KORRIGERT UTGAVE / CORRECTED VERSION - Patentstyret

NO/EP 2276756
112
5
10
15
20
Bindingsanalyse: Forbindelser blir også analysert ved β1 og β2-reseptorene for å
bestemme selektivitet. Alle bindingsanalyser blir kjørt ved bruk av membraner
fremstilt fra CHO-celler som rekombinant uttrykker β1 eller β2-reseptorer. Celler blir
dyrket i 3-4 dager etter splitting; de bundne cellene blir vasket med PBS og deretter
lysert i 1 mM Tris, pH 7,2 i 10 min på is. Kolbene blir skrapet for å fjerne celler og
cellene blir deretter homogenisert ved bruk av en Teflon/glass homogenisator.
Membraner blir oppsamlet ved sentrifugering ved 38,000 x g i 15 min ved 4°C. De
pelleterte membranene blir resuspendert i TME-buffer (50 mM Tris, pH 7,4, 5 mM
MgCl 2 , 2 mM EDTA) ved en konsentrasjon på 1 mg protein/ml. Store batcher av
membraner kan fremstilles, deles opp i aliquoter og lagres ved -70°C i opptil ett år uten
tap av potens. Bindingsanalysen blir utført ved å inkubere sammen membraner (2-5 µg
protein), den radioaktivt merkede indikatoren 125 I-cyanopindolol ( 125 I-CYP, 45pM),
200 µg WGA-PVT SPA kuler (GE Healthcare) og testforbindelsene ved
sluttkonsentrasjoner i området fra 10-10 M til 10-5 M i et endelig volum på 200 µl
TME-buffer inneholdende 0,1% BSA. Analyseplaten blir inkubert i 1 t med risting ved
romtemperatur og deretter plassert i en Perkin Elmer Trilux scintillasjonsteller. Platene
får hvile i Trilux-telleren i ca. 10 t i mørke før telling. Data blir analysert ved bruk av
en standard 4-parameter ikke-linjær regresjonsanalyse ved bruk av enten Graphpad
Prism programvare eller en internt utviklet dataanalysepakke. IC 50 er definert som
konsentrasjonen av forbindelsen i stand til å hemme 50% av bindingen av den
radioaktivt merkede indikatoren ( 125 I-CYP). En forbindelses selektivitet for β3-
reseptoren kan bestemmes ved beregning av forholdet (IC 50 β1 AR, β2 AR)/(EC 50 β3
AR).
25
EKSEMPEL I
2-(2-Amino-1,3-tiazol-4-yl)-N-[4-({(5R)-[(R)-hydroksy(fenyl)metyl]pyrrolidin
metyl)fenyl]acetamid
yl}
30
Trinn A: Tert-butyl (5R)-2-(4-{[(2-amino-1,3-tiazol-4-yl)acetyl]amion}benzyl)-5-[(R)-
{[tert-butyl(dimetyl)silyl]oksy}(fenyl)metyl]pyrrolidin-1-karboksylat