KORRIGERT UTGAVE / CORRECTED VERSION - Patentstyret

NO/EP 2276756
111
residuet renset ved Biotage Horizon MPLC ved bruk av en gradient av 0-40%
etylacetat i heksan hvilket ga produktet (83,9 mg, 64%) som et hvitt skum. LC-MS:
m/z (ES) 483 (MNa) + og 485 (MNa+2) + .
5
Biologiske analyser: De følgende in vitro-analysene er egnet for screening av
forbindelser som har selektiv β3 agonist-aktivitet:
10
15
20
25
30
35
Funksjonell analyse: cAMP-produksjon i respons til ligand blir målt i henhold
til Barton, et al. (1991, Agonist-induced desensitization of D2 dopamine reseptors in
human Y-79 retinoblastoma cells. Mol. Pharmacol. v3229:650-658) modifisert som
følger. cAMP produksjon blir målt ved bruk av en homogen time-resolved
"fluorescence resonance energy transfer" immunanalyse (LANCE, Perkin Elmer) i
henhold til fabrikantens instruksjoner. Ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO-celler),
stabilt transfektert med den klonede β-adrenerge reseptoren (β1, β2 eller β3) blir høstet
etter 3 dagers subkultivering. Høsting av celler blir utført med "Enzyme-free
Dissociation Media" (Specialty Media). Celler blir deretter tellet og resuspendert i
analysebuffer (Hank's Balanced saltoppløsning supplert med 5mM HEPES, 0,1% BSA)
inneholdende en fosfodiesterasehemmer (IBMX, 0,6mM). Reaksjonen startes ved å
blande 6,000 celler i 6 µl med 6 µl Alexa Fluor-merket cAMP antistoff (LANCE kit)
som deretter blir tilsatt til en analysebrønn inneholdende 12 µl forbindelse (fortynnet i
analysebuffer til 2X sluttkonsentrasjon). Reaksjonen foregår i 30 min ved romtemperatur
og avsluttes ved tilsetning av 24 µl deteksjonsbuffer (LANCE kit).
Analyseplaten blir deretter inkubert i 1 t ved romtemperatur og time-resolved
fluorescens målt på en Perkin Elmer Envision avleser eller tilsvarende. Det ukjente
cAMP-nivået blir bestemt ved å sammenligne fluorescensnivåer med en cAMP
standardkurve.
Den ikke-selektive, full agonist β-adrenerge liganden isoproterenol blir anvendt
ved alle tre reseptorer for å bestemme maksimal stimulering. Den human β3-adrenerg
reseptor (AR)-selektive liganden (S)-N-[4-[2-[[2-hydroksy-3-(4-hydroksyfenoksy)-
propyl]amino]etyl]-fenyl]-4-iodobenzensulfonamid blir anvendt som en kontroll i alle
analyser. Isoproterenol blir titrert ved en sluttkonsentrasjon i analysen på 10-10 M til
10-5 og den selektive liganden (S)-N-[4-[2-[[2-hydroksy-3-(4-hydroksyfenoksy)-
propyl]amino]etyl]fenyl]-4-iodbenzensulfonamid blir titrert ved β3-reseptoren ved
konsentrasjon på 10-10 M til 10-5 M. Ukjente ligander blit titrert ved alle 3 β-
adrenerge reseptor subtyper ved en sluttkonsentrasjon i analysen på 10-10 M til 10-5 M
for å bestemme EC 50 . EC 50 er definert som den konsentrasjonen av forbindelse som gir
50% aktivering av dens eget maksimum. Data blir analysert ved bruk av Microsoft
Excel og Graphpad Prism eller et internt utviklet dataanalyse programvarepakke.