Notater i Biofysiske mikroteknikker - ntnu.no

Notater i Biofysiske mikroteknikker
1
Et kort sammendrag

1. Lys
• Grunnleggende likninger i starten av kompendiet.
• Brytningsindex n er avhengig av frekvens, og dette kalles dispersjon. For å beskrive dette
skriver en brytningsindex som et komplekst nr: nc = nR + inI
• Eksitasjon av biologiske molekyler er svært viktig, og skjer i bla øyet og i fotosyntesen.
Fotonet bærer da nok energi til å starte en kaskade av reaksjoner.
• En elektromagnetisk bølge (lys) som passerer igjennom et materiale vil indusere en elektrisk
dipol, som fører til en polarisering av materialet.
• Energien kan eksiteres til følgende:
� ��� = � �������� ������ + � ��������� + � ��������
Hvor energien er hhv 10, 0.3, og 0.01 eV.
• Eksitasjon av elektroner fra grunntilstand i organiske molekyler har en normal energi på 2-
5eV, som svarer til bølgelengder på 600-250nm.
• Eksitasjon er kun lov mellom samme spinn kvante nr, ΔJ = 0. De fleste organiske molekyler
har grunntilstand J = 0, som er en singlett tilstand.
• Absorpsjon i en biologisk prøve kan beskrives av endret intensitet:
2
�� = −� ∙ � ∙ � ∙ �� = −� ∙ � ∙ ��
n er antall absorberende enheter pr volum, s er absorbsjon cross-section pr absorberende
enhet, ε = ns = absorbsjonskoeffisient.
• Integrasjon gir: I = I0e -εx , som er Beer-Lamberts lov.
• Optical density (OD), er gitt som: OD = log(I0/I) = εx
• Eksitasjon i vibrasjonstilstander avhenger forskjellige bindinger, og kan eksiteres på mange
måter. Eks: streching and bending. Ved absorpsjon og eksitasjon er endres
vibrasjonskvantenr med ±1; Δv = ±1.
• Termisk energi for vanlige organismer er omtrent kT = 0.02eV, dette er tilsvarende som
rotasjonsenergi. Elektron eksitasjon og vibrasjon kan ikke skje ved termisk eksitasjon.
Rotasjonseksitasjon er kun interessant i gass.
• Franck Condon prinsippet: Absorpsjon
og emisjon av et foton skjer så raskt
(10 -15 s), slik at det ikke påvirker
intranukleære avstander. I en såkalt
vibronic transition (samtidig ending i
vibrasjon og elektron energinivå) vil en
overgang være mer sannsynlig jo mer
bølgefunksjonene til de to
energinivåene overlapper.

• Stokes skift: Fluorescens ens og fosfofluores fosfofluorescens
er skiftet til lavere energier (lengere
bølgelengde) enn opprinnelig
absorpsjonsspektra. Typisk 55-100nm.
• Eksitasjon fra grunntilstanden fører til både
eksitert elektron- og vibrasjonstilstand.
• Molekylet kan gå tilbake ved grunntilstand
ved emisjon av lys.
• Sannsynligheten pr tid for
proporsjonal med (ΔE) 3 Sannsynligheten pr tid for emisjon er
= ( (hf)
største endring i energi dominere emisjon, og
ikke små hopp mellom vibrasjonstilstander. (
3 . Dermed vil
største endring i energi dominere emisjon, og
p mellom vibrasjonstilstander. (-> > infrarød fluorescens er lite sannsynelig)
• Relaxation fra vibrasjonseksitasjon skjer raskt (10
prosesser; Internal conversion og Intersystem cooling. (Ikke fluorescens / fosfofluorescens)
-12 s), og gjennom to ikke ikke-strålende
prosesser; Internal conversion og Intersystem cooling. (Ikke fluorescens / fosfofluorescens)
fosfofluorescens).
• Internal conversion: For overgang mellom høyt eksiterte tilstander, elektroneksitasjon ->
vibrasjonseksitasjon, uten fluorescens.
• Intersystem crossing: Forbudt, ikke ikke-strålende overgang. Forbud: (ΔJ ≠ 0), men SS1
� T1. Dette
skjer igjennom spin-orbital orbital kobling, og er vanligere for tyngre atomer.
• Fluorescens: Normalt fra S
(10 -12 Normalt fra S1 � S0. Levetid 10
s), og derfor vil det dominere fra høyere tilstander
-9 s. Dette er lenge i forhold til internal coversion
s), og derfor vil det dominere fra høyere tilstander (S3, S2) ned til S1. .
• Fosfofluorescens: Forbud elektroneksitasjon, ( (ΔJ ≠ 0), normalt fra triplettilstand TT1
til singlett
S0. Treg prosess, , kun tyngre atomer.
3

• Dissosiasjon: Energien ved eksitert elektrontilstand er tilsvarende som for kovalente
bindinger, og kan derfor føre til kjemisk reaksjon.
• Ionisering: Eksitert molekyl mister et elektron til mediet rundt. Dette innebærer ikke en
tilstand med et fritt elektron, men heller en tunellering bort av elektronet.
• Quantum yield: Sannsynlighet for at et absorbert foton skal resultere i en prosess.
• Løsningen molekylet er i påvirker i stor grad energifrigjøringen fra et eksitert atom. I en
løsning av polære molekyler vil en eksitert tilstand reorientere molekylene rundt til laveste
totale energi. Dette fører til energitap til løsningen, og rød-skift.
• Emisjon av lys er en intramolekulær prosess, og er relativt uendret av temperatur. Ikkestrålende
prosesser derimot øker med temperatur, da løsningen lettere kan ta unna
vibrasjon og rotasjon.
• Eksitert energi kan overføres fra en donor til en akseptor via Resonanse Energy Transfer. For
at dette skal skje må emisjonsspektrumet til donor overlappe med eksitasjonsspektrumet til
akseptor, og avstanden må være mindre enn 100 ”resonans energi overføringer” unna.
Overføringen skjer igjennom elektriske dipol-dipol reaksjoner, og er proporsjonal med r -6 .
• Medium med en brytningsindex avhengig av polarisasjonsretning sies å være birefringent.
• Når lys passerer et wollaston prisme deles lyset i to polariserte, orthogonale komponenter.
• Scattering (spredning) deles i elastisk og uelastisk spredning.
o Elastisk består av:
� Rayleigh scattering for λ > partikler og
� Mie scattering for λ < partiklene.
o Uelastisk deles i
� Brillouin scattering som kommer av tidsavhengige tetthetsfluktasjoner.
� Raman scattering, hvor reflektert lys kommer tilbake med frekvens ωp ± ωR .
±ωp står for Stokes-skift, og representerer molekulære vibrasjoner, som
kjennetegner kjemiske bindinger.
4

Ikke-lineære prosesser
• To-foton eksitasjon: To fotoner med samlet høy nok energi eksiterer en tilstand. Går først til
en ustabil mellomtilstand k, som må eksiteres videre til m innen levetiden tiden (10
intensitet er derfor påkrevd, kun i fokuspunkt. Maks dybde 320µm � 3 ”
-17 ). Svært høy
”mean free path”.
• Second harmonic generation (SHG): To fotoner med frekvens ω omdannes til et foton med
frekvens 2ω. Både energi og moment er bevart bevart. Ingen bleking eller kontrastmidler, men det
er negativt at signalet stort sett fortsetter rett frem. Krever et molekyl som mangler
symmetrisenter, , for eksempel anisotrope krystaller, collagen, , myosin, mikrotubulus
mikrotubulus.
• Begge prosessene er ikke ikke-lineære; men to-foton fluorescens baserer seg eg på eksitasjon fra to
fotoner, så emisjon at et nytt, SHG er ikke-lineær spredning.
2. Optikk basis for lysmikroskopi
3. Lysmikroskopi
5

• Består av to helt essensielle deler; 1) objektiv som fanger diffracted lys fra prøven og
forstørrer til okularet. 2) Kondensator linse
som fokuserer lys fra lyskilden på prøven.
• Condenseren sørger for optimal belysning
av prøven, og fokuserer lyset på et lite
område. For maksimal oppløsning bør NA
til condenser og objektiv være like. Kan
korrigeres på mange måter, slik som
objektiv.
• Okular forstørrer og viser bildet produsert
av objektivet. Er spesifisert med
forstørrelse og field of view. Ex: 10x/ 20
okular og 100x objektiv gir 1000x
forstørrelse og 20mm/100 = 0.2mm
diameter i det synlige objektivfeltet.
• To okularer gir ingen ny informasjon, lyset
fra prøven deles 50/50 i en beamsplitter.
• Det er kritisk at prøven belyses lyst og
gjevnt, med minimum av
varmedeponering, ikke glare, og med så
stor kone av innkommende lys som mulig.
Dette gjøres ved Köhler’s principle of
illumination.
o Objektet er fokusert ved å justere
høyden på prøven
o Field diafragmaet er avbildet i
objektet ved å justere posisjonen
til condenseren relativt til
prøvebordet.
• Lateral oppløsning (resolution) er gitt av Rayleigh kriteriet for to tett adskilte punkter. Det
heter: To punkter er oppløst (resolved) når senter-spoten av den ene (center of airy disk)
sammenfaller med første minimum fra det andre punktet.
• Hvis objektiv NA ≤ condenser NA, er oppløsningsevnen (resolving power, d er minste
oppløste avstand) definert som:
6
� = 0.61�
��
• NA = n sinα, hvor α er største vinkelen objektivet kan ta inn lys, og n er brytningsindeks i
mediet mellom prøven og objektivet.
• Biologiske prøver har som regel svært lite eller ingen kontrast, og dannes i brigthfield
mikroskopi av spredning/absorbsjon. Kontrast er definert som:

7
� = � ������ − � ����������
� ����������
• Aksial oppløsning (axial resolution) er minimum avstand langs den optiske akse som kan bli
sett som to separate. Dette er det samme som depth of field Z, som er tykkelsen av planet i
fokus.
� = ��
�� �
• Bright field mikroskop egner seg til prøver med kontrast, enten naturlig eller tilført.
• Phase contrast mikroskopi gjøres ut av et lysmikroskop ved å sette inn en ring i
condenseren, og en fase-plate etter objektivet. På denne måten går lyset forskjellig optisk
vei, og på den måten får en kontrast. Prøven er dermed belyst fra en ring. Denne metoden er
veldig bra for prøver uten kontrast.
o Prøven uten amplitude (absorpsjon/scattering) forsinker (OPL) typisk fasen λ/4 i forhold
til upåvirket lys som bare seiler igjennom eller rundt prøven. Det upåvirkede lyset kalles
zero’th/ nullte orden.
o Våre kjære staver og tapper oppdager dessverre kun intensitet (staver) og frekvens
(farge - tapper), ikke fase.
o Denne laggen på λ/4 er gir omtrent udetekterbart endring i intensitet gjennom
okularene.
o Løsningen er å Speede opp nullte ordens upåvirket lys med λ/4, slik at forskjellen blir λ/2.
Dette gir destruktiv interferens, som er lett og se. Dette gir mørke detaljer mot en lys
bakgrunn. Dette kalles mørk / positiv kontrast.
o Det direkte nulte ordens lyset og det diffakterte lyset splittes av en anulus i
frontfokalplanet til kondensator linsen. Dette er i konjugatplanet til bakfokalplanet etter
objektivet, hvor λ/4 platen settes.
o Direkte lys kommer nå i en kjegle igjennom objektivet, mens lys som har gjennomgått
diffraksjon kommer i hele planet.
o λ/4 platen er litt tynnere i ringen, dette får direkte lys til å passere fortere og ligge λ/2
foran. Ettersom dette lyset er mye sterkere må det også passere en tynn metallfilm for å
bli jevnt intenst med det diffraktive lyset.

8
o Ettersom denne λ/4 /4 platen må lages for en bølgelengde velges grønn, og en plasserer et
grønt filter i lysbanen.
o λ/4 /4 platen kan også retarde det direkte lyset med λ/4. En får da negativ / lys kontrast.
o Fasekontrast sliter med haloer haloer- og avskygningsartefakter.
o Prøver bør være 1/10 λ. Her er DIC overlegen.
• Differencial interference contrast (DIC) utnytter forskjellene i Optisk veilengde (OPL) (OPL),
(avbilder gradienter) for å danne kontrast i et bilde. Avhenger av brytningsindeks n, og
tykkelsen på prøven. Polarisert lys splittes i to, og går igjennom om prøven separert med en
avstand på 100-150nm. 150nm. Etter objektivet samles lyset igjen, og går igjennom en analysator
(lineær polarisator). Her slippes lys som er sirkulær eller elliptisk polarisert igjennom, mens
”uendret”, polarisert lys ikke slipper igjenn igjennom.
o I motsetning til fase og modulasjonskontrast er det ingen maske i lysgangen. Dette
gir full numerisk aperture, -> drastisk økning i aksial oppløsning, og mulighet for å
avbilde tykkere prøver. Oppløsning i DIC er overlegen fasekontrast trast i både xx-y
og z.
o Rotasjon otasjon kan gi bedre kontrast ( (konstant for fasekontrast)
o Prøver som er birefringent irefringent vil gi forvirrende signaler, her er fasekontrast bedre.
o Kontrastmidler kan brukes til DIC, ikke til fasekontrast.

• Modulation contrast er en teknikk for å få bilder som likner DIC (uten λ-filter (farger)), uten
dyrt utstyr. Oppdager optiske gradienter, og konverterer de til intensitetsgradienter. Det
baserer seg på en ”modulator” som slipper igjennom 100%, 15% og 1% lysintensitet.
o Modulatoren endrer ikke fase slik faseplaten i fasekontrast gjør.
• Polarisasjons mikroskopi: For å avbilde optiske anisotrope prøver.
o Oppbygningen består av en polarizator ved under kondensatoren, og en analyzer
(second polarizator), etter objektivet. Områder uten interferens blir blokkert, ellers
får vi positiv og destruktiv interferens som ved DIC.
o Gir informasjon om absorbert farge, og grenser mellom områder med forskjellig
brytningsindeks. Dette gir informasjon og struktur og komposisjon av materialer, og
er nyttig til identifikasjon.
• De fleste gjennomsiktige materialer er optisk isotrope, noe som betyr at brytningsindeksen
er lik i alle retninger. Alternativet er en anisotropic birefringent crystal, hvor det er en
9

10
forskjell i brytningsindeks. Birefringence(B) = |ne - no|. Denne verdien vil ikke være konstant
på en prøve, men avhengig av retning den er orientert.
• Dark field mikroskopi fjerner ikke-diffraktert lys, og viser de små mengdene diffraktert lys
mot en svart bakgrunn. Condenseren blokkerer her ut det sentrale lyset. Hvis det ikke ligger
på noen prøve, og NA condenser er større enn NA objektiv, vil alt fremstå som svart, da ikke
noe lys entrer objektivet. Dette kan sammenliknes med å fjerne en DC komponent.
• Dichromatic filter reflekterer lys under en viss bølgelengde, og lar lengre bølgelengder
passere. Dette benyttes i ikke-transparente prøver, hvor objektivet blir brukt som både
condenser og objektiv.
• Inverterte mikroskop har lyskilden over prøven, og objektivet under. Kjekt for tykke
prøver, men dette kan også brukes til epiilumination set-up. (Lys og refleksjon igjennom
objektivet, eks fluorescens).
• Lysintensiteten til fluoriscens er stusselig, kanskje I/I0 = 10 -12 eller mindre.
• Tap av fluorescens kalles fading, og kommer fra to prosesser:
o Fotobleking: Flurophoren minster permanent sin mulighet til å fluorisere
grunnet foton-indusert skade. Dette kan skje etter noe få til noen millioner
eksitasjoner fra singlett til triplett tilstand.
o Quenching: Eksitert tilstand mister energi på en ikke-strålende måte; til
naboatomer.
• Fluorescent Resonance Energy Transfer, FRET: Overføring av energi fra en donor til
akseptor uten eksitasjon av foton. Emisjonsspekteret for donor må overlappe med
eksitasjonsspekteret til akseptor, og avstanden må være < 100Å. Er proporsjonal med r -6 .

Total internal reflection fluorescence microscopy, TIR TIRFM
• Selv om lys blir totalreflektert fortsetter en eksponensielt avtagende bølge ( (Evanescent
wavefront) over kanten. Denne kan eksitere fluorophores, men da bare de nært overflaten.
• Brukes mye til studier av overflater, likevekter ved binding til overflaten overflaten, , membranmodeller,
binding til overflate sfa dipolretning osv.
4. Prinsipper i LASER
• Når et foton treffer et atom i grunntilstand kan dette føre til stimulert absorbsjon
(eksitasjon), hvis energien er riktig. Raten fra tilstand 1 til 2 er gitt som: R RR12(abs)
= B12N1ρ,
Hvor B12 er Einsteins koeffisient for stimulert absorbsjon, N er antallet i tilstand 1, og ρ er
energitetthet pr frekvens på innkommende fotoner.
• Spontan deeksitasjon sender ut et random foton. Dette går i random retning, ingen spesiell
fase og er inkoherent. erent. Dette kannes flourescense eller spontaneous emission. Raten til dette
er: R21(spon) = A21N2. . A er koeffisient, N er antallet i tilstand 2.
• Ved ekstern stråling (innkommende fotoner), kan atomet miste energi ved stimulert
emisjon. Sannsynligheten for dette er proporsjonal med intensitet på innkommende lys lys, og
fotonet vil ha samme fase, frekvens retning og polarisering som stimulerende foton. De er
11

12
uadskillelige på alle måter. Raten for stimulert emisjon er: R21 (stim) = B21N2 ρ. B er igjen
Einsteins koeff for stimulert emisjon.
• For et ideelt materiale med kun to energitilstander vil: absorbsjon = stim.em + spon.em.
Dette vil ikke kunne lage noen laser, ettersom N2 >N1 for at det skal fungere. En må få
systemet ut av likevekt, noe som kalles population inversion. (Sannsynligheten må være
større for at innkommende foton fører til stimulert emisjon enn absorbsjon). Atomet må da
vente i en metastabil tilstand, til et foton med rett energi kommer og fører til stimulert
emisjon.
• Populasjons inversjon oppnåes enten ved elektrisk eksitasjon til tilstand f, eller ved optisk
eksitasjon (absorbsjon) av det aktive mediet.
• I bakkant er fotonene reflektert 100%, fremme vil en output coupler slippe ut en del som
laser output, resten reflekteres.
• Aktive medier (eller gain medium) må ha en metastabil tilstand for å støtte stimulert
emisjon. De har normalt 3 eller 4 energinivåer, hvor 2/3 er en metastabil tilstand.
• Absorbsjon av energi er selvsagt et krav for eksitasjon, og kan komme fra gjøres enten optisk,
elektrisk, kjemisk eller termisk. Dette kalles en energy pump source.
• Kun fotonene som har rett frekvens og kommer langs med den optiske aksen blir reflektert.
For å bidra til multipass amplification må fotonene oppfylle følgende: nλ = 2l. Hvor l er
avstand mellom speilene, og n et heltall.
• En laser har forskjellige intensitetsprofiler i snitt, som kalles transverse modes, TEMmn .
TEM00 har minst mulig beam divergens, og er diffrasksjons begrenset. Denne moden kalles
Gaussian beam, og har en Gausissk fordelingsprofil.

• Lasere kan være continuerlige (CW, continous wave) eller pulsed.
• Pulsed lasers kan lages på tre måter:
o Elektrisk og lampe : kilden til pumpen pulseres( pulseres(µs).
o Q-switching: switching: Et optisk element (q (q-switching element) endrer reflekterende
egenskaper, og kan åpne for output veldig kort (5 (5-20nsec) 20nsec) og så slippe ut energien i
laser cavity.
o Mode-locking: locking: Ned til pico pico- og femtosekunder. Pulser kommer ved ”round trip time”,
tiden det tar frem og tilbake mellom speilene. Ekstremt høy peak energy. Begrenses
av Heisenbergs usikkerhetsprinsipp mellom pulse width (time) og energi energi-usikkerhet.
Frekvens c/2l.
5. Confocal laser scanning and diffraction unlimited microscopy
• Spatial filtrering ved et pinhole aperture fjerner all annen drit i bildet. t. Det er dette som gjær
confocal awesome!
13

• Multifoton microskopi; fotonkonsentrasjon 1mill ganger enkeltfoton eksitasjon. Krever highpower
mode-locked pulsed lasers. Ca 100fs, at 100MHz. De virtuelle tilstandene har en
levetid på 0.01fs, så de forsvinner før neste puls.
• Multifoton slår Confocal Laser Scanning Microscopy på flere områder:
o Multifoton eksiterer KUN i fokalpunktet, ikke over og under
� Dermed ingen fotobleking/skade
o Trenger dypere av to årsaker:
� Bruker nær-infrarød laser, som spres mindre
� Ingen absorbsjon annen en i fokalpunktet.
• I vanlige microskop er oppløsningen begrenset (diffraksjon) av bølgelengde og NA på
systemet.
• RESOLFT: Reversible Saturable OpticaL Fluorescense Transition (wikipedia). Reversible
Saturable Optically Linear Fluorescense Transition (kompendium). Navn på en rekke
metoder for å bryte diffraksjonsgrensen til lys. Tull sier du? Ja, det kan være, men med noen
triks går det helt fint. Episk krangling om det kan brukes til noe mer enn kun ideelle prøver
bestående av polymerkuler.
o Alle metodene bruker triks med en smultring hvor kun fluorescens er mulig i midten.
Dette kan gjøres ved interferens.
14

• STED: Stimulated Emission Depletion (microscopy): Første implementasjon av RESOLFT (en
annen implementasjon av RESOLFT er GSD Microscopy, Ground State Depeltion) . Teoretisk
10x diffraksjonsgrensen, men praktisk 5-7 ganger grunnet ugjevn smultring. Benytter seg av
at fluorescens ikke finner sted hvis et eksitert atom bringes ned til grunntilstand igjen ved
stimulert emisjon. Kun områder som ikke belyses av ”stimulert emisjon laseren” vil
fluorescere.
o 1: Belys stort område med diffraksjonsbegrenset laser
o 2: Før (i tid) fluorescens rekker å skje, deeksiter molekyler i smultring ved stimulert
emisjon. Kun midten vil da kunne fluorescere.
6. Preparasjon av biologiske prøver for lysmikroskopi
• Mange måter, avhenger av type kontrast, mikroskopi, hva som skal vises etc.
• Smearing: Legge en prøve mellom to glass, veldig enkelt. Fungerer kun for løsning, blod etc.
• Biologisk vev kan ikke kuttes tynt nok for lysmikroskopi uten å ødelegge preparatet. For å
klare dette må vevsprøven fikseres først.
• Fixation: Kan gjøres enten kjemisk eller fysisk ved frysing. Ideal fixation agent gjør følgende:
o Inaktiverer enzymer, spesielt de i auto-katalytiske reaksjoner.
o Immpbilisere alle komponenter i vevet så de ikke flyttes i de neste stegene.
15

o Endre permabiliteten teten til cellemembranen slik at ingen swellig/shrinking occur due to
osmitic changes.
o Øke mekanisk stivet slik at tynne slices kan lages.
o Beskytte mot bakterier/virus om prøven skal lagres lenge
o Gjøre endringer som fører til bedre kontrast :P
• Ingen enkel kjemisk metode kan gjøre dette. Kjemiske
metoder vil først denaturere og koagulere proteiner.
Deretter Krysslinke/ forme kovalente bindinger mellom
aktive grupper.
• Frysepreparering av vev gjøres i et medium for kjøles ned
av N2. Flytende.
• Vann byttes gjerne ne ut med etanol eller parafin (eller annet
organisk løsemiddel) for å få løst opp stæsj.
• Staining eller merking av en bestemt del av vevet er viktig
for å få kontrast. (Absorbsjon av lys)
• Eosin stains cytoplasma, bindevev og kollagenfiber, mens
methylen blått lått sainer chromatin og kjernen.
• Alexa Fluor er en ny generasjon stabile fluorochromer som
dekker hele spekteret fra IR til UV.
• Autoradiografi: Mikroskopimetode for å detektere posisjon
til radioaktive komponenter i en prøve. Bruker samme
prinsipp som fotografisk ografisk film, som blir observert i et
mikroskop. I senere tid har også digitale løsninger blitt
mulig med scintillator detektroer. Forskjellig stråling fra forskjellige isotoper bestemmer
oppløsningen, fra 0.5 - 10 10µm.
16
Andre bruksområder ruksområder for lysmikroskopi
• Fluorescence recovery after
photobleaching (FRAP). En metode for å mmåle
diffusjon, fusjon, i cytoplasma, membraner eller EM
(ekstracellulær matrix). Kan bleke med både én énog
to-foton foton eksitasjon, men kun to to-foton
eksitasjon kan brukes til å måle 3D diffusjon.
• Traction force microscopy: Observasjon
av lokal deformasjon av celle. Til dette bruker en
et elastisk substrat, og kan få ut et vektorkart
over traction forces.
• Enkeltmolekylers bevegelse kan bli
studert med FRAP og følge enkeltpartikler. Mean
square forflytning av en partikkel ved diffusjon er
gitt som: = 4Dt α Enkeltmolekylers bevegelse kan bli
studert med FRAP og følge enkeltpartikler. Mean
square forflytning av en partikkel ved diffusjon er
, hvor D er
diffusjonskonstant, og α angir diffusjon. α = 1 gir
normal diffusjon, over og under gir hhv retarded
diffusjon og superdiffusjon. α endrer seg gjerne
med tid, da molekylet møter begrensninger
(membraner, matrix, drit ++)

• Slik single molecule movement ovement brukes til å studere kinesin kinesin-bevegelse bevegelse langs microtubuli.
Kinesin frakter membranbundede vesikler eller organeller.
• Polarisert fluorescens microskopi kan brukes til å studere rotasjonsbevegelsen til ATPase ATPase, og
selvsagt andre ting....
7. Fluorophorer
• FluoProbes: En serie fluor fluoriserende dyes utviklet for å forbedre standard fluorophores.
• Mange faktorer må taes hensyn til ved valg av fluorophore; tidsskala, kjemiske omgivelser,
prosessen/molekylet som skal avbildes.
• Kan deles i to kategorier; de som finnes naturlig, intrinsic, og de som må tilsettes en prøve
for å oppnå ønskede fluoriscerende egenskaper, extrinsix.
o Naturlig/Intrinsic Intrinsic: Aromatiske aminosyrer, enzym-kofaktorer
o Tilsatt/Extrinsix: Extrinsix: Organiske dyes; tagger aminosyrer, nukleinsyrer, thiolgrupper og
membraner. I tillegg brukes proteinfamilien kjent som GFP, green reen fluorescent
protein mye.
Intrinsic fluorophores:
• Tre aminosyrer minosyrer i proteiner bidrar til intrinsic fluorescens. Det er Tryptofane Tryptofane, tyrosine og
phenylalanine. Deres ”quantum quantum yield yield” avhenger veldig av folding.
o I foldet tilstand/hydrofob løsning er de plassert inne i proteinet, og fluorescerer med
høy intensitet. Uf Ufoldet/hydrofil gir liten intensitet.
• De metabolske enzymene FAD og NADH er autofluorescerende.
Extrinsic florophores:
• Det finnes en extrinsic fluorophore for nesten alle mulige formål i dag.
• Fellers for organiske fluorescerende molekyler er at de består aav
gjentakende jentakende enkelt og
dobbeltbindinger mellom karbon, i π-bindinger. bindinger. Her sitter elektronene løst (de kan vandre
fritt), og derfor er det lite energi som skal til for å eksitere fra grunntilstand. Jo lengre system
med π-bindinger, bindinger, jo lettere kan det eksiteres, og jo mer rød-skiftet er fluorescens fluorescensspekteret.
• Disse se er også veldig små, noe som er handy når de skal bindes til ma makromolekyler.
romolekyler.
• Quantum yield for fluorescen fluorescens:
Dette kan være 0,25 eller 0,7 7 for enkelte indikatorer.
GFP proteiner
• GFP (green green fluorescence protein protein)er et
fluorescerende protein som komme kommer fra bla
pacific jellyfish. . Har en barrel barrel-struktur,
bestående av α-helix helix og β-sheet.
• Er ikke-invasiv i cellene.
• Fra manet har GFP eksitasjonspeaks ved 395
og 475nm, og fluorescerer med en
intensitets-peak peak på 509nm.
• Mange muterte GFP er også fremstilt, og en kjenner genet som lager det.
17

Kvanteprikker, Quantum dots, Q-dots, QD, Q-doggy D,
• Halvledende nanopartikler, opp til 100x bedre fluorescens enn organiske fluorephorer med
mye lengere levetid på emisjon (100s av nanosekunder).
• Består av en halvleder, med en coating av et nytt halvledende materiale.
• For å oppnå biokompitabilitet i polare (vann) løsninger, må de igjennom ytterligere
overflatemodifikasjoner. Her er det to forskjellige prosesser som gjelder.
• Forskjellig farge (med smale eksitasjonsspektra) avhengig av størrelse, alle eksitert med
samme UV-lys.
• Ikke utsatt for biologiske reaksjoner, fotobleker ikke så lett.
• Siste steg er å få de bundet til et biomolekyl.
• QD er ca 20x lysere og 100x mer stabile enn tradisjonelle fluorescens-molekyler. Baksiden er
at inorganiske halvledermaterialer er giftige for levende systemer.
• Fluorescens i ionekonsentrasjoner er viktig i fysiologiske sammenhenger, og mange
molekyler kan gjøre dette. Felles er at de fleste ioneindikatorer skifter bølgelenge i enten
eksitasjons- eller emisjonsspektrum. (Eller begge deler.)
8. Detektorer
Human eye
• Omtrent sfærisk. Innsiden, vitreous humor, er
en optisk gjennomsiktig gel.
• Lysbrytning skjer hovedsakelig i overgangen
luft/cornea, da brytningsindexen til cornea er
nc = 1.376.
• Inne i aqueous humor er det et diafragma
(pupillen), som regulerer intensiteten på
innkommende lys. Fra 2mm-8mm.
• Irisen er musklene som kontrollerer
pupildiameteren.
• Rett bak irisen kommer linsen, som er 9mm
diameter og 4mm tykk.
18

• Netthinnen eller retina er 0,05 – 0,1mm tykk og inneholder ca 125 millioner lysfølsomme
celler. Staver er følsomme for intensitet, tapper registrerer farge.
• Tapper finnes i tre typer, én for rød, grønn og blå.
• Inne i de fire typene celler er det fotopigmenter som starter en signalkaskade når et foton
når dem. Dette fører til en hyperpolarisering, som omformes til aksjonspotensial.
Photomultiplier tubes, PMT.
• Single source, brukes i Flow cytometri og scanning microskopi.
• Et foton fører til en kaskade av elektroner. Én fjær -> fem høns. Ét foton -->
1*10
Ordtak blir fattige!
8 elektrons.
• Kort responstid, strøm proporsjonal med fotoner.
• Fotokatodene avgjør en rekke egenskaper for PMT, som spektral respons, kvanteeffektivitet,
sensitivitet og mørkespenning ( (termisk eksiterte elektroner, aka støy.).
• De beste fotokatodene har kun en kvanteeffek kvanteeffektivitet på 30%, -> > 70% av fotoner fører ikke til
kaskade.
• Kan kjøles ned for å redusere termisk bakgrunnsstøy.
• Må ha vakuum, bruker fotoelektrisk effekt og sekundær emisjon av elektroner. Hver dynode
har høyere positivt potensial.
Fotodioder
• Halvledere, typisk p-n n junction.
• Hvis energien på innkommende foton er større enn EEgap
trekkes elektroner til conducting
band fra valence band. Disse elektron elektron-hull hull parene er proporsjonale med intensitet på
innkommende lys.
• Kan brukes uten biasspenning ( (photovoltic mode) eller r med reversed biased spenning, kalt
photoconductive mode.
• Avalanche photodiode: : Svært høy reversed bias, opp til 2500V, og tynt depletion layer. Fører
til avalanche av elektroner…
Video camera
• Inneholder vidicon tubes tubes, som er 2-3cm sylinderisk rør, 10-20cm langt.
• Har et entrance window tett fulgt av fotosensitivt lag. Dette laget lagrer ladning, som leser av
ved scanning av en elektronstråle.
• Blitt erstattet av CCD ++ på slutten av 80 80-tallet.
19

CCD camera
• Charged Coupled Device: Et array av lysfølsomme kondensatorer (ladningsbanker).
Krystallisert silicon omgjør et innkommende foton med energi over 1,1eV til et elektron.
Dette elektronet fanges i en potensialbrønn under.
• En positiv spenning kan lese ut hva som er i potensialbrønnene, og dette gjøres rad for rad,
hvor elektrisk ladning overføres mellom nabobrønner. Output blir da en seriell rekke.
• Seriell rekke overføres til output amplifier, som gir et signal proporsjonalt med ladningen i
hver ladningspakke.
• Overføringen foregår under overflaten, og er fri for forstyrrelser, men CCD må blokkeres for
innkommende lys. Kan gjøres hundrevis av ganger uten tap. Styres av en ekstern spenning
som åpner og lukker gater.
20

• Typer CCD:
o Full frame: Trenger en lukker; Først lagres lys, så leser det ut. (Hvis lys slipper inn ->
smearing)
o Frame-transfer: To CCD i tandem. Den ene fanger lys, og overfører til nr 2 som tar
seg av utlesning. Trenger ikke lukker, og kan operere kontinuerlig. Nr 2 er dekket av
en opaque maske, fjernes denne kan hele brukes som full frame.
o Interline transfer CCD: Har en rad med parallell register per rad med pixler. Ved
readout er hele bildet shifted til denne ”interline” raden. Denne raden fanger ikke
fotoner, og derfor er halve CCD ikke tilgjengelig for fotoner. -> Dårlig sensitivitet.
• Mørkespenning fra termiske eksiterte elektroner setter nedre grense for deteksjon, CCD kan
kjøles ned for å forbedre denne.
• Økende pixelstørrelse øker SNR. (Kapasiteten i potensialbrønnen er proporsjonal med
arealet.)
• CCD er monochromatisk. Farger må separeres før CCD; dette gjøres på to måter:
o En CCD med fargefilter, kun 1/3 av fotonene blir da registert.
o Tre CCD, hvor innkommende fotoner separeres til hver sin sensor. Mister ikke
intensitet.
• Tynne CCD’er er mer følsomme for x-ray til NIR.
• Oppløsning er bestemt av pixelgeometri. Det er ingen dead-space mellom pixler, et foton
faller inn i nærmeste brønn.
• Quantum efficiency til CCD er effektiviteten for at foton blir elektron. Denne er avhengig av
energien til fotonet (bølgelengde). Vanligvis er denne dårlig for UV, men kan forbedres med
et bølgelengde-konverterende belegg på overflaten.
• Siden QE er avhengig av bølgelengde som gitt under er ikke sammenhengen lineær. Dette
kompenseres gjerne for i ettertid.
21

• Korrekt fokus er selvsagt viktig, chromatiske aberrasjoner blir synlig…
• Intensified CCD kan registrere enkeltfotoner. Her er lyset først sendt igjennom en intensifier
først, som øker signalet lineært. Denne fungerer som en PMtube. Egnet for dynamiske/raske
studier, med lite lys.
• I PM-tuben er det elektroner som øker i intensitet, men i enden når de en phosphorescence
screen, hvor elektronene danner fotoner. Etter denne kommer da CCD. Spektrumet til
innkommende lys er bevart.
• Tre generasjoner. Gain fra 10 – 10 6 . Generelt er mer gain mindre oppløsning og vica versa.
• Fotoner som blir emittert er tidsfordelt stokastisk etter en Poisson fordeling.
• Noise kommer fra fire områder;
o Photon noise: Kan ikke fjernes
o Thermal noise(dark current, hot pixels). Stokastisk prosess, Poisson-fordelt. Øker
eksponensielt med temperatur, øker med faktor 2 pr 6 o C.
o Quantization noise. Lite, normalt neglisjert. Fra avrundingsfeil. Nok bits i ADC er bra.
o Readout noise (amplification, electronic noise). Øker med oppdateringsfrekvens. God
design eliminerer mye.
22

9 Flow cytometri
• Samler info to fysiske parametere: flourescence og lysspredning, fra en populasjon. Mengden
flourescens må være proposjonal med hva som skal oppdages.
• Laminær strømning på 0.1mm igjennom fokalpunktet til lyskilden.
• Etter objektivlinsen kan lyset gjennomgå flere dichomatiske speil for å skille bølgelengder,
eventuelt polarisasjon. Til slutt havner lyset i PMTs.
• Det er også vanlig å detektere spredt lys. Dette skiller seg fra fluorescens ved at det har
samme bølgelengde som innkommende lys (elastisk spredning), fluorescens har lengre
bølgelengde.
• Spredningen måles i to retninger;
o Forward: (low angle): Hovedsakelig størrelsen på cellen. Intensiteten av utsignalet
brukes som en distribusjon av størrelse på cellene i prøven.
o 90 o : Struktur og form på cellen.
• Svært kritisk at alle celler blir belyst én og én, i jevn hastighet og med samme intensitet.
Dette løses med en sheath flow, og en elliptisk laserstråle.
• Celler kan sorteres i FCM, dette krever vibrasjoner i celleholderen (40kHz) for å dele opp
strømmen i dråper. Dråpene blir gitt en ladning når de passerer lyspunktet, og bøyes av med
elektrostatiske krefter lenger nede.
• Dette klarer å sortere 5000 celler/sek, én ml med blod inneholder 10 10 erytrocytter. Fact.
Eksempel på bruksområder
• Vanligste bruksområde er å bestemme hvor i cellesyklus cellene befinner seg. Dette krever
celler i løsning, med fluorescens på DNA.
• Dette gir et DNA histogram, med tre områder: Celler i G1, S og G2 og M fase. G2 og M fase
kan ikke skilles med FCM, da de har like mye DNA.
23

• Kan etter litt regning deles i alder etter tid og antall i tilstand. Regning.
• Enten ved bruk at antistoffer eller spesifikke molekyler kan proteinkonsentrasjoner påvises.
Sammen med aldersfordeling kan proteininnholdet i alle deler av cellesyklus bestemmes.
• Et annet vanlig bruksområde er å klassifisere celler etter membranreseptorer. Dette kan
brukes til å se på immunrespons hos hvite blodceller.
• 2D plot av side/forward scatter kan brukes til å skille celler basert på form og størrelse.
24

• Opp til 6-12 12 parametere kan observeres samtidig, og korreleres korreleres. . Dette er et veldig bra
verktøy.
• RNA-tagging tagging sier noen om aktiviteten i biosyntese.
10 Optical traps and tweezers
• OT bruker fokusert laser til å bevege nanosized objects. (Celler, molekyler)
• Kan gjøres helt harmløst til levende celler.
• Kan måle krefter i fra 10 -
Kan gjøres helt harmløst til levende celler.
• Antar alltid gaussisk laserstråle
• To ting skjer:
o Partikkelen blir dratt med i retning av fotonene grunnet scattering av fotoner
o Partikkelen tiltrekkes den delen av strålen med høyest ooptisk
ptisk intensitet.
• Dette skjer kun når brytningsindeksen er høyere enn for løsningen, motsatt effekt for
luftbobler.
25
-13 -10
-10 N, mellom partikler og omgivelser. AFM kan 10 -10 -10 -7 N.

• Kommer fra bevaring av moment til fotoner:
• Optical force kan beskrives som:
26
�� = ���� + �� ��� ��� �����
� � ������������ � = ��
� ��� = � ��
� �
Hvor n1 er brytningsindeksen til mediet rundt, P er laser power, Q er trapping efficiency
factor, som er avhengig av geometrisk form, figur, material og refleksjon. Speil gir Q = 2.
• Normalt krefter er i området fN – pN, en typisk celle på 1µm opplever en gravitasjonskraft på
10fN som må balanseres av lystrykk.
• Energitettheten lagret i en dielektrisk partikkel er minimert når den er plassert i midten av en
stråle.
• Vanlig teori fungerer ikke for gaussisk laser under high-NA objektiver; paraxial approx blir
ugyldig og ”the beams waist width” er ikke leger triviell. Derfor utviklet egen OT approx teori!
Disse avhenger av bølgelengde og partikkelstrørrelse, og gir derfor to områder:
o Geometrisk regime (a >> λ): Mie regime, kan tegne lys som rette linjer som
transporterer moment. Kun snell’s lov ved overgang, og konservering av moment.
Kommer også bidrag fra scattering. Moment overført fra utadgående lys gir Q,
trapping efficiency.
� Aksial trapping: ”of axis” lys brytes ut av kulen på baksiden, og dytter den
inn mot høyest intensitet. Forklarer viktigheten av gaussisk
intensitetsfordeling av laseren.

Design av OT
27
� Lateral trapping: Enhver dielektrisk partikkel med høyere n enn mediet rundt
vil dras mot fokus og samles der. Partikkelen skyves mot dit lysstrålene
krysses. Spredning vil gjøre at partikkelen vil ligge like bak krysningspunktet.
o Rayleigh regime (a 1.
� � = �
2 ∇〈�� 〉, � = � � � � � (�� − 1)
(� � + 2)
� For at en partikkel skal være stabilt fanget må gradient kraften være sterkere enn
den aksiale kraften, og den termiske energien til den brownske partikkelen må være
mindre en det optiske potensialet U. exp(-U/kbT)

• Viktige elementer: High-NA objektiv til laseren. Bruker ofte mikroskopets objektiv. Spredt lys
fanges opp av Quadro photodiode for å registrere bevegelse, og kan brukes til kraftmålinger.
Posisjonsdeteksjon
• Brownsk bevegelse er gitt av
28
〈� � 〉 = 2�� ����� 〈� � 〉 = 6�� , ℎ��� � = � ��
3���
• Hvis en partikkel har større energi enn ~kbT kan den unnslippe OT.
• The optical trap har form som en potensialbrønn hvor partiklene fanges. Kraften er
proporsjonal med trap stiffness (fjerkonstant), F = -kx.
• Krefter på en partikkel er bestemt ut ifra forskyvning fra senter av laseren i denne brønnen.
Dette kalles Back-focal-plane Interferometry (BFPI). Laseren brytes igjennom partikkelen, og
dette lyset fanges opp av en kvadrant fotodiode.
• Fire områder leser av fire spenninger, som igjen kan omdannes til relative koordinater Qx og
Qy, som er proporsjonale med fysisk forflytning og normert for intensitet. Siden F er
proporsjonal med x (F = -kx) er Q proporsjonal med F på kulen.
� � = �� � + � �� − (� � + � �)
� � + � � + � � + � �
• En konstant faktor β, kalt detektor sensitivitet oversetter Qx til fysisk forflytning.
� = �� � , � = �� , � = ��� �
• Vanskelig å finne β og k analytisk, og må derfor kalibreres eksperimentelt ved å se på fourier
power spectrum. Utledningen av dette står i kompendiet på side 179-180
Bruk av OT
• Strekke DNA. Fester endene av DNA til polysterenekuler, og drar i disse. Forskjellige krefter
regjerer.
• Ionestyrke i løsningen påvirker DNA’s persistence length.
• Under normale fysiologiske forhold har DNA α-helix med 10,4bp per turn, men om den
strekkes finnes flere konfigurasjoner med høyere energi. Dette tar en stigeform.
• Kan også brukes til å studere proteinmotorer og elastisitet til andre polymerer som titin i
muskler.

11 Bruk av elektriske felt og lyd til å bestemme ting
Micro elektroforese
• Alle partikler/celler med en netto ladning vil påvirkes i et elektrisk felt; F = qE.
• For en sylidrisk partikkel balanseres denne kraften mot F = 6πηrv, hvor η er viskositet og r
hydrodynamisk radius.
• Ved hjelp av dette finner en ladning: q = F = 6πηrv/E
• Avhenger av avstand til veggene i glasset.
Volum spektromertri
• Alternativ til flow cytomerti .
• Ser på elektrisk motstand mellom to elektroder i en ringformet aperture.
• Det er en strøm igjennom aperturen, og partikler vil endre motstanden. Typisk er aperturen
50 eller 100 µm.
• Dette kalles en Coulter counter. Et problem er å skille mellom én stor eller flere små
partikler. Kan bli så god som 3% (for 1 µm partikler) ved å hydrodynamisk sentrere partiklene
igjennom aperturen.
Lyd som probe
• Scanning acoustic microscope (SAM): Fungerer litt som ultralyd.
• Høyest mulig frekvens gir best oppløsning, begrenset av absorbsjon av lyd i prøven. Dette
skjer ved 2.6GHz ved 37 o for prøver med mye vann. Ved 60 o kan frekvensen økes til 3GHz,
som svarer til 520nm.
• Fokuseres på samme måte som lys.
• Kontrast kommer fra endringer i elastisitet og tetthet, ikke brytningsindeks.
• Scanning laser acoustic microscope (SLAM): Laser scanner en glassplate bak prøven, og kan
dermed detektere endringer i trykk fra lydbølger. Lite interessant for biologiske prøver.
12 Bruk av kraft til å bestemme stæsj
Intramolekylære krefter
• Kan deles i tre kategorier:
o Elektrostatiske krefter: Ren Coulomb kraft mellom ladde molekyl. Kraft som påvirker
en ladd partikkel Q2 er gitt av F = Q2*E. E er elektrisk felt og kan komme fra andre
partikler, plater, staver etc.
o Polarisasjonskrefter: Krefter mellom induserte dipoler. Alle atom og molekyl er
polariserbare, med en polarisasjonsfaktor α. uind = α*E. For ikkepolare molekyl vil et
E-felt dra i den negative elektronskyen, slik at det blir en ladningsfordeling. Hvis
elektronskyen blir skiftet en avstand l, blir indusert dipolmoment: uind = α*E = le
o Nærkrefter (QM): Kovalente bindinger, kort avstand repulsjon- attraksjon.
• Mellom et ion og et uladd molekyl vil det være tiltrekning. Dette kan forklares på følgende
måte: Ion lager elektrisk felt -> upolart molekyl blir indusert dipol -> Er-felt fra dipol retter seg
inn i E-felt fra ion med motsatt ladning av ionet rettet mot ionet.
• Elektrisk felt fra dipol er:
29

30
�� = − 2���� = −
4�� �
���
• Tiltrekningskraften kan da beskrives som F = -ze*Er
2� ��
(4�� ��) � � �
Van der Waals krefter
• Består at tre ledd, som alle er r 6 -dependent.
o Keesom force: Roterende permanente dipoler
o Debye-interaction; mellom permanent dipol og upoplart molekyl
o London dispersion force, aka dispersjonskrefter, induced dipole – induced dipole
forces, charge fluctation forces.
• Dispoersjonskrefter (london); er en midlertidig kraft mellom alle atom og molekyl. Denne er
alltid til stede. Normalt kommer største bidraget til Van der Waals fra dispoersjonskrefter,
med unntak av små, polare molekyl (vann).
• QM er nødvendig for å forstå dispersjonskrefter.
• Dispersjonskrefter: tidsmidling av dipolmoment er null, men fluktuasjoner i
elektronfordelingen skaper alltid midlertidige dipoler. Dette fører til attraksjonskrefter.
• London var en mann som i 1930 kom frem til et utrykk for interaksjonsenergien i
dispoersjonskrefter ved bruk av QM perturbasjonsteori.
• Van der Waals sin r 6 -avhengighet kunne ført til det umulige tilfellet at alt bare smalt sammen
til et punkt. Dette skjer ikke, selvsagt pga en repulsiv part. Den repulsive kraften kommer fra
et hardt kule-potensial. Et normalt slikt potensial kan skrives
���� = � �
� ��
• n = 12 brukes ofte for et slikt potensial, hvor kraften raskt blir stor for σ>r…
• En vanlig kombinasjon av Van der Waals og repulsiv kraft er Lennard-Jones, 12-6,
potensialet: (B er tiltrekning)
���� = � �
−
��� �� • Spesifikke interaksjoner kjennetegnes ved ikke-kovalente bindinger som gir opphav til sterke
bindinger mellom molekyler eller overflater. Eksempler på slike er antigen-antistoff,
reseptor-signalmolekyl. Generelt, macromolekyl og dets kjæreste.
AFM, Atomic Force Microscopy
• Ble utviklet i 1986, som en forbedret utgave av STM (scanning tunnelig microscopy), som
krever ledende overflate.
• AFM kan avbilde omtrent enhver overflate.
• AFM måler tiltrekkende eller frastøtende krefter mellom proben og prøven. Proben er spiss
og skannes over prøven, og avbøyes etter Hooke’s lov: F = kx.
• Måler krefter i nN-området. Dette inkluderer mekanisk kontakt, Van der Waals,
kapilærkrefter, kjemisk bindings krefter, elektrostatiske krefter, magnetiske krefter osv.
• Har to modes:

Design
31
o Repulsive contact mode: indikerer prøvehøyde når det skannes over. Gir et
topografisk kart.
o Noncontact mode: Gir topografisk kart fra attraktive krefter uten å poke prøven.
Begynner ved noen hundre nm og øker kraftig mot prøven.
Piezoelektrisk
• Piezoelectric scanners retter inn prøven med en presisjon på sub sub-nm. nm. Piezoelektriske
materialer endrer dimensjon når en spenning er påført, eller vica versa.
• Piezoelektriske materialer er laget av noe ikkeledende, som krystaller eller keramiske
materialer. Felles er r at kun små forflytninger er mulig, men med en svært høy presisjon.
Fremfor høy spenning brukes derfor en ”stack” for å oppnå større forflytning.
• De første scannerene benyttet en tripod konfigurasjon, men det viste seg vanskelig å
bestemme resonansfrekven
resonansfrekvens. I dag benyttes en tube skanner geometri, , hvor det
piezoelektriske materialet er lagt i lag rundt en tube med fire elektroder.
• En typisk piezo konstant er 5nm/V, og har resonansfrekvens fra noen noen-kHz kHz til 100kHz.
• Testing og kalibrering, mot enten en kjent prøve eller mot en motstand, er viktigere enn
beregninger. Dette skyldes temperaturavhengighet, ikke ikke-lineraritet lineraritet og hysteresis i
piezoelektriske materialet.
• Kan enten flytte på prøven (tregt, grunnet resonansfrekvens til systemet) eller på tippen
(stress, da må laseren også scannes bortover).
Cantilevers (tupp tupp + tupp holder holder)
• Kan stille tre krav:
o Skarp spiss; ; opplagt, for høy oppløsning.
o Ingen perturbasjon av prøven prøven: Krever lav fjærkonstant k, (k < 10N/m) for å ikke
påvirke prøven.
o Lett påvirkelig: Avbøynin Avbøyning på

• Kan kjøpes i alle former og fasoner, silicon nitride mest vanlig. Karbon-nanotubes tøft.
• Reflekterer normalt laserlys til en posisjonssensitiv photodetector. Vertikal posisjon avgir
høyde, mens horisontal kommer fra cantilever-twisting som følge av friksjon.
• Hele systemet må kalibreres fra tid til annen, dette gjøres gjerne mot et kjent grid på
15x15µm.
AFM modes
• Deles i to(tre)
o Contact mode: Kun adskilt med noen Å, og er i det repulsive området for
intramolekylære krefter. Gir info om topografi og elastisitet. Brukeren etter en
kontakt-condition. Kan opereres under konstant høyde eller konstant kraft. Ulemper
er mulig deformering, selv om cantileverens fjærkonstant er lav. Capillary krefter må
også tas høyde for, som skyldes vann som kondenserer på en tørr prøve.
o Oscillating mode: Unngår en del av ulempene over. Drives ved frekvens nær
resonansfrekvensen. Nærme prøven vil frekvens, amplitude og fase endres, noe som
har gitt opphav til sann atom-oppløsning i ultravacuum. Kan enten benytte
frekvensendring eller amplitude (og fase) til å få informasjon om prøven. Kan dele
oscillerende mode i to deler:
� Non-contact: Stor avstand mellom tip og prøve, 100Å, større enn
oscillasjonene. -> små krefter picoNewton, som det er vanskelig å måle.
Cantileveren oscillerer med en frekvens tett opptil resonansfrekvens (100-
400kHz) og små endringer i frekvens kommer fra prøven. Bra til myke og
elastiske prøver.
� Tapping mode: Mellomting mellom non-contact og contact. Mest vanlig.
Tapper så vidt ned i prøven, og oscillasjonene dempes av prøve-tip repilsjon.
Større krefter enn non-contact, unngår problemet med kapilærkrefter. Kan
også brukes til fase-avbildning; hvor faseendring kommer fra stivhet og
viscoelastisitet.
• Samme komponentene brukes i alle modene over, det er viktige forskjeller i feedback
systemet som er annerledes.
• Beskrives av andre ordens difflikning for dempede, forced oscillasjoner.
• Repulsive krefter kommer fra Van der Waals, attraktive kan være Van der Waals,
elektrostatiske eller adhesive.
• AFM i veske har en stor fordel for biologiske prøver, da de kan avbildes i superhøy
oppløsning i tilnærmet fysiologiske omgivelser. Dette kommer ikke helt uten utfordringer:
o Laseren blir påvirket av brytningsindeks til veske
o Piezoelektriske ting blir ødelagt av veske
o Kantileveren blir utsatt for et viskøst drag, som reduserer resonansfrekvensen fra
noen hunde kHz til noen kHz. Dette fører til reduksjon av Q-faktor, og kan gjøre highres
imaging vanskelig.
o Ved hjelp av aktiv Q-kontroll kan en øke Q-faktoren. Dette får ut på å ha en feedback
loop som blir en drivkraft i difflikningen for bevegelsen i systemet, med en fase
shiftet π/2. Økt Q-faktor gir en stor demping i overharmoniske oscillasjoner, ->
bedre kontroll av kantilever oscillasjoner -> bedre oppløsning.
32

• Vertikal oppløsning i AFM er begrenset av termisk støy fra vibrasjoner i kantileveren, og er
avhengig av fjerkonstanten.
• Lateral oppløsning avhenger i veldig stor grad i geometri til tuppen, men også elastisivitet i
prøven og selvsagt høydeforskjeller. Nanotubes er bra.
Kalibrering
• Tre ting må kalibreres, den piezoelektriske skanneren, fjærkonstanten må bestemmes og
posisjonsdetektoren.
• Piezoelektrisk skanner: Piezoelektriske elementer har ikke-linearitet, hysterese og lang tids
forskyvning. Klart dette suger, og må fikses. Vanlig fikses dette med software og en kjent
rektangulær grid, på for eksempel 1µm for en 15µm x15µm skanner.
• Kalibrere fjærkonstanten k: Flere måter:
o Legge på en kjent masse m: Resonansfrekvensen til en kantileveren med effektiv
33
masse m er gitt som � � = � �
�
� Fest så en liten masse til på tuppen, m2 om du vil: ��� = � �
og k kan
�� �� lett bestemmes. Eneste er at det er stress å feste en masse på tuppen.
o Studere power spectrum av termiske fluktasjoner i kantileveren:
Ekvipartisjonsprinsippet sier at alle grader av frihet tilfører fluktasjoner lik ½kBT til
kantileveren.
1
2 �〈�� 〉 = 1
2 ��� � Termiske fluktuasjoner kan kjenners igjen i frekvensdomenet like rundt
resonansfrekvensen. Dette er VANLIGSTE metoden, og hvis du lurte
måler en 〈� � 〉.
Biologiske bruksområder
• Kan avbilde levende celler, og dermed gi informasjon om vekst, deling, bevegelse.
• Oppløsningen til AFM kan avbilde enkeltmolekyler, men globulære proteiner krøllet sammen
blir bare en dott.
• Generelt kan bare svært strukturerte overflates avbildes til maks oppløsning.
Atomoppløsning forutsetter svært lave kontaktkrefter, som mellom et atom på overflaten og
et på spissen av proben.
Forskjellige typer krefter
• Figur side 236.
• Van der Waals:
o To atomer opplever potensial på formen: w(r) = -C/r n
o Enkelt atom – surface: potensial på formen w(r) = -C/r n og må integrere bidrag fra en
kule på overflaten.
• Kapilærkrefter

34
o Vil alltid dannes et hydration layer på en tørr prøve med mindre det er ekstremt
fuktighetskontrollert.
o Dette vil gi adhesjon når cantileveren går opp, og kreftene kan i mange tilfeller være
sterkere enn det en ønsker å studere.
• Elektrostatiske krefter:
o Relativ overflateladning kan finnes med AFM. Dette krever at en kjenner Debye
shielding distance; som enten kan kalkuleres fra kjent ionekonsentrasjon, eller
bestemmes eksperimentelt.
• Brush interaction:
o Elastisk kraft som motvirker en probe som blir presset mot prøven.
o Ofte vanskelig å bestemme, men går for noen polymerer.
• Elastiske interaksjoner
o Hertz modellen beskriver elastisk deformasjon når to homogene, elastiske legemer
presses sammen.
� � = 4�√�
3�1 − �� ��/�
o Likningen over kan brukes til å bestemme elastiske egenskaper over en prøve. Y er
youngs modulus, og v er Poissons ratio, δ er hardheten til materialet.
Kraftspektroskopi med AFM. (Dynamic force microscopy with AFM)
• Mekaniske krefter er til stede en rekke steder I cellen, og omtrent alle steg av cellesyklus.
• AFM kan brukes til å direkte måle disse single molecule kreftene på både kovalente og ikkekovalende
bindinger.
• Fordel med liten fjærkonstant (soft caltilever) for å sensitivt måle krefter. Disse er mer utsatt
for termisk støy, som setter en
nedre grense på AFM til 10pN.
• I luft vil krefter fra tynne lag
med vanndamp dominere alle
andre krefter. -> må gjøres i
veske.
• Et force-distance diagram
består av et kontakt område
hvor tip og sample er sammen,
og et non-contact område.
• Størrelsen på hoppet når
kontakten ryker kalles
adhesion force, rupture force,
bryktningskraft eller whatever.
Dette er uansett en stokastisk
prosess, slik at det må gjøres
mange ganger og lages et histogram av utfallet.
• Slike forsøk krever ofte svært spesifikke tipper med funksjonelle overflater.

• Kan variere tilbaketrekningshastighet, dette kalles loading rate. Forskjellig loading rate kan gi
ny informasjon, og loading rate sfa gjennomsnittlig brytekraft kalles force spectrum.
Teori bak dynamisk kraftspektroskopi (DFS)
• Spredning i brytningskraft uansett hvor sensitive prober som brukes.
• En tip får vellykket binding kanskje 1 av 5-10 ganger. Dette er ønskelig, da det reduserer
muligheten for multiple bindinger.
• Brytningskraften er F == -k *Δx
• Avstand fra 0 kraft til transisjonstilstand måles som xβ. Ved romtemperatur er kBT = 4,1pN, og
xβ i området 0,1-1nm. Fβ = kBT / xβ
• Den mest sannsynlige kraften i et histogram av brytningskraft kalles bindingsstyrke.
• Loading rate: rf = kvt
• Høy loading rate gir korte levetider, men store brytningskrefter. Lave loading rater derimot
gir lang levetid med liten brytningskraft. Dette skyldes termiske krefter, og bindinger som kan
finne sammen igjen.
• Ved å plotte bindingsstyrke ved mange forskjellige loading rater sfa av log (loading rate) får
en et Dynamisk force spectrum. Her kan det plottes in en lineær linje, som kan gi mye
informasjon. En energibarriære gir en lineær linje. To gir to linjer.
• Energilandskapene til intramolekylære ikke-kovalente bindinger er langt mer komplekse. Et
bindingspotensial med flere peaks kan forventes. I et dynamisk kraftspektrum vil dette se ut
som stykkevis lineære områder, med tydelige knekk til neste. Denne knekken i stigning
skyldes en ytre barriere har blitt brutt og en indre har blitt dominerende kinetisk barriere.(se
side 260)
• Et vanlig eksempel er mellom biotin (et vitamin signalmolekyl)og streptavidin (protein
35
reseptor). Disse er nøye studert siden de har blant de sterkeste ikke kovalente bindingene i
biologi med flere dager levetid. Har tre bindingsområder, med xβ = 0,12nm, 0,5nm og 3nm.
• xβ angir fortsatt avstanden til en energibarriere.
• For å bestemme store intramolekylære krefter krever dette kovalent ankering.
Proteiner under kraft
• Mange proteinstrukturer er veldig sterke:

36
o Makroskala
� Collagen, tripple coil
� Silke, β-sheet
� Keratin i negler og hud
o Cellenivå
� Myoson-actin
� Kinesin-microtubulus
• Proteinfolding kan studeres med fri energi diagram. I likevekt er største delen i foldet tilstand
med lavest energi. Raten proteiner går fra foldet til ufoldet i likevekt er avhengig av høyden
på energibarrieren mellom tilstandene.
• Raten proteiner går fra denaturert til foldet tilstand kalles intrinsic folding rate constant, � � � .
• Ved unfolding kalles den intrinsic unfolding rate constant, � � � .
• Uten påtrykt kraft på proteinene overvinne en høy-energi barriere med energi ∆� �, og
bestemmer hvor fort proteinene vil denatureres av termiske fluktasjoner.
• Hvis det påtrykkes en kraft F, vil energilandskapet tiltes og sannsynligheten for å passere
over transisjonstilstanden øker. Unfolding raten kan da skrives:
∆������ (�)
�� = �� ��� • Mekanisk og kjemisk denatureringsrate er ikke samsvarende, og en tror de påvirker
forskjellig område av fri energi landskapet.
• Muskelproteinet titin er nøye studert. Det er lengste polypeptidkjeden vi kjenner til. Det er et
langt og fleksibelt molekyl, som krølles opp og pakkes sammen. Kraft spektroskopi gir en
sagtann formasjon under konstant loading rate. Denne er veldig karakteristisk, og
kjennetegner hvordan en og en del bryter, og så gir litt ”slakk” i kjeden.

Figur 1. Immunoglobulin domener i titin strekkes. De har en avstand på 25-38nm, og 150-300pN hopp.
• Kan også analysere ved forskjellig loading rate, og gir en lineær kurve som over.
Kraft på polymerer
• Nøye studert: tip med algenate polysakkarider mot overflate med epimerase proteiner.
• Ikke kovalente bindinger har en begrenset levetid. Alle vil ryke hvis de blir strukket med en
kraft over riktig mengde med tid.
• Forskjellige kovalente bindinger til tippen og overflaten vil ryke en etter en. Typen binding;
Si-O, Si-C, C-C, og C-N vil ryke etter styrke. Eksperimenter finner ut at Si-C ryker først.
37

15 Elektroner som probe
• Quantum baby. YEAH!!! H!!! Shrödinger’s time dependent quantum mechanical wave equation equation.
38
For elektroner er � � ��2���.
. For frie elektroner er bølgefunksjonen en planbølge med
bølgevektor
��� ��
�� 2�
2�
, � � , �� � �
� � � �
• Elektroner blir spredt redt av andre ladde partikler gjennom Coulomb kraft, og påvirket av
magnetfelt gjennom Lorentz force.
• En høyintensitets elektronstråle som kommer inn mot en prøve kalles en death ray.
Atomene i prøven kan få elektronene til å bremse opp, og deres kinetisk kinetiske e energi blir
redusert. De kan også spres i andre retninger, fremover eller bakover.
• Det kreves ca 1 eV for å slå ut protoner i biologiske prøver, innkommende elektroner med
100eV klarer dette fint.
• Ved innelastisk elektron spredning går noe energi tapt so som m kinetisk energi i
elektronet/molekylet. Dette forsvinner jo selvsagt ikke helt, men blir hovedsakelig brukt til
eksitasjon eller ionisering av atomer i prøven, eller bryte opp kovalente bindinger.
• For ioniserende stråling med høy energi EEk
> 10keV gir det opphav til dose som regnes på to
måter:
o 1 becquerel: Dose gir 1 nuclear desintegration per sek. (1 decay per sek)
o 1 Gray: Absorbert dose på 0,01J/kg
• Absorbert dose fører til forskjellige sekundære effekter. Dette kan være
følgende:
o Elektron emisjon
o Røntgen tgen emisjon
o Lys emisjon
o Elektrostatisk ladning av prøven
o Deling og oppretting av covalente bindinger
o Sublimasjon (fast -> gass) av materiale fra prøven.
• Sekundære elektroner har energi under 50eV, og kommer derfor gjerne fra de ytterste 10nm
i prøven. Grunnet nnet lav energi blir de lett påvirket av elektrostatiske og magnetiske krefter.
• Tilbakespredte elektroner (backscattered
(backscattered) ) er både elastisk og innelastisk tilbakespredte
elektroner med kinetisk energi EEk
> 50eV. Disse kommer av elektroner som passerer
elektronskyen, tronskyen, og får banen endret pga Coulomb interaksjon med kjernen. Jo nærmere
kjernen, jo mer påvirket.
• Auger elektroner: En prosess hvor emisjon av et elektron fører til at et annet blir emittert
også. Et elektron langt inne som blir slått ut blir erstat erstattet tet av et elektron fra lengere ute som
fyller tomrommet. Dette frigjør energi, som kan
overføres til et annet elektron som da blir frigitt.
• Røntgen emisjon: Elektroner med EEk
over 10keV fører
til røntgenstråling. Emisjonsspekteret består av
bremsstrahlung med karakteristiske linjer.
�
�2�� �

39
o Bremsstrahlung kommer fra at elektronene (ladde partikler) endrer retning.
(akselerasjon av ladde partikler sender ut EM-bølger). Disse røntgenstrålene kan ikke
brukes i elektronmikroskop, gir kun helserisiko.
o Karakteristiske linjer kommer fra elektroner som overfører energien sin til
elektroner i orbitaler langt inne. Etter Pauliprinsippet må de fylle ledige tilstander
langt ute, med lite energi bundet. Energien til karakteristiske x-rays kan da skrives:
� =
ℎ�
� �� − � �
Hvor Eii er energi i ytre orbital.
o Kun utvalgte hopp er lov, etter utvalgsreglene
∆� = ±1; ∆� = 0, ±1;
• Katode luminescens: Primærelektroner som slår ut løst bunnede elektroner i orbitaler langt
ute er assosiert med emisjon av lys når orbitalen fylles igjen. Dette gir bakgrunn for
fluorescens i skjermen ved EM.
• Absorpsjon av elektroner i prøven: kan skje, kan skje. De har da gitt fra seg så mye kinetisk
energi til røntgen eller andre elektroner, men også til termisk energi. Dette kan føre til
vesentlig oppvarming.
• Skade på prøven: Elektronstrålen kan bryte kovalente bindinger -> frie radikale -> nye
bindinger. Atomer med lavt atomnr er også utsatt for sublimasjon, slik at det er et massetap.
Dette kan reduseres ved kryogenteknologi.
16 Elektronmikroskopi
• Viktige oppdagelser: de Broglie bølgelengde λ = h/p = h/mv, og at elektromagnetiske felt kan
fokusere elektronbeams.
• Oppløsning gitt Rayleigh kriteriet (det med airy disk). NA er kun avhengig maksimum vinkel
inn på elektronene, ettersom n = 1 i vakuum. Bølgelengden er gitt av de Broglie:
�� = � ∙ � = 1
2 ��� → λ = h ℎ
=
p �� =
ℎ ℎ
=
�2���� �2���� • Typisk akselerasjonsspenning U er 60kV. Dette gir teoretisk oppløsning på 0,25nm.
• EM kraver vakuum for å ikke påvirke elektronstrålen. Dette umuliggjør bruk av levende
prøver.
• TEM og SEM ble oppfunnet omtrent samtidig.
• Transmisjons elektron mikroskop (TEM):
o Tilsvarende lysmikroskop, elektronstrøm konvergeres på prøven med condenser
linser (elektromagnetiske solenoider), for å så fokuseres på bildeplanet igjennom
objektiv og projektsjonslinser.
o 2D bilde på fluorescent skjerm eller kamera. Brightness proporsjonal med elektroner
som når punktet. Elektroner gir fluorescens og lyser opp.
o Atomer med høyt atomnr øker spredningen og dermed kontrast.
o Typisk oppløsning 1-2Å.

• Scanning electron microscope (SEM):
o 2-3nm spot som skannes over overflaten på prøven. Trenger ikke tynn slice.
o Sekundære elektroner sendes ut fra overflaten grunnet eksitasjon av
primærelektronstrålen.
o Bildet dannes over tid, med en oppløsning 0,1x TEM, typisk 1-2nm.
• Scanning transmission electron microscope (STEM):
o Lineærkombinasjon med superposisjon av TEM og SEM. (haha).
o Kan gi analytiske signaler, som røntgen-fluorescence spektroskopi og electron energy
loss spectroskopi, med oppløsning ned til 1Å.
Elektromagnetiske linser og elektronoptikk
• Elektroner er så lette at de blir stoppet raskt av luftmolekyler.
• Elektriske og magnetiske felt påvirker elektronene slik at brytningsindeksen endres gradvis.
Elektromagnetiske linser
• Retning og kraft elektroner blir påvirket av en linse er gitt av Lorentz force:
• Jeg kjenner en som heter Lorentz
40
�� = �(�� × ���)
• F får elektronene til å begynne å gå i sirkel, dette gir de en spiral (helical) bane.
• Etter linsen vil elektronene fra punkt A i prøven fokuseres på A’. Dette angir fokallengden til
linsen. Fokallengden kan endres ved å endre DC strøm. Dæven jeg vil ha en slik linse til
kameraet mitt :P Fokallengden er gitt:
� = � �
� �
k er en konstant på geometri og antall vindinger i spolen, V er akselerasjonsspenning og I står
for Industrielle India.
• Alle EM-linser er konvergerende.

• Elektrostatiske linser har i motsetning til elektromagnetiske linser ikke noe magnetfelt.
Guess what? De får ikke elektronene til å begynne å gå i spiraler! Består av sylindere med
forskjellig spenning, og et mellomrom i mellom. Fokallengden endres av spenninger.
Elektrostatiske linser kan være både konvergerende og divergerende.
• Andre typer elektrostatiske linser er Einzel linse, aperture linse og quadropole linse.
Linse aberrasjoner
• Kromatisk aberrasjon: Som i lysmikroskopi, forskjellige bølgelengde -> forskjellig fokus. Kan
rettes med enten elektrostatisk divergerende linse, eller aller helst:
o Single energi kilde (stabil akselerasjonsspennig)
o Komplett vakuum. (kræsj med partikler vil redusere energien, og gi flere energier)
o Aperture rett etter prøven hjelper også, da effekten er mest synlig langs kantene.
• Spherical aberrasjoner: Samme som i LM; fokallengden endres med avstand til den optiske
aksen. Dette suger så klart. Er selvsagt verst i kantene, så en liten aperture fjerner mye.
• Liten aperture fjerner mye aberrasjoner, men reduserer også NA og dermed maks
oppløsning.
• Astigmatisme: Ikke helt symmetriske magnetfelt. Fikses med stigmator, en ring som drar og
dytter på elektronene for å sørge for perfekt sirkulær fokus.
• Diffraksjon: Skjer rundt kantene på en liten aperture, og reduserer oppløsning. (liten
aperture: fjerner aberrasjoner, innfører diffraksjon. )
Design av TEM
41

• Electron gun: Kilde til elektroner. Finnes i tre typer:
o Tungsten katode: Mest vanlige elektronkilde i
EM. Et V-formet filament som varmes opp
ved at det går en strøm igjennom det. En
viktig del er en Wehnelt sylinder som kan
reguleres med negativ spenning fra 0-500V
relativt til katoden. Dette regulerer to
aspekter; intensitet og intensitetsfordeling
(konvergering mot optiske aksen). Et evig
problem av stor praktisk betydning.
Gjennomsnittelig Ek ut fra elementet er
0,25eV, men varierer fra 0-2eV. Dette avgjør
hvor monokromatisk den kan bli. Ved 2700 o K
Current density: � � = 1,75 �/�� �
42
o Latanum hexaboride cathode: 10-50 ganger
høyere effekt enn tungsten, og mye lengere
levetid. Krever bedre vakuum-> høyere
kostnad. 1600-1700 o K � � = 65 − 100 �/�� �
o Felt emisjons katode: Ved høyt nok elektrisk
felt kan elektroner sendes ut ved
romtemperatur. � � = 10 � �/�� � . I tillegg er området elektronene sendes ut fra
veldig lite, som er bra. Krever sykt bra vakuum, og ustabilitet i dette fører til
ustabilitet i kilden.
• Kondensator linse: Skal belyse prøven jevnt med tilstrekelig intensitet.
o Moderne TEM bruker to kondensatorlinser, dette er for å kontrollere nøyaktig
mengden elektroner som treffer prøven. Målet er at kun området som blir observert
blir belyst med akkurat den intensiteten som er nødvendig, for å skåne resten av
prøven. Større og mindre spots brukes til hhv mindre og mer forstørning.
• Objektiv linse: Viktigste linsen i TEM. Veldig kort fokallengde for å oppnå høy oppløsning. Må
ikke ha astigmatisme og lite aberrasjoner.
o Objektiv aperture: Aperture i objektivlinsa. Fjerner perifere elektroner for å bedre
kontrast. Kontrollerer også dubdeskarphet.
• Intermediate lens: Linse mellom objektiv og prosjektor linse. Hjelper til i forstørringen fra
objektivet.
• Projector lens: Vanlig med to. Trenger svært stor dybdeskarphet, da film og skjerm kan være
langt ifra hverandre (meter).
• Anticontaminator: En metalloverflate rett under eller over prøven for å unngå forurensning i
form av kondensering. Denne kjøles ned med flytende nitrogen, og fører da til at
forurensning kondenserer på den.
• Prøveholder: Prøve monteres på et kobbernettverk. Dette settes i en prøveholder, går
igjennom vakuumkammer inn til ”the stage” av mikroskopet. The specimen stage kan
forflyttes i x og y retning, eller tiltes. Finnes i både toppmontert og sidemontert utgave, hvor
sidemontert er mest vanlig fordi de er enkle. Elektronstrømmen ved prøven (dose) kan
beregnes ved en prøveholder med et Faradaybur.

• Avbildning: Enten fosforescent zink aktivert cadmium sulfide pulver på en plate. Denne kan
studeres direkte med øyet eller igjennom mikroskop. Alternativt kan CCD benyttes, men
10x7cm film er visst bedre..
• Vakuum system: viktig av flere grunner
o Øke mean path length for elektroner
o Forhindre high-voltage breakdown mellom anode-filament
o Beskytte filament mot oksidasjon
o Fjerne forurensende gasser (sublimasjon fra høy-energi bombardering. Frie radikaler
som fucker opp)
TEM operasjonsmodus
Ved oppsett av TEM må en velge mellom flere modes. Et konstant problem med biologiske prøver er
lav kontrast. Dette kan trikses med!
• Høy kontrast mode: Gir høy kontrast på bekostning av oppløsning, normalt maks
50000x.Dette oppnås ved:
o Øke fokallengden på objektivlinsen. Bakside:Gir mindre aperturevinkel, mer
aberrasjoner og tap av oppløsning.
o Redusere akselerasjonsspenning: Flere elektroner stopper i prøven – mer kontrast.
Gir elektroner med mange energier -> chromatisk aberrasjon, lavere energi = lengere
bølgelengde = lavere oppløsning, mer varme i prøven.
o Mindre objektivaperture: Reduserer chromatisk og spherisk aberasjon, -> bedre
kontrast.
o Etterbehandling.
• Høy oppløsnings mode: Motsatt som over, mangler kontrast og riktig preparasjon er viktig.
• Darkfield (mørkefelt): Samme prinsipp som i LM. Kan flytte aperturen ut, men det suger.
Bedre å belyse prøven fra en vinkel, se side 316.
• Diffraksjon kan gi informasjon om komposisjonen av ukjente krystaller.
SEM design
Oppløsningen i SEM er selvsagt gitt Rayleigh kriteriet, og avhenger av størrelsen på elektronstrålen
der den treffer prøven. Siste kondensatorlinse er brukt til å matche størrelsen på strålen med
forstørrelsen, M.
43

• Elektronkanon som i TEM, akselereres mot anode. Opprinnelig 50 50µm m i diameter, må ned mot
1-2nm spot.
• Kondensatorlinse 1 og 2: Jo mer strøm i en kondensatorlinse, jo mer forkortes fokallengden,
og jo mer forstørres det. Dette går på bekostning av tap av elektroner, som ikke når neste
kondenser. De har også aperturer for å begrense strålestørrelsen og redusere aberrasjoner.
• Kondensatorlinse; 3 teh final lens lens: Kalles ofte feil for objektivlinse. Sterkeste i SEM (høyest
strøm), og siste demagnetifiseringen og fintuning av elektronstrålen. Har to sett deflection
coils for å skanne strålen over prøven i x og y retning. Forstørrelsen gis som M = lengde på
skjermen/lengde skannet. kannet.
• Prøve: må monters på et ledende materiale for å forhindre opphopning av høy høy-spennings
ladninger. Må være mulig å orientere prøven i x,y og z retning, sammen med mulighet for å
tilte den for å øke bestrålingen.
• Sekundær elektrondetektor: Hoveddetektor tor i SEM, fanger opp sekundære elektroner
emittert fra ytre lag i prøven. Dette gir en topografisk kontrast, og et tilsynelatende 3D 3D-bilde.
o Sekundære elektroner med lav energi forlater prøven i mange retninger. De blir
tiltrukket mot et faradaybur som er svakt positivt (0 - 300V) ettersom de er negative.
Her blir de mye kraftigere trukket inn mot en aluminiumsfolie ved 12000V.
Elektronene skyter tvers igjennom denne, treffer et fluorescerende lag -> PMT ->
data.
• Tilbakespredte elektroner elektroner(backscattered): Elektroner ektroner med høy energi, kan komme fra langt
inne i prøven.
o Fører til støy, da de kan generere sekundære elektroner i prøven eller i kammeret.
o De fleste har for stor energi til å bli oppdaget av sekundær sekundær-elektron elektron-detektoren, men
de som gjør gir et sterkt signal i PMT.
44

45
o Høyere atomnr gir flere sekundære elektroner, da de har flere orbitaler og leke med.
-> høy atomnr elementer vil se lysere ut.
o Tilbakespredte elektroner kan oppdages med egen detektor. To typer:
� Vidvinkel scintillator-PMT: høyt over prøven, større, men lik sekundærelektron-detektoren.
Høy performance, bra SNR og god oppløsning.
� Solid state detector; billig og ganske bra. Mest vanlig, montert rett under
3.kondensatorlinse.
3D SEM bilder
Why is that? Kontrast kommer fra sekundære elektroner i prøven. Mange elektroner gir lyst område.
Tre ting påvirker hvor lyst det blir, og danner ”3D”.
• Orientering av prøvens topografi: Områder som facer mot strålen og PMT blir veldig
lyse. Face mot strålen men ikke PMT blir mellomting. Områder bort fra strålen blir
mørke.
• Vinkelen strålen treffer: Vinkel påvirker hvor langt inn i prøven elektronene trenger,
og dermed sekundære elektroner. Ved 90 o vinkel inn trenger elektronene langt inn,
og mindre emisjon kommer ut. Derimot vil kanter elektronstrålen sneier bli lyse, og
runde objekter får en hvit kant.
• Edge effect: Elektroner kommer ut både foran og bak en tynn kant, -> blir lys.
Operasjons moder SEM
Deles i to;
• Tyngre elementer gir også opphav til kontrast…
• High resolution: Krever liten, koherent elektronspot, med lite aberrasjoner og
god SNR. Dette får en ved:
o Optimere kondensatorlinsene, små aperturer (reduserer aberrasjoner)

46
o Maksimere sekundære elektroner (gir bedre SNR)
o Lave akselerasjonsspenninger. Elektroner som trenger dypt inn øker spot
size.
o Korte arbeidsavstander: minsker spot size og minimerer kromatiske
aberrasjoner.
o Korrekt stigmatisering for å unngå astigatism, drit og tap av oppløsning.
• Stor dybdeskarphet: Bra for prøver med store forskjeller i topografi. Trenger små
aperturer, lange arbeidsdistanser og liten forstørrelse.
SEM + TEM = STEM = SANT
• Skanner en høyintensitetsbeam av elektroner.
• Har en tredje kondensatorlinse som er spesiell for STEM. Den fungerer både som samlelinse
og objektiv.
• STEM har gjerne detektorer for å oppdage backscattering, sekundære elektroner og
røntgenstråling nærme prøven.
X-ray mikroanalyse:
• Primære elektroner som kommer inn gir opphav til både bremsstrahlung og karakteristiske
topper.
• Kan studere både kantitativt mengden av et element og kvalitativt hvilket element som er
hvor.
• Kan bestemme enten energi eller bølgelengde på x-rays. Bølgelengde reflekteres av
krummede flater, og bølgelengden bestemmer hvor mye den blir brutt.
� = ℎ�
�
• Bestemme energien med Li-dopede Si-detectorer er halvledervitenskap, det er ikke noe for
en biofysikker. S327.
• Prøven kan prepareres som vanlig, eventuelt bruke noe for kontrast enhacement.
Electron energy loss spectroscopy (EELS)
• Ser på energi til inelsatisk spredte elektroner i retningen fremover. STEM er bedre en TEM
pga høyere oppløsning.
• Trenger en detektor i bunn av kolonnen, gjerne PMT type tilsvarende den som brukes for
sekundære elektroner i SEM.
• For 100keV primærelektroner gir det typisk et tap på 100-1000eV, med en oppløsning på
1eV.
• Har god oppløsning
• Fungerer bra på lette elementer, røntgen mikroanalyse er best på elementer over Na.
Sammen er de gull.
17 Preparasjon av biologiske prøver for EM
• Prøven må være så mekanisk stabil at den ikke går til gokk når den utsettes for vakuum.
• Mest kritisk er vann; veske-gass fase vil ”eksplodere” enkelte områder og gi stygge artifacts.

• Prøven må motstå stråling fra elektroner. 100keV elektroner utgjør stor fare for å ødelegge
prøven, kan gi tap av opp til 50% av massen og fragmentere prøven.
• Trenger også kontrastmiddel (tunge atomer) for TEM/STEM.
• Fiksering (Fixation) er første steg i preparasjonen, her brukes enten glutaraldehyde eller
frysefiksering.
Frysefiksering
• Må skje veldig fort (10 3 -10 6 K/s) til -196 o for å unngå krystallvekst. Dette vil nemlig ødelegge
prøven.
• Vitrification er en prosess hvor veske omdannes til glasstilstnad ved rask nok nedkjøling;
dette er ideelt.
• Generelt er frysefiksering vanskelig for prøver over 1mm.
• Fire metoder:
o ”plunge-freezing”: dyppe prøven i flytende nitrogen som er i fast-veske overgangen.
Lettest, men dårligst.
o ”Rod-freezing”: Settes i kontakt med metall som er sykt kaldt.
o ”jet-freezing”: En jet av flytende propan (-180 o )
o ”High pressure freezing”: jet av flytende nitrogen. Dette er best, og klarer 2-3mm,
men selvsagt dyrt.
Preparasjoner TEM
• Prøven ligger på et metallgrid, gjerne Kobber. Tilsvarende glassplate i LM.
• Mange typer hull, ønsker så store som mulig for å se mest mulig. Dette gir redusert styrke,
termisk- og elektrisk ledningsevne.
• En kan legge på en film som verken absorberer eller sprer elektroner nevneverdig, som
hjelper å holde ptøven. Vanlig er en karbonfilm, eller polymerer.
• Kontrast kan legges til på to måter:
o Positiv staining: Et tungt metall som binder seg til spesifikke steder legges på, og
overskuddet vaskes vekk.
� Osmium tetraoksid [OsO4]: Mest vanlig, binder seg kovalent til umettet fett
og proteiner.
� KMnO4: Bra til cellemembraner, brukes til fiksering også.
� Bly nitrat [Pb(NO3)2]: Nukleinsyrer, spesielt RNA.
� Uranylacetat: Bra på DNA
� + flere for karbohydrater, spesifikke proteiner, virus etc.
o Negativ staining: skylles med løsning av tinge metallioner, og lar det tørke. Områder
det ikke bindes blir da lyse. Veldig praktisk for å studere virus og store
makromolekyler.
• Tynne preparater er veldig viktig. Prøven støpes inn i en to-komponent resin (Araltide, epoxy,
Methacrylate), så kuttet med microtome, med glass eller diamantkniv. Tykkelsen bør være
30-50nm, og kan bestemmes av interferensfargen når den flyter på vann.
Shadowing
• En av de første preparasjonsmetodene av biologiske prøver, gir god amplitudekontrast.
• Sender tunge metallatomer inn mot prøven fra en vinkel, som legger seg på overflaten.
47

• Atomene kommer fra sublimasjon i metallet som varmes opp. I vakuum farer da atomene i
en rett linje mot prøven.
• To måter å varme et metall til å sende ut atomer
o Resistance heating: Dårlig metode, vanskelig å få jevne resultater. Sender strøm
igjennom en karbontråd dekket med det tunge metallet. På et punkt er tråden
tynnere, der vil den bli varmest og sende ut atomer fra tungmetallaget rundt.
o Electron current heating: En elektronstråle fra en elektronkanon (strøm i tungsten
filament + 2kV til anode) varmer metallet der de treffer i anoden. Herifra sendes det
ut atomer. Plater bøyer av ladde elektroner slik at de ikke treffer prøven. Dette er en
stabil metode.
• Med elektronstrøm oppvarming kan tykkelsen av metallaget på prøven bestemmes ved
quartz thin film monitor.
• I en quartz thin film monitor er en kvartskrystall plassert tett inntil prøven. Denne oscillerer
med en frekvens avhengig av massen til krystallen. Ettersom den får et belegg av atomer
endres frekvensen -> kan bestemme tykkelse ned mot 1,5nm med denne metoden.
• Oppløsningen med en slik metallfilm er avhengig av tykkelsen på laget. 1nm Pt-film gir 3-4nm
i maks oppløsning. Metallaget fester seg gjerne i en kornstruktur. Størrelsen på disse kornene
kan reduseres hvis prøven er kald. Høyere smeltetemperatur til metallet gir også typisk
mindre kornstørrelse.
• Det er vanlig å legge på en karbonfilm på toppen for mekanisk support. Typisk 8-10nm. Kan
”vaske bort” prøven, og sitter igjen med en kopi.
Freeze fracturing, freeze etching, freeze fracture replication
• Veldig godt egnet for å studere membrane, og spesielt innermembran i bilayer. Gir 3D
struktur. En studerer kun en kopi av platinum og karbon i TEM.
48

• Frysefikser -> del i seksjon -> replika i Platinum-karbon -> vask vekk biologiske rester -> tørk -
> TEM. Topologisk bilde
• Viktig med bra frysefiksering. Krystaller suxx!
• To ting kan gjøres for å unngå krystaller
o Kjemisk forandring: Glycerol og sukrose brukes ofte som cryo-protectants.
o Frys raskt nok. Avhengig av varmekapasitet, termisk ledningsevne og spelteentalpi i
prøven.
• Fryse etsing: Ved trykk på 10 -6 torr, og -100 o C vil is sublimere fra overflaten ved en rate på
20-30nm/min. Makromolekyl vil ikke forsvinne.
• Fryst vann vil holde fast på den hydrofile delen av membran bilayer, så den vil lett deles midt
i bilayeret.
Preparasjon for SEM
• Gjøres ved kjemisk fiksering + ”critical point drying ”eller frysefiksering påfulgt frysetørking.
• Dehydrerte biologiske prøver er dårlige elektriske ledere, og opphoping av elektroner i
overflaten er et problem for sekundære elektroner. Vanlig å legge på et ledende metallag.
• Tørking av prøven kan ikke gjøres med luft, det ødelegger den. Frysetørking minner om
fryseetsing. Frys -> lavt trykk + temp = sublimasjon.
• Critical point drying: Lang prosess, bytter ut vann med CO2. Må være fiksert først med
Osmimum tetraoksid eller glytaraldehyde. Bytter vann med etanol, bytt vann med aceton,
bytt aceton med CO2.
• Antistatisk film: Viktig for å ikke få opphopning av elektroner. Roterer prøven for å legge på
likt, gjøres ved termisk oppvarming av metall. Vanlig med gull, carbon, platinum eller
palladium. Lag på 5nm påvirker ikke strukturer i prøven.
49

Microarray Techniques Ch 10 i Introduction to Biophotonics
• Metode for å raskt analysere store mengder prøve.
• Viktig for strukturbiologi, molekylær profilering av sykdommer, og utvikle medisiner.
• Består av et mikroarray med biosensing capture agents, som raskt kjenner igjen og bindinger
DNA, proteiner, celler og vevsstykker.
• Kan analysere tusenvis av DNA og RNA samtidig, med høy presisjon og sensitivitet. Gjøres
ved to prosesser:
o Phenotyping: Identifisere celler med spesielle markører. Immunophenotyping:
bruker antistoffer, (kjenner igjen antogener; skadelige fremmedstoffer).
o Genotyping: Binder ved genetisk match.
• Har fått veldig stor oppmerksomhet og i rask vekst. Muligheten til å oppdage og spore
titusener av gener med DNA microarray har revolusjonert genforskning, og gir store håp for
individuell skreddersydd behandling.
• Genomet til mange organismer har nå blitt fullstendig sekvensert.
• Gener ender jo opp som proteiner, og fokus har blitt flyttet til å analysere disse med sin
biologiske kompleksibilitet. -> Proteomics.
DNA Microarrays
• 50-150µm spots på en glassplate. På disse plassene er det plassert fluorescensmerkede
enkelttråds m-RNA eller c-DNA (complimentary DNA), med en 20-1000+ baser.
• c-DNA er laget av m-RNA ved reverse transkripsjon.
• På platen hybridiserer disse med immobiliserte DNA-fragmenter.
• Platen skannes med høyhastighets fluorescensdetektorer. (Laser/confocal)
• Printe microarrayet:
o Glassplaten coates med polylysine for å binde til glasset.
o Et lite volum cDNA tilføres platen enten med fysisk kontakt, eller sprøytes på som i
en blekkprinter.
• Fremganger går:
o Isolere ønsket mRNA,
o Konvertere mRNA til cDNA ved revers
transkripsjon (motsatt av mRNA fra
DNA). cDNA er mer stabilt enn mRNA.
o Merke cDNA med fluorescens; Rød
(Cy5) og kontroll (referanse) grønn
(Cy3) markører.
o Hybridisere med DNA
o Vaske bort uhybridisert materiale
o Skanne mikroarray
o Analysere, WTF er dette.
50

• Siden test og referanse cDNA er merket med to forskjellige fluorescens får en ut et forhold.
Ser på log(Cy5/Cy3) ratio.
• Bare se denne videoen: http://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM
• Et alternativ til spotted arrays har en oligonucleotid arrays. Disse kan ha 65000-400000
sekvenser av olikonukleotider, med en lengde på 25 nukleotider. Disse er laget med
fotolitografiske metoder; på samme måte som halvledere brukes en maske og UV-lys til å
stegvis syntetisere oligonukleotider med en bestemt sekvens. Fordelen er at disse er veldig
uniforme, men kan bare ha en fluorescens per gang. To chips må brukes til sample og
kontroll.
Protein microarrays
• Består av en glassplate med tusenvis av proteinprober. En biologisk prøve spres utover
chippen, og binding til prober registreres. Dette kan være optiske metoder, som flourescens
(mest vanlig) eller surface plasmon resonances (endring av EM-bølge i overgangen luftmetall,
lett påvirkelig).
• Vesentlige forskjeller og utfordringer sammenliknet med DNA microarray:
o Mens DNA har en stabil primærstruktur som binder godt er funksjonen til proteiner
avhengig av 3D struktur. 3D struktur er svært sensitiv, og denaturering ødelegger.
o Binding av cDNA eller mRNA til sin komplimentære part er svært spesifikk, proteiner
trenger mange immobiliserte antistoffer, lite spesifikke.
o Glykolyserte antistoffer har store overflateareal -> kryssbinding mellom proteiner
• Major challenges (Mithcell, 2002):
o Overflatekjemi for å binde immobiliserte proteiner med aktiv sekundær og tertiær
struktur.
o Identifisering og isolering av antistoff for proteinet av interesse.
o Verktøy til å måle proteinbinding
o Mulighet til å hente ut bundet protein for videre analyse.
o Dynamisk omfang til å oppdage konsentrasjoner av proteiner
• Som DNA microarray: Protein mikroarray lages på glass eller silikon. Dette har blitt behandlet
med et stoff (gjerne aldehyde) for å immobilisere ”det som skal binde proteinet, gjerne
antistoff (eller protein)”.
• Aldehyd på glasset binder en aminogruppe på et antistoff (eller protein). En Schiff base
binding immobiliserer antistoffet.
• Ureagert aldehyd må så fjernes med bovine serum albumin (BSA), før chippen kan brukes.
• Finnes også mange andre måter å lage protein microarrays.
Celle microarray
• Brukes på levende celler
• Fester en DNA-gelatinløsning på glassplate
• Legger på en coating av cation lipid, slik at det dannes DNA-lipid
• Ned i løsning med levende celler
• Cellene tar nå opp DNA, og lager cDNA i alle posisjonene i mikroarrayet.
• Cellene deler seg to-tre ganger, og det blir clustere med celler med ønsket DNA.
51

Tissue microarray
• Vevsprøver blir tatt, 0,6mm i diameter og 3-4mm lange. Disse blir satt inn i en blokk av et
array.
• Tynne slicer 5-8um kuttes ut av denne med en microtome, og lagt på en glassplate.
• En kan nå studere cellene, hvor alle har like betingelser.
• Negativt er at prøven ikke trenger å være representativ for tumoren, men at det brukes lite
er bra.
52

En kan nå studere spesifikke proteiner (antistoffer, markører) på overflaten av tumorceller.
Bruk av microarrays
• Identifisere molekulære signaturer til kreft og andre sykdommer.
• Kan raskt markere på signaturgener for sykdommer.
• DNA microanalyse kan bli nyttig til å gi spesifikk medisin mot kreft.
• Identifisere komplekse biokjemiske pathways, og hvordan endringer skjer på signalmolekyler
• Forstå hvordan forskjeller i molekylær sammensetning i hjernen spiller noen rolle på
funksjon.
• Studere korrelasjon mellom respons på medisin og genom.
• Se på endringer i genmanipulert mat.
54