KORRIGERT UTGAVE / CORRECTED VERSION - Patentstyret
KORRIGERT UTGAVE / CORRECTED VERSION - Patentstyret
KORRIGERT UTGAVE / CORRECTED VERSION - Patentstyret
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
NO/EP 2276756<br />
111<br />
residuet renset ved Biotage Horizon MPLC ved bruk av en gradient av 0-40%<br />
etylacetat i heksan hvilket ga produktet (83,9 mg, 64%) som et hvitt skum. LC-MS:<br />
m/z (ES) 483 (MNa) + og 485 (MNa+2) + .<br />
5<br />
Biologiske analyser: De følgende in vitro-analysene er egnet for screening av<br />
forbindelser som har selektiv β3 agonist-aktivitet:<br />
10<br />
15<br />
20<br />
25<br />
30<br />
35<br />
Funksjonell analyse: cAMP-produksjon i respons til ligand blir målt i henhold<br />
til Barton, et al. (1991, Agonist-induced desensitization of D2 dopamine reseptors in<br />
human Y-79 retinoblastoma cells. Mol. Pharmacol. v3229:650-658) modifisert som<br />
følger. cAMP produksjon blir målt ved bruk av en homogen time-resolved<br />
"fluorescence resonance energy transfer" immunanalyse (LANCE, Perkin Elmer) i<br />
henhold til fabrikantens instruksjoner. Ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO-celler),<br />
stabilt transfektert med den klonede β-adrenerge reseptoren (β1, β2 eller β3) blir høstet<br />
etter 3 dagers subkultivering. Høsting av celler blir utført med "Enzyme-free<br />
Dissociation Media" (Specialty Media). Celler blir deretter tellet og resuspendert i<br />
analysebuffer (Hank's Balanced saltoppløsning supplert med 5mM HEPES, 0,1% BSA)<br />
inneholdende en fosfodiesterasehemmer (IBMX, 0,6mM). Reaksjonen startes ved å<br />
blande 6,000 celler i 6 µl med 6 µl Alexa Fluor-merket cAMP antistoff (LANCE kit)<br />
som deretter blir tilsatt til en analysebrønn inneholdende 12 µl forbindelse (fortynnet i<br />
analysebuffer til 2X sluttkonsentrasjon). Reaksjonen foregår i 30 min ved romtemperatur<br />
og avsluttes ved tilsetning av 24 µl deteksjonsbuffer (LANCE kit).<br />
Analyseplaten blir deretter inkubert i 1 t ved romtemperatur og time-resolved<br />
fluorescens målt på en Perkin Elmer Envision avleser eller tilsvarende. Det ukjente<br />
cAMP-nivået blir bestemt ved å sammenligne fluorescensnivåer med en cAMP<br />
standardkurve.<br />
Den ikke-selektive, full agonist β-adrenerge liganden isoproterenol blir anvendt<br />
ved alle tre reseptorer for å bestemme maksimal stimulering. Den human β3-adrenerg<br />
reseptor (AR)-selektive liganden (S)-N-[4-[2-[[2-hydroksy-3-(4-hydroksyfenoksy)-<br />
propyl]amino]etyl]-fenyl]-4-iodobenzensulfonamid blir anvendt som en kontroll i alle<br />
analyser. Isoproterenol blir titrert ved en sluttkonsentrasjon i analysen på 10-10 M til<br />
10-5 og den selektive liganden (S)-N-[4-[2-[[2-hydroksy-3-(4-hydroksyfenoksy)-<br />
propyl]amino]etyl]fenyl]-4-iodbenzensulfonamid blir titrert ved β3-reseptoren ved<br />
konsentrasjon på 10-10 M til 10-5 M. Ukjente ligander blit titrert ved alle 3 β-<br />
adrenerge reseptor subtyper ved en sluttkonsentrasjon i analysen på 10-10 M til 10-5 M<br />
for å bestemme EC 50 . EC 50 er definert som den konsentrasjonen av forbindelse som gir<br />
50% aktivering av dens eget maksimum. Data blir analysert ved bruk av Microsoft<br />
Excel og Graphpad Prism eller et internt utviklet dataanalyse programvarepakke.