstructure, and that production will then produce animmunological response, which will then give thatprotection to the animal.In many ways DNA vaccination resembles a viralinfection. A viral infection and DNA vaccinationboth use the biosynthetic machinery of the host tomake the protein. In a traditional vaccine you havebiological molecules that are ”dead”. They are takenup by the cell, but the cell does not use the biosyntheticmachinery to make the protein. The protein or the7

Bioteknologinemnda: Internseminar 5. september 2001other molecules are already there. How does itwork? If you look at a traditional killed or subunitvaccine, what you get is basically something calledinternalisation: When you have a typical cell withnucleus and endoplasmic reticulum, the cell takesinto itself the material of the killed bacteria, or of thesubunit components, i.e., ”dead” biological material.It’s digested by lysosomal processes into fragments.You then get the development of an immunologicalresponse based on this lysosomal system, in whichthe fragments are presented on the cell surface orexported, where it produces what is called a MHCII response, production of antibodies. It’s a specificresponse for doing that type of function.When one looks at live viruses, whether livepathogens, attenuated viruses, or DNA vaccines, themechanism is somewhat different. DNA vaccinesstimulate another part of the immunologicalresponse, where you get a vaccine plasmid insidethe nucleus of the cell. It produces a protein in thecell, which is then processed in the endoplasmicreticulum and transported to the cell surface, whereit is then presented as a MHC I system (as opposed totraditional vaccines, where you have MHC II), whichis a somewhat different immunological response. Itwould be the same whether it is a virus or whetherit is a DNA vaccine - when the virus infects the cell,the cell makes the viral proteins and that produces animmunological response.Administration of a DNA vaccineIn non-fish - cows, sheep, chickens, humans – theadministration is intramuscular (into the muscle),subcutaneous (under the skin), or in the mucus ornasal (nose spray, into the mouth). In fish, you alsohave intramuscular administration, intraperitoneal(into the peritoneal cavity) – that’s how one vaccinatesfish today: vaccinations today in fish goes into theperitoneal cavity, so the vaccine just washes aroundamongst the organs and gets absorbed from there– and immersion: you put the fish in a solution ofDNA vaccine where the fist would take the DNA up,generally through the gills, and of course swallowsome as well.Anatomy and production of a DNA vaccinevectorWhat does it look like? You have a circle of DNA.On that you have elements that one needs. The firstelement is what is called a replication origin, and thatis needed to allow the plasmid to grow in E. coli. Tomake a lot of this vaccine, you have to be able to growit and harvest it and the easiest place to grow it is inE. coli. So this element allows the plasmid to divideand replicate in an E. coli. The replication origin isspecific for bacteria, in fact only for a certain group ofbacteria. So, for example, that replication origin willnot allow it to grow in a eukaryote, for example a fish.Next, you have a gene for selection in E. coli. Generally,what is used today for experimental vaccines and inthe earliest stages of research, are antibiotic markers,antibiotics: ampicilin, kanamycin. Then you have thegene of interest, the gene that is going to produce theprotein that will give the immunological response.And you have two controlling elements: a promoterwhich controls gene expression when it is in the cells,and another regulatory sequence at the end calledpolyA, which has to do with the stability of geneexpression. Both of these are eukaryotic specific, sothat in bacteria these genes will not function. So youhave basically a system where, in bacteria, you can getreplicates of the plasmid, you can select for it and youcan grow up large amounts and harvest it, but the genedoesn’t work. When you stick it into eukaryotes, the8

Fiskevaksiner og genteknologigene will produce, but the plasmid can’t replicate.How is it produced? You have your gene, you stickit on your plasmid, you put it into bacteria, generallyE. coli, you grow it up, and then you purify it so it’s justa pure plasmid, clean of all other contaminants. Thenyou take it out and you vaccinate the fish with it.Results of DNA vaccinesI’m not going to show you a lot of results, but I amjust going to show you one example that shows youthe type of good results you can get. I could also showyou a lot of bad results, because as I said, this is nota magic bullet, this is a technique just like all othertechniques in vaccine development and everythingelse. Sometimes, with some organisms it works, orwith some genes it works, for some it does not. It takesa lot of time, and it is not a magic bullet.Typical good results (see figure): This is simplya little bit of data that shows intramuscular vs.intraperitoneal vaccination. The Y-axis shows howmany fish have died in the challenge. In the first threecases, you have vaccinated the fish with increasingamounts of DNA vaccine, in this case into the muscle;the fourth case is a control plasmid without your geneof interest injected into the muscle, where you get50% dying, whereas with a DNA vaccine you havevery few dying. In the fifth case, you have inactivatedvirus injected into the muscle. Normally in a vaccineyou do not inject inactivated virus into the muscle, youformulate it in a proper formulation and it goes intothe cavity here. So this just shows you what happenswhen you have an inactivated virus: again, it hasvery little protection. And the sixth case is if you justtake naked DNA and put it into the peritoneal cavity,again without formulation, without oils, withoutanything else: you get some protection, but not asgood as by putting it into the muscle. And this is quitecommon, both in fish and in mammals, that one ofthe best methods for delivering vaccines today is stillintramuscular.Unique features of DNA vaccines- No risk for infection, there is nothing alive.- You raise antibodies or an immunological responseagainst the native forms of the proteins.- You raise T-cell response, which is again animmunological response- You can raise long lived responses; again with fish,we are talking about fish that are alive for two years,so we don’t need a vaccine that lasts 40 years, we needa vaccine that lasts 2 years.- Good stability at low and high temperatures. As apure piece of DNA, DNA is very stable, you can do alot with it and nothing happens to it.- And of course it is very easy to use a combination ofvaccines for a combination of proteins.Limitations of DNA vaccinesI have talked about a gene of interest. Basically, themajor limitation to DNA vaccines is that it is limitedto proteins. Often the best immunological responseagainst a pathogenic bacterium is in fact raised byvery complex molecules, for example a protein thathas been modified and has extra sugars and all sortsof different modifications put on it. In the pathogenicbacteria, there are many gene products responsiblefor modifying the components.These compleximmunogenic molecules can be easy to isolate; eitheryou can use a whole bacteria, or isolate componentsof the cell wall, for example, and that componentwould give a very nice immunological response. But toprovide the cell with the same complex immunogenicmolecule, in the form of a DNA vaccine, you wouldhave to stick a huge number of genes into the animalcell and you would have to hope that the animal cellgene expression machinery will work properly withall of these bacterial genes, turn them on and off at theright times and at the right levels, so that the animalcell will actually make the compound you are lookingfor. This would be a tremendously complex problem,scientifically, and probably will never be possible.So the major limitation for DNA vaccines, is thatthey are limited to a protein. If the major or the onlyimmunological response is raised against something9

Bioteknologinemnda: Internseminar 5. september 2001that is not simply a protein – it could be a modifiedprotein, modified naturally by the cell, or it couldbe very complex and involve lipids and things– it probably will not work. And that is one of thereasons why I say it is not a magic bullet. There is alimitation.Examples of experimental DNA vaccinesSome of these are in humans: You have malaria,mycoplasma, and a lot of viruses, such as rabies,influenza, AIDS, hepatitis. In fish there are a numberof experimental DNA vaccines, some for bacteria(Renibacterium, Aeromonas) and some for viruses(IHN, VHS, IPN, ISAV, SPDV).Safety issuesI will cover a number of safety issues. A lot of them haveto do with DNA vaccines in general, not necessarily fishvaccines. But the type of documentation is identicalfor all species, and of course have to be consideredalso with fish. The guidelines and documents that wehave to follow is:- A technical report by WHO (Technical report seriesNo. 878, 1998 – ”Guidelines for assuring the qualityof DNA vaccines).- A Note for Guidance from the European veterinaryauthority (Committee for Veterinary MedicinalProducts, CVMP), which is the major European sourcefor guidelines: ”DNA vaccines non-amplifiable ineukaryotic cells for veterinary use”.- An American-based Note for Guidance on DNAvaccines, probably the original Note for Guidance.One of the problems is that each note for guidance isa little bit different from the next. What the Americanswould like is a little different from what the Europeanswould like, and that makes things a little bit morecomplex, because then to have a totally documentedDNA vaccine, you have a lot more documentation todo.Basically, all the same principles apply toDNA vaccines as for any other vaccine in termsof documentation. So you don’t get by any easier.Everything that we have to document in order tosubmit an application to sell a “traditional” vaccinehas to be done for a DNA vaccine as well. And forthose of you who have never seen an applicationfor a vaccine, some of the vaccines that we haveapplied for permission to sell in Norway requires alot of documentation. So you don’t get any less workby developing DNA vaccines, as a matter of factyou get more, because you have additional safetyrequirements.Unfortunately, the guidelines for DNA vaccinesconsist of a mixture of the requirements found in all theexisting guidelines - the guidelines for recombinantDNA-derived vaccines, subunit vaccines, inactivatedviral vaccines, and live attenuated viral vaccines. Thiscreates a lot of confusion. The regulatory authoritiesand the people that designed the guidelines clearlyshow that basically we don’t really know where we sitwith DNA vaccines yet.These are safety requirements specific for DNAvaccines:- Distribution of DNA following vaccination: Wheredoes it end up in the organism, the fish or thehuman? The distribution is dose dependent and routedependent, and that has to be documented. You haveto use the most sensitive methods available, and dotime-course studies: What happens over a period oftime? If the DNA is everywhere in the body in thefirst half-hour but six months later, you can’t find itanywhere, that is something very important. If youstill find it after five years, that is something to worryabout.- Integration and production of tumours. Again,integration of the DNA into the genomic backgroundof the fish, the human, or the cow.- Reproductive toxicity. This covers the integrationof DNA into the genomes within the gonadal tissue,the sperm and eggs. Where does it end up, how longis it there?- Examination of immunological functions: Thereis an interest in knowing what is going on from animmunopathological reaction point of view: Whathappens? How is it working? The production of anti-DNA antibodies is specific for DNA vaccines, becauseit’s anti-DNA, but essentially no matter what vaccineyou use and what component you use, you still haveto look at the immunological response. You don’t wanta bad immunological response.- Cross-reaction. Does the DNA vaccine have an effecton normal functions within the cell? For example theproduction of cross-reactive antibodies.So in summary, for the interest of the Bioteknologinemndahere, I think the important points are:- Integration into the chromosome, either somaticand germline chromosomes; what the integrationPå ekskusjon til VESO Vikan AkvaVet.10

Fiskevaksiner og genteknologican lead to: for example, uncontrolled cell division,or inactivation of genes that you need.- Vertical transmission, passing it on to the nextgeneration.- The immunopathological reactions: unwantedbiological effects, for example the co-expression ofcytokines. This has to do both with DNA vaccines ingeneral and with putting in other proteins of interestto express at the same time. This is really no differentfrom the documentation required for a normal vaccinewhen you add in multiple components.Points to considerProbably the most important points to consider herecover three aspects:1. Source of the componentsThere are no components included without a reason.What are the standard control elements used in labDNA vaccines, very early in research? All vectors willcontain a promoter element and a polyA element. Inthe most commonly used vectors in “early stagereasearch”, the promoter’s origin is actually a virus,related to the production of cancer, CMV. The polyAthat is commonly used, again because it is a typicalplasmid that one can buy right of the shelf, is actuallya controlling element from the gene for bovine growthhormone (BGH). Both of them are part of a standardplasmid, and both of them are of course things thatwe have to think about if we are going to make a DNAvaccine. Now, from a scientific point of view, theseelements are simply controlling elements, they haveno risk over similar control elements from other genes.If instead of a strong promoter like CMV promoter, Itook a strong promoter, a strong controlling elementfrom a fish, from an insect, from a moose, or from apenguin, basically there is no more danger in that thanthere is from the CMV. If I took a polyA from a penguininstead of from the bovine growth hormone gene, thereis no more danger in using that than there is in usinganything else. Because they are controlling elements,they have really nothing to do with specifically thevirus or the gene, they simply control the expressionof what is in between these two elements. An analogywould be that if you buy a steering wheel for a car, forexample from a Mercedes-Benz, and you put it on aVolkswagen, it does not change the Volkswagen into aMercedes-Benz – it is still a Volkswagen that you cansteer with the Mercedes-Benz steering wheel.The fact that a gene is controlled by the CMVpromoter doesn’t make it a virus, it is simply acontrolling element that has been isolated from anorganism. But, public opinion, regulatory opinionand perception mean something as well. And so atleast from my point of view, and from my company’spoint of view, and I would imagine from the point ofview of everybody that is looking towards buying orselling a DNA vaccine, no mammalian based or viralbased elements are needed in today’s or tomorrow’scommercial DNA vaccines, apart from those genesthat we are using to produce the immunologicalresponse. Scientifically, that CMV promoter is nodifferent from a promoter from a penguin, butbecause of regulatory worries, and because of publicperception that you have a ”something DNA froma virus that causes cancer”, we will not use it, andthere is in fact no need to use it. And I don’t thinkthere is a respectable company that will ever comeout with a commercial DNA vaccine that will havethese elements on it.2. Antibiotic resistance and selection markersFrom research done in humans and human models,which is basically monkeys and mice, there has beenno documented evidence of a transferred resistancegene due to a DNA vaccine. There are limitations inthis research: Virtually all the work has been done inmice, monkeys, and to some degree in humans; andit has been done on intramuscular vaccines, whereyou take the DNA and squirt it into a muscle. Sothe number of animals that have been looked at arelimited, and the number of experiments that havebeen done to look at it are limited. But there has beenno documentation of transfer of a resistance gene toa human or to a bacterium. As I said, this is generallybased on intramuscular injection of humans andhuman models. In fish, we haven’t seen it either, butagain the number of experiments are small.NN: But is this a scientifically relevant argument,since what you are scared of is an idiosyncratic eventthat may take place very seldom, but may be seriouswhen it takes place? So lack of significant evidencedoes not prove anything, since what you are lookingfor is the very seldom event that may happen sinceyou have so many vaccinations?McDougall: I agree, but again, I refer back toperception as well. And the question comes up: Whatabout this resistance? The question is somewhat moreof interest with fish, because of the routes by whichyou can vaccinate. If you do an immersion vaccinewith naked DNA, then you have a container full ofwater that has floating DNA around it with thesemarkers. Then you have to make sure that you simplydon’t take that DNA and dump it into the sea afteryou have vaccinated. So of course, it depends on theroute. What I am saying right now is that we don’thave any evidence that suggests that there is transferof resistance genes. But few animals have been lookedat. Both the FDA and USDA, who have done a lot ofexperiments themselves, accept these findings. Ofcourse, that means little in Europe because other thanproduction facilities that they can control, that doesn’tmean so much, but it does mean that they accept thatin fact there has been little transfer.11

Bioteknologinemnda: Internseminar 5. september 2001NN: Which resistance genes do they accept?McDougall: You anticipated. For the most part,they are happiest with the kanamycin/neomycin gene.Drug resistance in E. coli would be to kanamycin, thesame gene works as drug resistance to neomycin ineukaryotes. So it is a drug resistance that works inboth, a gene that works in both. That is what theywould prefer to have it. But basically, every singlecase is looked at separately. If there is a reason whyyou have a different gene in your vector, then theyare willing to listen to the reason. They would prefernot to have one in there, certainly they would prefernot to have an antibiotic gene in there where that is aproblem for example within hospitals– not becausethere is any evidence that shows it spreads, butsimply because of safety perception. Again: there isno evidence that this thing spreads, – yet.3. Fate of DNA after injectionIn fish, a lot of research has been done on whathappens to the protein being produced. Not theplasmid, not the DNA, just the protein being produced.And it is very clear that it is spread throughout thefish. It is spread through the gills, to the liver, and itdisappears after a while (the number of days you lookat depends upon the experiment). With intermuscularvaccines, it’s the same thing: the number of proteinsis high in the muscle, and then goes down, and theproteins disappear after a while. That is the proteinitself. Much less has been done on localisation of theDNA in the fish. Not that people have not tried. Butgenerally no one has been able to find it after a periodof time, and a negative finding does not always meanthat it is not there.In mice and guinea pigs, a lot of work has beendone, where they have put in a huge amount of DNA.10 13 DNA copies were injected, they extracted materialfrom the whole mouse over a period of time and foundthat at six weeks you can find a free plasmid at theplace where they injected, and a very small amount atthe lymph nodes. No integration in the chromosomeshas been found. At six months, much less DNA wasdetected at the injection site and virtually nothing atthe lymph nodes; again nothing was found in anyother tissues. The asset they use is very sensitive, withsensitivity of 1 copy pr. microgram of DNA, whichis a 1000 times lower than spontaneous mutationfrequency.Just a review of what we have looked at. Thereis no integration at six months or earlier. A lot ofwork has been done on it, and a lot has been doneby FDA/USDA. They are also surprised, but theyalso say they can’t find anything. The DNA plasmid,the DNA vaccine, enters only a few cells for antigenproduction. That’s something to remember. It’s notlike other aspects where you want it to enter a lot ofcells and stay. It enters some few cells at the site ofentry, depending upon where it is introduced, andthese cells produce an antigen for a short period oftime, and the cells are eventually eliminated. You getsome DNA being distributed for a short period aftervaccination, but virtually all plasmid DNA appearsto be degraded extra-cellularly. Very little of the DNAgets into the cells.NN: How do you control which cells itintegrates?McDougall: It doesn’t integrate at all. But as towhat cells the DNA comes in to: If you put it intothe muscle, you will actually be able to see alongthe line of injection those few cells the DNA enters– you can actually see it histologically when youlook under the microscope. You will see that there issomething different about them, they are producinga huge amount of protein. Again, the reaction is thatthe cell is producing a huge amount of protein whichwill create an immunological response against thatprotein. Which is again different from for examplegene therapy, where an immunological reactionagainst the gene that you are trying to put in isthe last thing you would want. No integration intochromosomes has ever been demonstrated in anyproper experiment. Again, these are case-by-casestudies by the FDA/USDA or EU; and not enoughhave applied, so they look at every single case whenyou make an application.Other questionsTwo other questions have arised:1. Is DNA vaccination and gene therapy the samething? Yes and no. In both, you have a gene of interest,which you try to put into some cells. On the one handwith vaccination, you want the cell to produce a lotof protein, which causes a reaction immunologicallywhere you will get an antibody response or animmunological response against that protein thatwill then be ready to wipe out that protein againwhen they find it on a pathogenic organism, whenit enters the body. With gene therapy you want theopposite. You want the gene to basically hide itself and12

Fiskevaksiner og genteknologiproduce the protein of interest, so that it just simplydoes its job and there is no immunological reaction.With gene therapy you want perhaps integration,depending on what you are looking for; you may evenat some point want it integrated into the sperm andegg cells – that again is dependent on what is beingdone. With vaccination, you want it short-lived, youdon’t want integration, and you basically want to getit in: it produces, it get’s destroyed and then you’refinished with it.NN: How do you make your gene therapy constructto get the DNA integrated? You said that one wasmeant to be integrated and the other was meantnot to be integrated. How do you make one becomeintegrated and the other not?McDougall: I think the natural state is in factthat they don’t become integrated. So it is more of aquestion when you want gene therapy and you wantthe gene integrated, how you are going to trick it todo it. It probably has a lot to do with the vector, thesystem that surrounds the gene. Often now they areusing things based on viruses, which are very cleverat injecting themselves into the genome, and thereforethat will be your way of delivering it into the genome.Normal plasmids without these elements don’t getinto the chromosome, which is in fact surprising usall, but a lot of work has gone into that, especially inthe human and human model systems.2. Is a DNA-vaccinated fish a GMO? This is avery difficult question, to which I have no answer. Itdepends on your defintion of a GMO. As a scientist, Idon’t think you can call it a GMO. But it is not I whomakes the decisions. Is it a GMO? I have about akilogram of foreign DNA in me now. Am I a GMO? Theforeign DNA I have in me will be gone within a coupleof days or less. So am I a GMO? I don’t think I am. Isa fish or an animal that get’s a DNA vaccine, whichwill be gone over a shorter period of time, a GMO?I’m not sure. If it integrates, that’s something different.Unfortunately, I can’t say one way or another. But as ascientist, not having anything to do with the company,but as a scientist, I have a hard time explaining thatit’s a GMO, by its nature.NN: Is there full consensus amongst scientists, thatwhat a GMO is, is not a scientific question?McDougall: No, I think that you will find some thatsay maybe it is a GMO, and some that say it is not. Idon’t think it is any better than that.13

Bioteknologinemnda: Internseminar 5. september 2001Rekombinante, levende virusvaksinerOdd Magne RødsethForskningssjef, Intervet NorbioSom introduksjon vil jeg gjerne se kort påpremissene bak en eventuell introduksjon ogbruk av rekombinante, levende virusvaksiner iakvakulturen.Jeg vil snakke veldig kort om markedet forfiskevaksiner og strukturen i industrien, og så brukelitt mer tid til å se på dagens teknologi: Hvilkebegrensninger har den, og hvilke utfordringer har vi?Er det behov for DNA-vaksiner (som John McDougallomtalte i sitt foredrag), og for rekombinante, levendevaksiner?Markedet for fiskevaksinerEt spørsmål som det er viktig å ha i mente når visnakker om å kjøre i gang store, kostbare og langsiktigeforsknings- og utviklingsprosjekter for å introdusereny teknologi, er: Hva er markedet for fiskevaksinen?Verdensmarkedet for fiskevaksiner er på ca. 300-350 millioner NOK. Det tilsvarer et medium stortprosjekt innen humanmedisin. Men sammenliknetmed andre dyr, der det totale dyrevaksinemarkedeter på 21 milliarder, så er det forsvinnende lite. Norgestår i en særstilling mhp. fiskevaksiner med et markedtilsvarende 40-50 % av det totale verdensmarkedet.Likevel er det, hvis vi ser på industrien i dag,klart at det er et langt større potensial enn de300-350 millioner som utgjør det eksisterendevaksinemarkedet. Fremdeles dør det mange fisk.For 10 år siden hadde en alminnelig oppdretter iNorge 35-40 % tap fra fisken ble overført til sjøentil slakting. Den situasjonen er fremdeles realiteteni mange andre akvakulturindustrier. Så det eråpenbart et stort potensial. Produksjonen av fisk ogskalldyr er på nesten 20 milliarder tonn i dag. IfølgeFAOs prognoser, er produksjonen om 10 år oppe i100 milliarder tonn, mens de andre dyreartene somde store veterinærfarmasøytiske firmaene i dagbaserer sine produkter på i beste fall vil flate ut. Slikeprognoser har ført til en sterk posisjonering blant destore aktørene innen veterinærmedisin og oppkjøpav de små universitetsbaserte og forskningsbasertevaksineselskapene som henvender seg til akvakulturen.Pr. i dag er alle sammen blitt oppkjøptog integrert i de ti største dyrehelseselskapene.Konklusjonen på dette er at de som driver medfiskevaksine i dag, utvilsomt har finansiell ryggrad.De har kunnskap og teknologi. Alt som må til for åimplementere nye teknologiplattformer er på plass– spørsmålet er om viljen er der og om det koster merenn det smaker å kjøre løpet.Hvilke typer fiskevaksiner finnes i dag?Jeg skal bruke en del lokale eksempler. Infeksiøslakseanemivirus er det ”hotteste” viruset ilakseindustrien og det var et særnorsk fenomenveldig lenge. Sykdommen ble første gang påvisttilbake i 1984-1985. Forskningen kom i gang påslutten av 1980-tallet. Først i 1994 ble viruset påvistog identifisert ved hjelp av elektronmikroskopi,det vil si at sykdommen ble assosiert med viruset.Identifiseringen av ILA-viruset kostet 30 millioner iFoU-midler. Så gikk det ytterligere 3 år før miljøeneved Veterinærhøgskolen og Veterinærinstituttetklarte å etablere cellelinjer slik at man fikk dyrketopp viruset og dermed også verifisert at ILA-virusetvar kausal agens til sykdommen.Først når du har klart å dyrke viruset, begynnerkaskadereaksjoner å skje. Pr. i dag er de flesteav gensegmentene identifisert, sekvensert ogpatentert.14

Fiskevaksiner og genteknologiDette er også en litt “tragisk” historie: ILA-virusetvar et særnorsk fenomen. Fram til 1996-1997 var detingen andre land som hadde oppdaget det. Det varkun Norge som hadde det. Norske forskere gjordeall grunnforskningen og utviklet alle nødvendigeforskningsverktøy som skulle til for å dyrke virusetog for å isolere og karakterisere genene. Så komspredningen. Canada og UK fikk det, og dette satteselvfølgelig i gang forskningsaktiviteter i de landenemed isolering og sekvensering av gener, og pr. i dagvet vi vel egentlig ikke hvem som har patentrettigheterpå de ulike genene, men de fleste av dem er i alle fallikke på norske hender.De fleste av genene i ILA-viruset (se figur) er nåidentifisert og karakterisert, og vi vet hvilke proteinerde koder for. Kanskje mangler esterasen. Det er detsiste som bør komme i boks.OK, la oss utvikle en vaksine. De metodene somtradisjonelt har vært brukt, og som fremdeles er i brukfor ILA-vaksine, er å basere vaksinen på inaktivertevirus. Man dyrker viruset, inaktiverer hele virusetved hjelp av formalin og bruker det som vaksine;eventuelt renser du opp de vesentlige komponentene,strukturelle proteiner på overflaten, som så benyttessom aktive komponenter i den ferdige vaksinen.ILA-virus er et ortomyxovirus, et influensalignendevirus, og her finnes det mye erfaring og tidligere arbeidgjort på både mennesker og dyr. Problemet meddenne måten å lage vaksine på er prisen. Fremdelesi år 2001 blir mesteparten av influensavaksineprodusert på denne måten: Man inokulerer levendekyllingfostre med viruset, så høster man det etter atviruset har vokst der en uke eller to. Deretter rensesvirusløsningen og eventuelt separerer de proteinersom er vitale bestanddeler i en vaksine. Men detteblir dyrt. 200 kroner for en dose influensavaksine harvi i den vestlige verden råd til å investere i egen helse,men en oppdretter har ikke råd til å betale mer enn1-2 kroner per vaksinedose.En modell av ILA-viruset.Rekombinante, inaktiverte produkterDet som også er blitt benyttet og kommersialisertinnen fiskevaksine, er å bruke rekombinante proteinerder man bruker rekombinante organismer somprodusenter av proteiner, men der endeproduktet erinaktivert. Man har per i dag en rekke slike systemertilgjengelige. E. coli er den klassiske som ble benyttetfra begynnelsen av. Det som er ulempen med å benytteprokaryote systemer (E. coli) er at den ikke har sammereguleringsmekanismene som eukaryote systemer,og du får som oftest ikke den rette konfigurasjon påendelig produserte proteiner. De blir også produsertintracellulært, noe som krever bruk av kostbarrensemetodikk.I dag er det utviklet en rekke ekspresjonssystemersom i utgangspunktet muliggjør produksjonav proteiner som langt på vei mimikerer denopprinnelige struktur og funksjon. Man har foreksempel ulike gjærsystemer. Hepatitt-B-vaksinen tilmennesker blir produsert i gjær. Det finnes også andreproduksjonssystemer der man bruker baculovirus oginsektceller.Vi har brukt en type baculovirussystem til åprodusere hemagglutinin fra ILA-virus. Systemethar evnen til å produsere store mengder avhemagglutinin-subenhetene. Denne metoden blirofte brukt i innledende forskningsfaser der det ersnakk om å drive funksjonelle studier for å verifisereat det genet vi jobber med virkelig er det vi leter etter.Og HA-genet er sannsynligvis ekstremt vitalt medhenblikk på vaksine mot ILA-viruset.Hvor godt fungerer dagens fiskevaksineteknologi?La oss se på den teknologien vi har tilgjengelig i dag,og i hvilken grad produkter basert på tilgjengeligteknologi klarer å tilfredsstille behovet som er inæringen. Målet med å vaksinere er å ”trigge” enbeskyttende immunrespons og lure fisken til å tro atdet her er en infeksjon. Så lenge man presenterer etinaktivt antigen så mobiliserer ikke fisken de typerresponser som ofte er nødvendig for å oppnå en høyog varig beskyttelse. Inaktiverte antigener klarer aldriå mimikerer det riktige opptaket, prosesseringenog presentasjonen som gjør at immunsystemetmobiliserer viktige deler av immunforsvaret ogda hovedsakelig den cellulære immunresponsen.Dette er ofte nødvendig for å oppnå beskyttelse motintracellulære patogener. En god del av virusene,samt en rekke andre bakterielle patogener sommykoplasma, tuberkulose og rickettsia krever encellulær respons. Det er en god del sykdommer ogsåinnen akvakultur der vi med dagens teknologi ikkehar muligheter til å utvikle effektiv vaksine.De fleste inaktive vaksiner krever adjuvans, det vil sihjelpestoff som bidrar til å mobilisere immunsystemet15

Bioteknologinemnda: Internseminar 5. september 2001og dermed øke immunresponsen. Bruk av adjuvanserbidrar til begrensninger på hvordan du kanadministrere vaksinen. Pr. i dag er det kun injeksjonsom kan brukes for å administrere vaksiner med dentype adjuvanser som benyttes innen akvakultur. Viønsker oss selvfølgelig enten oral administrasjon ellerimmersjon. En annen viktig ulempe med denne typevaksiner er risikoen for bivirkninger. I tillegg er prisenselvfølgelig også et problem. Det er dyre produkter.Vi trenger mye antigen. Som oftest må vi rense dem,og adjuvans er ikke billig.Levende vaksinerLa oss se hva levende vaksiner har å tilby. Medinaktiverte virus og subenheter er man i dag i de allerfleste tilfeller avhengig av oljebaserte adjuvanser somkun kan administreres ved interperitoneal injeksjon,mens levende virus kan gis som dypp. De er infektive,dvs. at de kan finne sin naturlige vei inn i dyret vivaksinerer, også ved oral administrasjon. Levendevaksiner muliggjør også mye lavere doseringer. Meden typisk inaktivert agens må man ha mellom en ogti milliarder inaktive virus pr. dose. Du kan gå minst1000 ganger lavere når du har attenuerte, levendevirus. Det er ingen behov for adjuvans. Prisen blirlavere, og kanskje det viktigste er at man får en langtmer naturlig og autentisk stimulering med levendevaksiner, der man ”trigger” alle de immunologiskearmene som bidrar til beskyttelse, både det humoralemed antistoff og det cellulære. Dermed har dumuligheten til å oppnå beskyttelse mot intracellulærepatogener. Dette er ikke noe nytt. Levende vaksinerbrukes allerede i dag.I fisk finnes det en type virusvaksine som erkommersielt tilgjengelig, og det er IPN. Til andre dyrfinnes det ca. 100 ulike vaksiner, og 60-70 % av disseer levende. Også på mennesker er ca. halvparten avvaksinene levende, så her har vi lang erfaring.Hvilke typer levende vaksiner har vi? Den førstemåten å framstille levende vaksiner på er å gå ut ogfinne naturens egne attenuerte virus. Det er denklassiske metoden, og det er der begrepet vaksineegentlig stammer fra, da Jenner for 200 år sidenbegynte å bruke kukopper til å vaksinere menneskermot kopper. Ku heter vacca på latin – derav ordetvaksine. Det er også gjort lignende forsøk påfiskevirus, der man finner virus på andre arter og serom det virker.Den andre måten å framstille levende vaksinepå er å modifisere det ytre miljøet for å framelskemutasjoner og selektere for de egenskaper du ønsker.Det klassiske er å passere viruset ditt gjentatte gangeri dyr eller i cellelinjer i dyrkningsmediet. Dette erogså forsøkt i fisk. Klassiske eksempler som de flestekjenner til, er tuberkulosevaksinen BCG, som ble kjørtgjennom et gallemedium i 12 år. Det er 70 år tilbake,og vi bruker fortsatt vaksinen. Det er åpenbart at dethar foregått genmodifisering i løpet av disse 12 årene,men det er en veldig empirisk måte å gjøre det på.En annen måte å lage levende vaksiner, er åselektere for temperatursensitive virus. Pr. i dag erinfluensavaksinene våre splitta, inaktiverte vaksiner.Neste generasjon blir sannsynligvis kuldeadaptertestammer, og det er like enkelt som det er genialt. Vedå benytte selekterte virus stammer som ikke kanreplikere ved 37 grader, så kan infeksjoner etableresi øvre respirasjonstrakt. Du kan bruke nesespray,og infeksjonen vil aldri etablere seg systemisk ogforårsake sykdom.Rekombinante, levende vaksinerTil slutt kan man lage levende vaksiner ved hjelp avrekombinant DNA-teknologi. Det er to hovedgrupperher. Enten går man inn og genetisk attenuerer viruset,for å lage en såkalt gendeletert vaksine. Dette haren stor fordel innen sykdomsbekjempelse hos dyr,nemlig at den kan brukes som markørvaksine. Nårman sier markør høres det som noe man legger til,men det man gjør her, er at man deleterer, tar ut etgen eller deler av et gen, som da ikke produserergenproduktet sitt. Markøren vil da være tilstede ivilltypeviruset, slik at man kan diskriminere mellomen vaksinert og en smittet fisk. Det er et viktig prinsippog kan da kombineres med eridikasjonsstrategier, dvs.strategier for å utrydde sykdomsorganismer. Det erutviklet en rekke nye produkter av den typen påveterinærsiden.Den andre typen rekombinant vaksine er omtrentlik, men du bruker da såkalt vektorvaksine, dvs.at man bruker levende, ikke-patogene (naturligeikke-patogene eller attenuerte) mikroorganismersom er rekombinert, og introduserer da et fremmedgen, som blir uttrykt. Det er to hovedprinsippersom er brukt for å konstruere disse rekombinante,levende vaksinene. Det ene er basert på prinsippetom homolog rekombinering. Man tar utgangspunkti villtypeviruset, som på forhånd er karakterisert,sekvensere og har fått kartlagt funksjonene til de ulikegenene. Man identifiserer et ”target”-gen som har en16

Fiskevaksiner og genteknologifunksjon koblet opp mot virulens eller med betydningfor patogenesen. For å lage en mutant, benytter manet ”plasmid construct”, der hoveddelen av ”target”-genet, er homologt med villtype. Ved å introdusereplasmidet i samme celle, får man frigjøring av DNAog en orientering som tillater overkryssing. Dermedkan den modifiserte genbiten på plasmidet skifte plassmed den opprinnelige plassen der du har stor gradav homologi.Her er et eksempel på hvordan dette kan brukes.John McDougall snakket om malaria. Malaria har enveldig kompleks livssyklus, og har en antigen-makeupsom gjør at immunsystemet alltid er for sent ute.Her har man ved hjelp av homolog rekombinasjoni første fase deletert 6 ulike gener, så har man fåttviruset skikkelig attenuert, og i annen omgang harman introdusert 7 nye gener fra malariaparasitten.Dette er et ”construct” som har nådd fase II i kliniskeutprøvinger.Den første levende vaksinen basert på rekombinantDNA-teknikk som ble introdusert på markedet, i1986, var mot pseudorabies. Det er et herpesvirus.Dette eksemplet viser at metoden ikke er empirisk.Her må en vite nøyaktig hva man gjør. Basisenfor denne strategien var at det var identifisert etgen som koder for thymidine kinase, som er heltvitalt for at herpesviruset skal kunne replikere inerveceller. Når en gikk inn og deleterte det genet,kunne viruset fremdeles replikere og kunne til og medinfisere nerveceller, men det kunne aldri replikere inerveceller. I dette tilfellet utviklet grisen en veldiggod beskyttelse.Jeg tar med et annet eksempel, der det er snakkom utsetting. Vaccinia-vektoren, eller -viruset, er noket søkt tilfelle for det er et helt optimalt vektorvirus.Det er beskrevet 150 ulike rekombinanter basert pådet vacciniaviruset som vektor. I dette eksempletbruker vi den vaksinen som vektor og introdusereret glycoprotein fra ulike rhabdovirus, i dette tilfelletrabiesvirus. I 1990 ble det laget et forsøk medfeltvaksinasjon av rev mot rabies, basert på at manla vaksinen inn i 25 000 åter, fordelte det på 2 200 km 2i Belgia. Det var et pølseliknende åte som var tilsattattraktanter.Det er helt åpenbart at den vaksinasjonsstrategienvar ekstremt effektiv. Rabiessmittet rev forsvanttidligst, mens effekten hos husdyra i området forsvantsom en funksjon av at den viktigste smittebæreren,reven, var blitt vaksinert. Av den typen rabiesvaksinefinnes det en rekke produkter som er kommersielttilgjengelige i dag.det et litt større problem. De fleste fiskevirus erRNA-virus. Det finnes nå teknikker som er veldiginteressante og som kan klare å mutere helt spesifikkegen på RNA-virus. Et arbeid vi holder på med gårut på å lage mutanter av IPN-virus der spesifikkebasepar, helst på to plasser, byttes ut. Disse mutantenekan da brukes som attenuert vaksine. Dette er tingsom er tidlig i utviklingsfasen, og det er fremdelesen lang vei å gå.Hvis vi oppsummerer, er majoriteten av dagensfiskevaksiner basert på tradisjonell bioteknologi,altså fermenteringsteknologi og inaktivertehelagensvaksiner. Den første vaksinen basert pårekombinant DNA-teknologi kom i 1995, og er eninaktivert subenhetsvaksine mot IPN.Det er status i dag, men det er åpenbart at det hososs, hos John McDougall i Alpharma og hos alle andrevaksineprodusenter, er mye aktivitet. Aktiviteten gårpå å ha nær kontakt med basale forskningsmiljøerog drive egen ”in house” aktivitet for å bygge oppteknologiplattformer. Vi kan ikke tillate oss å sitte pågjerdet. Vi må ha plattformen på plass, som basis forfremtidig produktutvikling.Jeg tror det vil skje mye også når det gjelder vaksinermed inaktiverte virus, og på adjuvansfronten. Du kan,fremdeles i innesluttet bruk, uttrykke de antigenesubenhetene fusjonert med såkalte T-celle-epitoperog dermed kan du teoretisk sett, og også i praksis hardet vist seg, også få med den cellulære armen, selvom det er en inaktivert proteinbasert vaksine. Mendet du aldri kommer forbi, tror jeg, er at skal du haet alternativt administrasjonssystem, skal du unngåå måtte injisere all fisken din, da vil dagens teknologivære sterkt begrensende for hvilke produkter som kankommersialiseres. Og med hensyn til utfordringenevi har i marin fisk, torsk og kveite, er det åpenbart atder må du vaksinere før fisken blir så stor at du kaninjisere den. Så skal vi klare å utvikle vaksiner somkan kontrollere de sykdommene de fiskene har, er nyteknologi nødvendig.Til slutt, et autentisk bilde fra en artikkel i 1798,da Jenner begynte å vaksinere med kukopper. Deter helt klart at når du prøver å introdusere nye ting”Reverse genetics”En annen metode for å lage vektorvaksiner er ”reversegenetics”. Homolog rekombinasjon går veldig bra påDNA-virus og på bakterier, men med RNA-virus er17

Bioteknologinemnda: Internseminar 5. september 2001og ikke alle er helt innforstått med hva som foregår,så får du en opinion og en reaksjon. Med henblikkpå genteknologi så har vi utvilsomt kommet skjevtut, takket være noen “sprø italienere” og Monsanto,som kanskje har misbrukt patentrettigheter oggenteknologien til å oppnå makt over forbrukereni stedet for omvendt. Jeg tror at det som gjenstår, erat industrien og forskningen må ut fra laboratorieneog prøve å gi et mer nyansert bilde av hva de drivermed så ikke disse sensasjonsscenariene får allmedieplass.Takk for meg.18

Fiskevaksiner og genteknologiUlike risikomomenter ved bruk av rekombinante, levendevirusvaksinerEspen RimstadProfessor, Norges veterinærhøgskoleJeg kommer ikke fra industrien, men fra Norgesveterinærhøgskole. Vi lager ikke vaksiner somsådan, men driver en del med grunnforskningnår det gjelder virusinfeksjoner hos fisk. Vi har ettpågående forskningsprosjekt når det gjelder levendevaksiner og DNA-vaksine på fisk. Det er et strategiskuniversitetsprogram som består av 5 miljøer hvorav4 jobber med DNA-vaksine rettet mot fiskevirus, ogett miljø jobber med aterosklerose hos mennesker,altså genterapi, dvs. egentlig to sider av samme sak.I begge tilfeller gjelder det å få levert gener til cellerslik at de cellene enten produserer proteiner somer gunstige for å få en immunrespons, gunstige forå reparere en mangel på cellen eller gunstige for ålage en suicidal effekt på cellen, dersom man ønskerat cellen skal dø.Nå skal jeg snakke litt om rekombinante,levende vaksiner. (Rekombinante betyr at manmanipulerer arvematerialet til viruset.) Fordelenmed levende vaksinerer at en får beskyttelse, dvs.immunrespons, i form av både cellulær så vel somhumoral respons. Hva vil det si? For dem som ikke erinne i immunologisk terminologi, kan det overførestil militær terminologi, og vi kan se på humoralrespons som lett artillerirespons. Det er det førstesom kommer. Veldig lett, men ganske effektiv, menscellulær respons er den tyngre panserdivisjonen somkommer etterpå, og som også husker hva som harskjedd. Med levende vaksiner får man begge deler,mens ved inaktivert vaksine får man først og fremsthumoralresponsen.Et eksempel på fordelen ved en levende vaksineer ringormvaksinen, som er levende og attenuert.Det betyr at den er genmodifisert, og at den ergenmodifisert uten at en eksakt vet hvordan det ergjort. Ringormvaksinen var så effektiv at ringorm hosstorfe i Norge så å si er utryddet. Grunnen til det erblant annet at en har fått en god cellulær respons.Dessuten kan en med levende vaksiner bruke naturliginngangsport ved administrering.Vi blir alle forkjølet hvert eneste år, minst én gang.Og vi er veldig irriterte over at ingen har laget en godvaksine mot forkjølelse. Det er mange grunner til det.Den ene er at det er mange agens som gir forkjølelse.Den andre er at infeksjonsveien er slimhinnene iluftveiene, og der er det vanskelig å få beskyttelse. Dethjelper dårlig å gi et stikk i armen for å få beskyttelseder. En bør ha et eller annet agens som en kan gi viaslimhinnene i luftveiene. Det nytter ikke å gi bareproteiner. Da må du gi noe som er levende.Men, det er visse generelle problemer med disselevende vaksinene, og hovedproblemet er at de kanvære potensielt genetisk ustabile. En av de førstelevende virusvaksinene som kom, var mot polio, ogden har vært veldig effektiv. Polio er nesten utryddet.Men man har hatt visse enkeltepisoder hvor denlevende poliovirusvaksinen har reversert tilbake tilvirulens.Hvis vi skal dele disse levende vaksinene inn ikategorier, så vil jeg gjøre det på samme måte somOdd Magne Rødseth gjorde i sitt foredrag. Man kanha det som kalles en homolog modell. Det vil si atman ønsker å vaksinere mot det viruset som manpå en eller annen måte manipulerer. Og da gårman inn og gjør noen endringer i genomet til detviruset, noe som gir visse endringer på for eksempeloverflateproteinet på viruset. En har ikke tilført noefremmed genmateriale her, så det er en homologmodell, der en altså ønsker beskyttelse mot det virusetsom en manipulerer. De fleste virus, i alle fall de somer interessante i fiskeoppdrett, er RNA-virus, og RNAkan en ikke manipulere. Man må ha det over på enDNA-form. Man kan kjøpe de forskjellige enzymenesom kan omdanne RNA til DNA, som vi får puttetinn i et plasmid, som så blir puttet inn i en bakterie,og der kan man manipulere det. Der kan man gå innog gjøre små mutasjoner. Da må du vite hvor du skalmutere, hva slags effekt disse proteinene har og hvaslags effekt det du gjør har. Så kan man gå inn ogforandrer på ting en vet er sykdomsfremkallende.19

Bioteknologinemnda: Internseminar 5. september 2001Man demper den sykdomsfremkallende effekten,men man ønsker å beholde det at viruset kan formereseg og det at viruset gir en immunrespons.Så er det den andre modellen, en heterolog modellhvor du bruker viruset ditt som en vektor, dvs. ettransportmiddel. Da gjør en det slik at en i tillegg tildet genetiske materialet i viruset legger til en litenbit fra en helt annen organisme, eller annet virus.Dette kan da medføre at en får et helt nytt protein,for eksempel på overflaten av vektorviruset. Det nyeproteinet kan gi noe man ønsker beskyttelse mot, foreksempel ILA-virus.Jeg skal ta noen eksempler på det jeg kalte forhomolog modell. Det første er det samme eksempletsom Odd Magne Rødseth brukte, vaksine motpseudorabiesvirus med infeksjon hos gris. Det eren sykdom som også går på andre dyrearter, menikke på mennesker. På andre dyrearter kan det væredødelig. Det er en veldig alvorlig sykdom på gris,og den kan være dødelig, men da først og fremstpå spedgris. Vaksinen har vært i bruk i flere år, denkom i 1991-1993. Man har gått inn og endret generfor noen virusproteiner bl.a. et enzym som heterthymidin kinase, men viruset kan fortsatt replikere.Det er lett å produsere det i en celle, og viruset er någlycoprotein E-negativt. Det betyr at det er en nedsattsykdomsfremkallende effekt og nedsatt affinitet fornerver. Dessuten kan man bruke dette til å sjekkehvorvidt et dyr har gjennomgått en infeksjon ellerer blitt vaksinert. For hvis det har en respons motglycoprotein E-proteinet, må det være infisert, fordet proteinet har ikke vaksinen. Vaksinen brukesog med stor suksess, men ikke god nok suksess,fordi vaksinen hindrer sykdom, men ikke infeksjon.Dette problemet skyldes ikke nødvendigvis levendevaksiner som sådan. Det skyldes at pseudorabies erforårsaket av et herpesvirus.Men, det finnes andre eksempler som ikke er såvellykkede. SIV, simian immunodeficiency virus,er ett av en rekke forskjellige HIV-analoger sominfiserer aper, og som kan brukes som modell for åprøve levende vaksine mot HIV. Det er forskjelligegener som regulerer produksjonen av SIV i en celle.Det er lagd multiple delesjoner, dvs. at det er fjerneten del biter i disse genene. Likevel var dette virusetfortsatt sykdomsfremkallende for nyfødte aper. Såfor en del virusfamilier, SIV og HIV, altså retrovirus,er det for tiden veldig liten optimisme med henblikkpå å lage levende, attenuerte vaksiner. Slike vaksinerkan være godt egnet for visse virusfamilier og mindreegnet for andre.For heterologe modeller, hvor man bruker virusetsom en vektor, er det forskjellige virus som kan væreaktuelle som vektorer. Jeg snakker om både pattedyrog fisk. De er ikke i bruk i fisk i dag. Med adenovirushar vi ingen infeksjon hos fisk, men det er mye bruktsom vektor for potensiell genterapi i pattedyr fordimange adenovirus gir infeksjon uten å gi sykdom.Et annet potensielt vektorvirus er alphavirus. Deter et virus som er veldig mye studert for tiden. Detlikner på gulfebervirus. De fleste alphavirus harbredt vertsspekter, dvs. at de kan infisere mangeverter. Det som er viktig i denne sammenhengen, erat viruset har kapasitet til å bære relativt mye fremmedgenmateriale. Et virus er en kompakt liten partikkel.Hvis du går inn og legger til nytt genmateriale, blirdet en ustabil struktur. Putter man inn for mye, såsprekker det. Men alphavirus kan man putte en goddel inn i.Baculovirus er nevnt. Det brukes først og fremstsom produsent av rekombinante proteiner, så deter vel ikke så aktuelt som levende vaksine. Andreaktuelle virus er ulike poxvirus, bl.a. vacciniavirus,som på grunn av sin størrelse kan aksepteremange fremmede gener uten at det mister evnentil å replikere. Rabiesvaksinen som er basert påvacciniavirus, og som Odd Magne Rødseth omtalte,er et godt eksempel.Vacciniavirus har vært brukt for utrydding avkopper hos mennesker. I tillegg til de menneskenesom eventuelt har fått bivirkninger av selveinjeksjonen, så spekuleres det i at det er én uheldigmiljøeffekt, og det er at vacciniavirus har etablertseg som en selvstendig infeksjon hos en bøffelflokki India. Man er ikke 100 % sikker på at det skyldesvacciniavirusvaksinen, men bøflene er i alle fallinfiserte, og man har foreløpig konkludert med atdet skyldtes den humane vaksinen.Herpesvirus hadde vi tidligere som eksempel påheterolog modell. Det foreligger et patentkrav pårekombinant herpesvirus som går på hund. Herpesvirusgir vanligvis ikke så mye sykdom hos hund,annet enn hos helt neonatale hunder. Man har funnetut at i dette viruset kan en putte inn hemagglutininetog fusjonsproteinet for valpesykevirus, som er de toimmunogent sett viktigste proteinene i det viruset. Fra20

Fiskevaksiner og genteknologirabiesvirus kan en putte inn et gen for et protein somgir beskyttelse, og fra parvovirus kan vi putte inn etgen for et protein som er på overflaten av parvovirus.Fra parainfluensa, som gir en luftveisinfeksjon, er detto gener som kan settes inn. Borrelia, som gir ”Lymedisease”, og som også kan være et problem for hund,kan også puttes inn. Det er altså 9 antigener som skalputtes inn i en og samme vaksine. Man kan sette innalle genene samtidig. Nå snakker jeg om hund, mendet demonstrerer de store og gode mulighetene enhar med rekombinante vaksiner.Retrovirus er ustabile genetisk sett og ikke så godtegnet når det gjelder vaksine. Men hvis man ønskerintegrasjon, altså ønsker at virusets arvemateriale ogdet fremmede genet skal integreres i vertscellensarvemateriale, er det egnet. Så i genterapi er nok deten ”hot” kandidat, mens det i vaksinesammenhengikke er så aktuelt.Når det gjelder rekombinante vaksiner, måman altså redusere patogeniteten, den sykdomsfremkallendeeffekten. En må vise at vektorvirus somsådan ikke gir sykdom. Samtidig må vektorvirusetfortsatt kunne formere seg. Og man bør ha optimaltuttrykk av de fremmede genene man har puttetinn. Dette krever god kartlegging av funksjonenetil forskjellige gener. Når det gjelder de virus sominfiserer norsk oppdrettsfisk, er IPN-viruset beskrevetpå en slik måte at vi vet noe av det, men vi vet ikkemed sikkerhet nøyaktig hvilke deler av genomet tilIPN-viruset som er viktigst ved sykdomsutvikling.Risikomomenter ved rekombinante,levende vaksinerSlike vaksiner er ikke i bruk når det gjelder fiskeoppdrett.For landdyr er det mange homologeeksempler, som jeg tok fram tidligere. Og en har noenvaksiner som er markørvaksiner, hvor man har puttetinn ett gen som ikke nødvendigvis gir beskyttelse,men er ment å være en markør for vaksinen. Men jegkjenner ingen vaksiner som pr. i dag er ute på det åpnemarkedet hvor virus fungerer som en vektor. Derforblir dette rent teoretiske betraktninger.sannsynligvis stoppe hvis slike effekter oppdages.Spørsmålet om effekt for andre arter er vanskelig.Hvilke arter? Villaks? Andre laksefisker? Skal vi trekkeinn andre fiskearter? Skal vi trekke inn bløtdyr? Deter en uendelighet av arter som kommer inn. Her kanman selvsagt stille kriterier, si at de og de artene fra deog de dyrerekkene bør testes. Men et fyllestgjørendesvar eller et klart ”nei” på det spørsmålet er det ettermin oppfatning umulig å gi.NN: Du sa at man kan gjøre eksperimentelle forsøkfør man lanserer vaksinen, men det kan vel være slik atman gjør disse forsøkene på spesielle linjer av dyr, foreksempel, og når man begynner å bruke det genereltat man plutselig kanskje har andre raser eller linjersom gjør at de fungerer annerledes?Rimstad: Spørsmålet er om den genetiskeutrustningen til det dyret eller den fisken som blirvaksinert, er så avgjørende for hvorvidt responsener beskyttende eller ei. Har du noen eksemplerpå det fra andre dyrearter? Tenk på mennesker ogpå husdyr. Vi bruker samme vaksine på alle typerhunderaser, med god effekt. Vi bruker samme typevaksine på menneskeheten stort sett (selv om viikke snakker om raser på mennesker), med sammeeffekt. Det er ett kjent eksempel på ulik respons, ogdet er innavla høns, hvor vi har noen linjer som svarerdårlig på en del vaksiner. De fleste vaksiner bestårav mange antigener. De består ikke kun av ett. Mendet jeg mente, var at hvis du ved å sette inn et gen iet vektorvirus, øker virulensen av det vektorvirusetfor en laks, så vil man ganske fort oppdage det underutviklingen. Men du vil ikke nødvendigvis oppdagedet for andre arter.2. Kan vevstropisme, dvs. virusets evne til å infiserespesielle celler i kroppen, endres når man setterinn andre gener? Det er avhengig av om du setterinn gener som forandrer proteiner som har medgjenkjenning av celler å gjøre fra virusets side. Detkan jo være nettopp det man ønsker. For å få en godvaksine, ønsker man at viruset skal infisere det vikaller for profesjonelle antigenpresenterende celler.1. Kan sykdomsfremkallende effekt av vektorvirusøke? Hvis man for eksempel setter et nytt gen inni genet for overflateproteinet på et virus, og deoverflateproteinene var veldig viktige for vertensimmunrespons, kan man da forstyrre vertensimmunrespons slik at potensielt ufarlig vektorviruskan bli sykdomsfremkallende? Eventuelt, kan det økesykdomsfremkallende effekt for andre arter?Det første spørsmålet kan selvsagt ikkebesvares ja eller nei uten videre, men en eventuellsykdomsfremkallende effekt vil oppdages vedeksperimentelle forsøk, og vaksineproduksjonen vil21

Bioteknologinemnda: Internseminar 5. september 2001Dette gjøres det studier på, nettopp for å få virus tilå gå inn i spesielle immunologiske celler. Der er viikke på fisk, men en dag kan vi kanskje komme dit.Igjen, vi kan ikke i utgangspunktet si om et virus sombare infiserer pancreasceller, etter kanskje å ha fått etspesielt gen fra ILA-virus som infiserer blodkarceller,nå kanskje også begynner å infisere blodkarceller ogen tredje type celler. Det vet man ikke før man harprøvd, og det kan ikke utelukkes.3. Kan andre arter, uten at de nødvendigvis blir syke,gjennomgå infeksjon uten sykdom, slik at de utilsiktetsprer virus? Man bør gjøre en del slike forsøk, mendet er igjen umulig å gi et uttømmende svar på etslikt spørsmål.4. Kan vaksinering øke sykdomsfremkallende effektpå persistente infeksjoner? Ett eksempel er CMVpromotor,som ble nevnt tidligere om DNA-vaksiner.CMV er et cytomegalovirus, som er et herpesvirushos mennesker og som kan gi en del sykdommer.De er flertallet av oss infisert med hele tiden, restenav livet. Så den promotoren har vi i oss. Vi er ikkegenmodifiserte med den, men det ligger nok der somen ekstrakromosomal sak. Den er et stort problemnår det gjelder transplantasjonskirurgi, fordi denda kan bli aktivert. Kan det være slike infeksjonerhos fisk som vil bli aktivert når man vaksinerer?Hvis slike sykdommer dukker opp, vil det kanskjekunne gi et produksjonstap, men igjen så vil det dasannsynligvis oppdages under prosessen. Dette eraltså produksjonsdyr med kortvarig levetid. Vi haren helt annen innfallsvinkel der enn vi vil ha påmennesker og dyr som skal leve lenge.5. Kan det være en direkte skadelig effekt av detgenet du setter inn? Sannsynligvis setter vi innet gen som koder for et protein som er viktig isykdomsutviklingen for en infeksjon forårsaket av etannet virus eller en bakterie. Dette kan for eksempelgi en autoimmuneffekt, dvs. en kryssreaksjon tileget vev. Men igjen, fisken er et produksjonsdyr oghar kort levetid. Gjør det noe om den teoretisk settkanskje utvikler sykdom år etter at den skulle værtslaktet? Er det etisk akseptabelt at du påfører dendet? Det kan være at det produksjonsmessig sett ikkebety noe. Jeg har ikke noe svar på det, men nevnerproblemstillingen.6. Oncogener er gener som endrer på vekstregulering,veksthastighet på celler. Det er selvsagt noe manaldri vil innføre i en type vaksine som skal brukestil mennesker eller kjæledyr. Men en del virusbærer på slike oncogener. Slike virus kan være godeimmunogener, dvs godt egnet som vektorvirus, menvil man bruke det på fisk? Dette er produksjonsdyrmed kort levetid og vil kanskje aldri rekke å utvikle eneller annen tumor i den tiden de er tiltenkt å leve.7. Kan egenskapene til vektorvirus endres? Kan detfå endret overlevelse i miljøet?Rekombinante virus der man har puttet inn nyegener, vil, i hvert fall teoretisk sett, være genetiskmer ustabile. Kan de da ha lettere for å tilegne segnytt genetisk materiale? Kan de lettere rekombineremed andre virus, bakterier osv.? Ja, kanskje. Inorsk fiskeoppdrett er IPN-viruset meget utbredt– man finner det ikke over alt, men man finner deti veldig mange fiskeoppdrettsanlegg. Man finnerogså ILA-virus og pancrease disease-virus i en delfiskeoppdrettsanlegg. Det er overveiende sannsynligat disse virusene har møtt hverandre, i en og sammecelle. Når et virus replikerer i en celle, er det en gjengmed gener som svirrer rundt i cellen og dirigererproduksjon av proteiner som blir satt sammen til enpartikkel. Og i den cellen er det et utall andre RNAmolekylersom svirrer rundt og kan rekombinere.Dette skjer kontinuerlig. Kan man så kvantifiserehvor stor den sjansen er? Nei, det kan man ikke.Igjen, man kan ikke si ja eller nei, men teoretisk setter faremomentene der.Risikomomenter ved DNA-vaksiner8. DNA-vaksiner er ikke levende, i den grad man kanbruke ordet ”levende”. De formerer seg ikke, det blirikke flere av dem. Men de kan potensielt integreres,selv om det nå er mange studier som sier at de ikkeintegreres. Vi har ikke indisier på at det skjer, menteoretisk sett kan de gjøre det.Dersom en gir vaksiner veldig tidlig til fisk, før detimmunologiske apparatet er godt utviklet, da kan manfå immunologisk toleranse, dvs. at når fisken blir utsattfor patogene virus eller bakterier, utvikler den ikkeen immunrespons. Hvis fisken ikke blir syk når denkommer bort i ILA-virus, eller IPN-virus, er ikke detbare bra da? Det gjør da ikke noe om fisken er smittetmed ILA-virus eller IPN-virus hvis den ikke dør avdet, eller gjør det det? Eller bør man kanskje ventetil fisken har blitt stor nok til at den ikke utvikler enimmunologisk toleranse?9. Autoimmunitet. Man kan kanskje få antistoffer motDNA i DNA-vaksiner som igjen kan gi antistoffer somutløser reumatoide sykdommer. Men fisken skal levekun i 2 år. Så det er for meg en humanmedisinskproblemstilling som man ikke uten videre kanoverføre til fiskeoppdrett.10. Problemet med integrering av plasmid-DNA igenomet til transfekterte celler. Skal DNAet overførestil neste generasjon, må det ikke bare integreres i22

Fiskevaksiner og genteknologigenomet til en celle, det må i en kjønnscelle. Og detkan jo skje utilsiktet. Når man skal injiserer vaksinenintramuskulært, vil man helt sikkert hos noen fisksette vaksinen intravenøst. Da blir DNAet spredt ihele kroppen.Men for å unngå det problemet, kan man jo bare gien RNA-vaksine? Det vil ikke integreres i vertscellenskromosomer, for der er ikke noe cellulært apparatsom kan gjøre det. DNA-vaksiner er bare ett trinn iutviklingen av nye vaksiner.11. I dag bruker vi antibiotikasresistens somseleksjonssystem ved DNA-vaksine. Det man kangjøre er at man legger den antibiotikaresistensenkromosomalt på de bakteriene man jobber med.Så har man da på plasmidet av-og-på-signaletfor den antibiotikaresistensen. Du har ikke selveresistensgenet lenger på plasmidet.Aktuelle infeksjoner hos fisk.Det finnes kommersielle vaksiner som er tilgjengelige,og som fyller alle kravene som FDA og andreadministrasjoner i USA har stilt og som JohnMcDougall gikk gjennom i sitt foredrag. La oss se påaktuelle infeksjoner hos oppdrettsfisk.Infeksiøs pankreas nekroseInfeksiøs pankreas nekrose-virus overlever lengeutenfor vertsdyret. Det kan smitte mange forskjelligefiskearter, som laks, regnbueørret osv. Det er ogsåfunnet hos kamskjell. Det er ikke sikkert at det ersykdomsfremkallende i alle arter som kan infiseres,men det er altså et lite artsspesifikt virus, og deter ganske typisk for en del av fiskevirusene at deer ganske lite vertsspesifikke, motsatt det vi serhos pattedyr. En viss del av fisken som overleverinfeksjonen, blir persistent (vedvarende) infisert.Det er et relativt godt kartlagt virus, i hvert fall ifiskevirussammenheng, men sykdomsfremkallendefaktorer bør kartlegges bedre. Revers genetikk eretablert. Det betyr at vi kan altså her gå veien fraRNA, få RNAet over på DNA-form, manipulere påDNA-formen og gå tilbake igjen, slik Odd MagneRødseth beskrev det.Men, hvilke faktorer er det pro og kontra nårdet gjelder å bruke IPN, 1) som homologt virus ivaksinesammenheng, og 2) som en vektor? Når detgjelder bruken som homolog virusvaksine, så er minholdning preget av at man har i en årrekke bruktlevende, attenuerte virus, både i humanmedisin ogveterinærmedisin, uten at man har hatt detaljkunnskapom hvilke genetiske forandringer man har gjort,og likevel har disse vaksinene hatt effekt. Og hvisman går inn og gjør nøyaktig det samme eller noetilsvarende på IPN-virus, og i tillegg noenlunde vethva man gjør, så kan ikke jeg skjønne at det at manvet hva man gjør skal være noen ulempe.Når det gjelder å bruke IPN-virus som vektor, så erdet en del ting som kanskje kan være bekymringsfulle.Det ene er at viruset infiserer en rekke arter. Skalman bruke det på laks, så kan man tenke seg atvektorvaksinen vil spre seg til mange andre arter. Erdet ønskelig? Ikke bare det, men IPN-virus overleverlenge utenfor verten så man må regne med atvaksinestammen også vil overleve lenge. Dessutener det en del fisk som blir persistent infisert medIPN-virus, og det vil kanskje også skje med envaksinestamme. En persistent infisert fisk vil ha størresjanse for kontakt med andre virus som teoretisk settkan gi en homolog rekombinasjon. Så det taler imotå bruke den som en vektor. For å kunne si noe merspesifikt om dette, bør man ha spesialkunnskap omdet enkelte virus.LakseanemiLakseanemi skyldes et influensavirus (nesten i allefall) hos laks. Det er ikke så stabilt som IPN-virus. Detoverlever nok noen uker, kanskje måneder også, utei sjøen. Det kan infisere andre arter, men det gir ikke,så vidt man vet nå, noen sykdom hos andre arter ennatlantisk laks. Så det er ganske spesifikt, men det kan giinfeksjon hos andre arter. En gruppe ved Universiteteti Bergen har vist at det kan infisere regnbueørret ogbrunørret, som er altså vanlig ørret i Norge først ogfremst, og stillehavslaks. Det er også vist å kunneinfisere sild. De sykdomsfremkallende faktorene ertil dels ukjente. Men det er altså influensavirus somen tenker seg som en analogi. Men selv den analogiener farlig å trekke for langt, fordi immunresponsenhos laks er helt annen enn hos mennesket og andrepattedyr, selv om virusoppbyggingen hos ILA-viruser til dels ganske lik influensavirus.Revers genetikk, det er at man kan taviruskromosomene som består av RNA, og få demover på DNA-form, manipulere dem og få dem tilbakeigjen, er en ren laboratorieteknikk som ikke vil kunneskje i naturen. For mange virus er teknikken ikkeetablert. Men den er etablert på influensavirus.NN: Det at du infiserer andre arter, betyr detautomatisk at de er smittsomme, eller er det toforskjellige ting?Rimstad: Når det gjelder ILA-virus, så kan bådebrunørret og regnbueørret bli infisert og infisere laks,dvs. at de skiller ut virus. Men du har eksempler, sompseudorabies, hvor gris er hovedverten, på at andrearter enn gris, hvis de blir infisert, er en ”dead endhost”, dvs. en vert som ikke vil skille ut virus.IHN- og VHS-virusIHN-virus og VHS-virus, som gir infeksiøshematopoetisk nekrose og Egtvedt syke, er to virussom vi pr. i dag ikke har i norsk fiskeoppdrett.23

Bioteknologinemnda: Internseminar 5. september 2001VHS var i Norge på 70-tallet og i 1998. Siden dissesykdommene, som er ganske alvorlige, ikke eretablerte her, vil man sannsynligvis ikke i Norgetillate vaksinering hvis sykdommene ikke skulleetablere seg. Man vil sannsynligvis bruke nedslaktingdersom man får enkeltutbrudd av disse sykdommene.Men dette er ganske godt kartlagte virus, og desykdomsfremkallende faktorer er til dels kjent ogrevers genetikk-systemet er etablert.Pancrease disease virusPancrease disease virus har en ukjent utbredelse.Vi vet ikke helt hvor mye sykdom det forårsaker iNorge, men en antar at det er av betydning. Manhar både friske virusbærere og utskillere, og detkan sannsynligvis smitte via rogn, altså fra mor tilavkom, og gi sykdom både hos laks og regnbueørret.Pancrease disease virus er et alphavirus (som er virussom kan bære mye genetisk materiale). Så dette eret interessant virus for framtiden når det gjeldermulige kandidatvirus til bruk som en vektor for åpresentere proteiner fra andre virus som vi ønskerbeskyttelse mot.NodavirusNodaviruset gir sykdom hos marine oppdrettsarter.Det kan gi persistent infeksjon. Det er ikke etablertrevers genetikk så vidt jeg vet.De virusene jeg har nevnt er RNA-virus. For etteventuelt to av dem er det etablert et system som gjørat man kan gå inn og manipulere genomet.Takk.24

Fiskevaksiner og genteknologiRegulering av genmodifiserte organismer med hovedvekt påutfordringer knyttet til vaksiner og fiskEsten ØdegaardFørstekonsulent, Direktoratet for naturforvaltningFørst vil jeg si at det var veldig hyggelig å bli invitert.De forskjellige innspillene og debatten har vært veldiginteressant. Det er et faktum at vi har ganske litenerfaring i forvaltningen med en del av det som dethar vært snakk om i dag. Det er relativt nytt for ossogså, og det er veldig viktig for oss å høre flest muligsynspunkter på disse spørsmålene.Vi har generelt sett veldig liten erfaring medfeltforsøk eller annen utsetting av genmodifiserteorganismer i det hele tatt i Norge. Det har værtgjennomført ett forsøk med genmodifisert potet tidligpå 90-tallet, og det har vært noen forsøk i drivhus somvi har regnet som utsetting her i landet. Utover det harvi ingen erfaring med feltforsøk, og det er derfor sværtviktig å ha en nær dialog med søkere før eventuelleforsøk settes i gang.Det har vært snakket litt om hva som regnessom GMO, og det er klart at hvis en organisme kankarakteriseres som en GMO så reguleres bruken avden under genteknologiloven. Det er visse forskjellermellom genteknologiloven og andre regelverk somkunne ha vært aktuelle, og det går kanskje særlig påkravet om samsvar med prinsippet om bærekraftigutvikling og at en utsetting eller annen bruk skalskje uten helse- og miljømessige skadevirkninger.(Det sistnevnte er forresten inne i en del andreregelverk.)Genteknologiloven:§ 1. Lovens formålDenne lov har til formål å sikre at framstilling ogbruk av genmodifiserte organismer skjer på en etiskog samfunnsmessig forsvarlig måte, i samsvar medprinsippet om bærekraftig utvikling og uten helse- ogmiljømessige skadevirkninger.§ 10. Krav om godkjenning[…] Utsetting av genmodifiserte organismer kan baregodkjennes når det ikke foreligger fare for miljø- oghelsemessige skadevirkninger. Ved avgjørelsen skal detdessuten legges vesentlig vekt på om utsettingen harsamfunnsmessig nytteverdi og er egnet til å fremme enbærekraftig utvikling.Kravet om at en utsetting skal skje på en etisk ogsamfunnsmessig forsvarlig måte, er også særegentfor genteknologiloven. Og det er kanskje litt avbakgrunnen for at man er litt skeptisk til at en DNAvaksineblir regulert under genteknologiloven, i tilleggtil at ”GMO” i seg selv ikke akkurat er blitt et plussord.Føre-var-prinsippet skal dessuten legges til grunn vedsøknadsbehandling under genteknologiloven.Jeg har fått et spørsmål om definisjonen av GMO.Her er det som står i genteknologiloven ganske liktdet som står i EØS-direktivet 90/220 og definisjonenunder Cartagenaprotokollen. GMO er altså”mikroorganismer, planter og dyr, hvor den genetiskesammensetningen er endret ved bruk av gen- ellercelleteknologi.” Og mikroorganismer er vel definertsånn at det slutter omtrent ved virus og bakteriofager.Et plasmid regnes ikke som en organisme i det heletatt, noe som medfører at selve DNA-vaksinen ikkekan karakteriseres som en GMO.Genteknologien er definert som teknikker sominnebærer at arvestoff isoleres, karakteriseres,modifiseres og innsettes i levende celler eller virus.Og det vil da si at det skal enten isoleres ellerkarakteriseres eller modifiseres, eller alle tre, plussat det skal innsettes i levende celler eller virus.Så langt om hvordan genteknologiloven definereren GMO. Vi har tidligere ikke fått spørsmål omhvorvidt en organisme skal defineres som en GMOeller ikke. I forbindelse med DNA-vaksiner harspørsmålet imidlertid vært reist, og vi har fått enhenvendelse der vi er blitt bedt om å uttale oss omhvorvidt fisk som er injisert med DNA-vaksine vilanses som en GMO.Den konklusjonen vi har kommet til når detgjelder DNA-vaksinen er at den organismen sommottar vaksinen vil kunne regnes som en GMO ettergenteknologiloven.Når det gjelder rekombinante virusvaksiner så, erjo selve vaksinen en GMO, så en søknad om levende25

Bioteknologinemnda: Internseminar 5. september 2001rekombinante virus brukt som vaksine vil uansettbehandles etter genteknologiloven. Vi har derforforeløpig ikke foretatt noen grundig vurdering avom organismer som mottar viruset vil kunne regnessom en GMO etter genteknologiloven. Jeg er faktisklitt usikker på hvorvidt en slik organisme vil væreGMO eller ikke. Det er ingen av våre jurister somhar sett på akkurat dette, men det er en del somtyder på at den organismen som mottar en slikvirusvaksine også vil kunne defineres som en GMOetter genteknologiloven. Men dette er jeg altså usikkerpå. Jeg skjønner godt at næringen også kan være littusikker på hvor grensen går.Når vi har prøvd å finne ut hvordan DNAvaksinertedyr skal tolkes, har juristene basert seg pålovforarbeidene, særlig odelstingsproposisjon nr. 8(1992-93), for å finne ut hvilke synspunkter lovgivernehadde da de definerte GMO. Konklusjonen er at nårdu har satt DNAet inn i et dyr så kan du betraktedet som en GMO så lenge det har DNAet i cellen.Hvis man kan vise at alt dette har forsvunnet, vil detkanskje ikke lenger være en GMO. Og hvis det er slikat dette integreres i kjønnsceller og arves ned, vil daogså avkom av de dyrene være GMO. Spørsmålet omnår DNA går ut av cellene vil være mer et spørsmål omdeteksjonsnivå. Kan vi her si at det er tomt, at DNAeter ute av de cellene, av det dyret? Da kan man begynneå stille spørsmål om det fortsatt er en GMO. Kanskjedet var en GMO, men ikke er det lenger?En definisjon er jo ikke entydig selv innenforforskningen. Det spørs veldig mye hvilketutgangspunkt du har. En definisjon ettergenteknologiloven trenger jo ikke nødvendigvis åvære den generelle oppfatningen blant alle forskerne.Vi har gjort en tolkning av loven og lovforarbeidet ogkommet til at det faktisk ble diskutert, og at det erlovgivers ønske at man kaller det dyret som mottarDNA-vaksine for en GMO. Men det er klart at det kanjo diskuteres om det er hensiktsmessig, og om det vardet som var meningen med loven.Men dette er en debatt som det er interessant åfortsette, og det er jo klart at det har en del konsekvenserhvis man kaller en organisme en GMO. For næringener det antakelig et skrekkscenario hvis laksen skal blikalt en GMO etter at den er vaksinert med en DNAvaksine.Det vil sannsynligvis bety kroken på døra forde vaksinene, og man kan selvfølgelig stille spørsmålved om det er hensikten.Det vår tolkning betyr er at innesluttet bruk ogutsetting av fisken krever melding eller godkjenningetter genteknologiloven. Og for innesluttet bruk erdet allerede en del godkjenninger som er gitt ettergenteknologiloven. Utsetting er jo all bruk som ikkeer innesluttet. Det må det altså søkes om. Det vil ogsåkunne medføre merkekrav. Det er klart at dette kanha ganske store konsekvenser for skjebnen til devaksinene.Det som kanskje er mest aktuelt i norsksammenheng, er å foreta forskning ut overinnesluttet bruk, altså begynne å gjøre forsøk på felti merder eller liknende Søker må da gjennomføreen konsekvensutredning basert på forskrift omkonsekvensutredning etter genteknologiloven.Konsekvensutredningen gjennomgår mulige helseogmiljømessige virkninger, og søker må også gågjennom tiltakets positive eller negative virkningpå bærekraftig utvikling. I tillegg må etiske aspektersom kan reises ved bruk av den genmodifiserteorganismen samt eventuelle sosioøkonomiskefordeler eller ulemper ved bruk av den genmodifiserteorganismen, gjennomgås i søknaden. Direktoratet fornaturforvaltning kan spørre Bioteknologinemnda tilråds i samfunnsmessige og etiske problemstillinger.En del av disse vilkårene er for så vidt noe somsøkere kan ta litt mer tak i. Frem til nå har ikkenæringen generelt sett vært så veldig på banennår det gjelder samfunnsmessig nytte m.m., særligikke i søknader som gjelder planter. Det hadde værtveldig interessant om produsenter av vaksiner, ellerav genmodifiserte planter for den saks skyld, gikkmer inn i disse spørsmålsstillingene, fordi for oss ogkanskje særlig for nemnda, er det vanskelig å vurderedisse forholdene når søknaden inneholder veldig liteopplysninger om etiske og samfunnsmessige sider vedden genmodifiserte organismen. Hvis man kan vise tilat dette faktisk er en vaksine som vil ha en veldig godnytteeffekt, så vil jo det være noe som vi vil kunne tahensyn til ved en vurdering av søknaden.Det kan bli aktuelt med en offentlig høring iforbindelse med søknad om utsetting av en GMO.Det er vel kanskje også noe som søkere ikke vil væreså veldig begeistret for. Vi kan også stille en goddel vilkår for godkjenning som vil kunne omfattesikkerhetstiltak, oppfølging, rapportering osv. I dethele tatt er det ganske mange forskjellige vilkår vikan stille til et forsøk. Normalt kreves det en trinnvisutsetting når det gjelder GMO. Så hvorvidt en DNAvaksinertfisk defineres som en GMO eller ikke, vilha en del konsekvenser også når det gjelder hva slagstype søknad en søker må levere.NN: Kan dere stille vilkår om bedre dokumentasjonav samfunnsmessig nytte, for eksempel, eller enhøyere samfunnsmessig nytte, før dere godkjennerdet?Ødegaard: Ja, det er jo noe som skal legges vektpå i søknaden, og vi har mulighet for å spørre ommer dokumentasjon. Jeg tror det naturlige ville være,hvis det kommer en søknad om en DNA-vaksine, foreksempel, at man går inn i en dialog med søkerbasert på forskriften om konsekvensutredning og bersøkeren å utdype det som eventuelt mangler. Det erogså viktig å påpeke at selv om vi, etter den tolkningen26

Fiskevaksiner og genteknologivi her har gjort på forespørsel, vurderer en laks somhar mottatt en DNA-vaksine som genmodifisert iutgangspunktet, så vil vi jo ganske sikkert gjøre enannen vurdering av risikomomenter ved den laksensammenliknet med en laks som er transgen ellerder du har fått arvemateriale integrert i genomet ialle cellene. Det er viktig å ha klart for seg at selvom man kommer innenfor GMO-regelverket betyrikke det automatisk at en søknad avslås. Det er envurdering man må foreta i det enkelte tilfelle basertpå vår risikovurdering.Man kan også tenke seg at i utgangspunktet vil manse på fisken som en GMO, når den er nyvaksinert så åsi, men at den ikke nødvendigvis alltid forblir GMO.Det vil være viktig å foreta en vurdering av hvor godtman kan dokumentere at DNAet er ute av organismenetter en viss tid. Så det er ikke sikkert at fisken får etGMO-stempel gjennom hele livet.27

Adresse: Boks 522 Sentrum, 0105 OSLO • Tlf: 22 24 87 91• Fax: 22 24 27 45 • e-post: bioteknologinemnda@bion.no • www.bion.noBIOTEKNOLOGINEMNDA